蛋白纯化策略

Net charge IEX
Tag/ PTM AC
Hydrophobicity Size/globular volume HIC
GF
8
Collect information: starting material
Location in cell
Actions
Cytoplasm
Cell disruption, clarification
Planning purification 规划纯化
Define objectives 设定目标 Collect information 收集信息
target protein 目标蛋白 starting material 起始物料 Select analytical techniques 选择分析技术
5
6
杂质是什么?
通常,
使目标蛋白降解或失活的蛋白酶 在后续分析和应用中的干扰组分
对于结构研究,
聚集体和结构aggregates and structural heterogeneity
对于治疗用蛋白,
内毒素，基因组DNA和病毒颗粒
宁愿纯化过高“over-purify”， 也不纯度不够 “under-purify” ！
Membranes
Membranes preparation and solubilization of membrane proteins
9
Select analytical techniques
Characteristics/properties Size, purity check Identity, proteolytic cleavage Aggregation, heterogeneity Stability: pH, ionic strengths Concentration
3
4
设定目标：需要的蛋白量
质谱
功能 研究
用于免疫的 抗原
结构 研究
治疗用 蛋白
pg
ng
µg
mg
g kg
设定目标：需要的纯度
质谱
用于免疫的 抗原
功能 研究
结构 研究
治疗用 蛋白
中 > 80%
高 >95-99%
非常高 >99%
5
6
Strategies for protein purification
Net charge
Hydrophobic interaction chromatographhy (HIC) 疏水相互作用
Gel filtration (GF) 凝胶过滤
2
Content 内容
Planning purification 规划纯化 Strategies 策略 Examples 举例 Summary 总结
10 000 g离心 10-15 min 使用有机溶剂提取
13
纯度
三步纯化策略: CiPP
2. Intermediate 中度纯化
1. Capture 捕获
3.Polishing 精细纯化
mAu 150
100
50
0
0
20
40
60
80
100 120
ml
样品制备
纯化步骤数
14
纯度
三步纯化策略
2. 中度纯化
Workflow in protein purification
Natural source
Expression
Recombinant source
2 HN
COOH
Host Cell
2 HN
COOH
Sample preparation
Chromatographic purification
Storage
Degrades target molecules
(Phosphatases)
Nucleic acids High viscosity
(NA)
May block resins
Lipids
May block resins May cause aggregation
Filter or centrifuge
收集信息：目标蛋白质
从氨基酸序列 分子量 280 nm的理论消光系数 等电点 (pI)
查文献
7
Net charge IEX
Tag/ PTM AC
Hydrophobicity Size/globular volume HIC
GF
8
收集信息：起始物料
细胞定位
细胞质 周质 包涵体 分泌到培养基 膜
方法
细胞破碎，澄清 渗透压休克或冻融法 离心、包涵体溶解、包涵体复性 浓缩 (因为体积大) 和澄清 制备膜并溶解膜蛋白
Specificity Tag/ PTM
Ion exchange chromatography (IEX) Affinity chromatography (AC)
Hydro -phobicity
Size/globular volume
Hydrophobic interaction chromatographhy (HIC)
3
4
Define objectives: Protein amount required
Define objectives: Purity requirement
Mass
Functional Antigen for Structural Therapeutic
spectroscopy studies immunization studies
选择分析方法
特性/性质 大小, 检测纯度 鉴定, 蛋白酶解 聚集体，不均一性 稳定性：: pH, 离子强度 浓度
活性/功能
技术 SDS-PAGE, 分析型 GF Western blotting, MS GF, IEF 生物活性 消光系数 比色法定量蛋白
酶反应，其它技术
9
10
纯化策略
蛋白纯化流程 样品制备 三步纯化策略 纯化技术的结合
7
Collect information: target protein
From amino acid sequence Molecular weight Theoretical extinction coefficient at 280 nm Isoelectric point (pI)
Literature search
3. Polishing
mAu
150
100
50
0
0
20
40
60
80
100 120
ml
Remove trace impurities
May use organic solvent extraction
13
Three stage strategy: CiPP
2. Intermediate 1. Capture
3. Polishing
mAu
150
100
50
0
0
20
40
60
80
100 120
ml
Purity
Sample preparation
Add inhibitors Remove by AC Rapidly perform first purification step Work at low temperatures Select protease deficient E. coli strains Add nucleases Precipitation by streptomycin sulfate, polyethyleneimine, protamine sulfate Centrifuge 10-15 min 10 000 g
proteins
pg
ng
µg
mg
g kg
Mass
Antigen for Functional Structural Therapeutic
spectroscopy immunization studies studies
proteins
Moderate > 80%
High >95-99%
Extremely high >99%
Gel filtration (GF)
2
Content
Planning purification Strategies Examples Summary
Planning purification
Define objectives Collect information
target protein starting material Select analytical techniques
150
100
50
0
0
20
40
60
80
100 120
ml
去除痕 杂质
16
纯度
颗粒大小和分辨率
三步纯化策略
30 µm
SOURCE™ Q XK
34 µm 16 x 50 mm
15 µm
RESOURCE Q™ 1 ml
10 µm
Mono Q™ 5/50 GL
90 µm
Q Sepharose™ HP 16 x 50 mm
1. 捕获
去除大量杂质
样品制备
分离产品 浓缩 稳定
纯化步骤数
3. 精细纯化
mAu
150
100
50
0
0
20
40
60
80
100 120
ml
去除痕量 杂质
15
纯度
三步纯化策略
速度 载量 1. 捕获
分辨率 载量 2. 中度纯化
去除大量杂质
样品制备
分离产品 浓缩 稳定
纯化步骤数
分辨率 回收率
3. 精细纯化
mAu
Q Sepharose™ FF 16 x50 mm
样品制备
纯化步骤数
17
分辨率
速度
载量 回收率
18
Sample preparation
Contaminant Harmful effect
Preventive action
Particulate matter
Proteases
Clogs column
For structural studies,
aggregates and structural heterogeneity
For therapeutic proteins,
endotoxins, genomic DNA and virus particles
It is better to “over-purify” than to “under-purify”
Techniques SDS-PAGE, analytical GF Western blotting, MS GF, IEF Biological activity Extinction coefficient, Colorimetric protein assay
Activity/function
Enzyme assay, various techniques
10
Purification strategies
Workflow in protein purification Sample preparation Three stage strategy Linking chromatographic techniques
蛋白纯化的流程
天然 来源
重组 来源
表达
样品制备
纯化
2 HN
COOH
Host Cell
2 HN
COOH
储存
应用结束
11
12
What are the contaminants?
In general,
proteases which degrade or inactivate the target protein interfering components in subsequent analysis and use
蛋白纯化策略
Net Charge 净电荷
特异性 Tag/ PTM
Hydro-phobicity 疏水性 Size/globular volume 大小/球形体积
Ion exchange chromatography (IEX) 离子交换层析
Affinity chromatography (AC) 亲和层析
Number of steps
14
Three stage strategy
来自百度文库
Purity
2. Intermediate
1. Capture
Remove bulk impurities
Sample preparation
Isolate product Concentrate Stabilize
Number of steps
Periplasm
Osmotic shock or freeze/thaw method
Inclusion bodies Secreted in media
Centrifugation, solubilization and refolding
Concentration (due to large volume) and clarification
End application
11
12
样品制备
污染物 颗粒 蛋白酶
(磷酸酶) 核酸
脂类
有害的影响
防御措施
堵柱 降解目标蛋白
粘度高可能堵填 料 可能堵填料， 可能生成聚集体
过滤或离心
加酶抑制剂 用亲和层析去除 快速进行第一步分离 在低温下操作 选择酶缺失的 E. coli
加核酶 用 硫酸链霉素, 聚乙烯亚胺, 硫酸 鱼精蛋白沉淀