DNA ladder 检测

干旱胁迫诱导苹果属植物细胞程序性死亡的检测
一实验目的
1.了解细胞凋亡的原理
2.掌握DNA片断化检测的方法
二实验原理
细胞凋亡时主要的生化特征是其染色质发生浓缩，内源性核酸酶被激活，染色体DNA链在核小体之间被切割，形成180～200个碱基或其整数倍的DNA片段，将这些DNA片段抽提出来进行电泳，可得到DNA梯状条带（DNA ladder）。

细胞经处理后，采用常规方法分离提纯DNA，进行琼脂糖凝胶和溴化乙啶染色，在凋亡细胞群中可观察到典型的DNAladder。

如果细胞量很少，还可在分离提纯DNA后，用32P-A TP和脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）使DNA标记，然后进行电泳和放射自显影，观察凋亡细胞中DNA ladder的形成。

二．实验材料及用品
以八棱海棠（Malus robusta Rehd.）三年生实生苗为实验材料，材料取自潍坊学院生物工程学院校内大棚，选取干旱处理三周的苗子的幼嫩叶片GXZ智能型光照培养箱ES-315型自动蒸汽消毒柜琼脂糖凝胶电泳仪凝胶成像分析系统微量移液器低温水浴锅氯仿-异戊醇（24:1）无水乙醇75%的乙醇，2%的CTAB（CTAB 4g NaCl 16.364 g 1M Tris-HCl 20ml( PH8.0) 0.5M EDTA 8ml，）
三、实验方法
（一）、叶片总DNA的提取及检测
采用CTAB小样法提取叶片总DNA，其主要过程如下：
（1）取约1cm3的幼嫩叶片于研钵，向研钵中加入600µl 2%的CTAB分离缓冲液，研磨成浆，倒入1.5ml的离心管中。

（2）将离心管置于65℃水浴30min，其间每隔10min轻轻摇晃离心管，使其充分混匀。

（3）加入等体积的氯仿-异戊醇（24:1），颠倒摇晃5min。

（4）12000r/min离心15min，收集上清。

（5）向上清中加入1.5倍体积预先冰冻的无水乙醇，置于-20℃冰冻30min。

（6）12000r/min离心15min，弃上清，加入75%的乙醇常温下静置5min，弃上清。

（7）室温干燥10min，溶于20µl ddH2O中，-70℃保存备用。

（二）琼脂糖凝胶的制备及电泳
1. 制备1%琼脂糖凝胶：称取0.2 g琼脂糖置于锥形瓶中,加入20ml1×TAE,瓶口倒扣小烧杯.微波炉加热煮沸3次至琼脂糖全部融化,摇匀,即成1.0%琼脂糖凝胶液.
2. 胶板制备:取电泳槽内的有机玻璃内槽(制胶槽)洗干净,晾干,放入制胶玻璃板.取透明胶带将玻璃板与内槽两端边缘封好,形成模子.将内槽置于水平位置,并在固定位置放好梳子.将冷却到60℃左右的琼脂糖凝胶液中加入1ulGoldview混匀均匀，小心地倒入内槽玻璃板上,使胶液缓慢展开,直到整个玻璃板表面形成均匀胶层.室温下静置直至凝胶完全凝固,垂直轻拔梳子,取下胶带,将凝胶及内槽放入电泳槽中.添加
1×TAE电泳缓冲液至没过胶板为止.
3. 加样:用移液枪将DNA样品和上样缓冲液,混合，上样缓冲液的最终稀释倍数应不小于1X.用10 ul微量移液器分别将样品加入胶板的样品小槽内,每加完一个样品,应更换一个加样头,以防污染,加样时勿碰坏样品孔周围的凝胶面.(注意:加样前要先记下加样的顺序).
4. 电泳:加样后的凝胶板立即通电进行电泳,电压60-100V,样品由负极(黑色)向正极(红色)方向移动.电压升高,琼脂糖凝胶的有效分离范围降低.当溴酚蓝移动到距离胶板下沿约1cm处时,停止电泳.
5.在凝胶成像分析系统观察拍照。

四、实验结果与分析
细胞程序性死亡发生时，核酸内切酶被激活，导致DNA非随机性断裂，断裂成200bp整倍数的片段，经琼脂糖凝胶电泳可得到“DNA ladder”图谱，这是植物发生细胞凋亡最重要的特征之一。

如图3可见，对照叶片（ck）的总DNA 表现为一条完整的条带，而经干旱处理的叶片在电泳图谱上可以看到出现均匀间隔的DNA片段，根据DNA marker 2000（Mark）分子量标定看到，最亮的条带为1200bp、1000bp、800bp，都为200bp的整倍数，即出现“DNA ladder”图谱，结合DAPI。