引物设计的几点重要原则

PCR 引物设计的11条黄金法则 1•引物最好在模板 cDNA 的保守区内设计。

DNA 序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。在 NCBI 上搜索不同物种的同一基 因，通过序列分析软件(比如 DNAman)比对(Alignment)，各基因相同的序列就是该基因 的保守区。

2.引物长度一般在 1 5~30碱基之间。

引物长度(primerlength )常用的是18-27bp ，但不应大于 38,因为过长会导致其延伸温度 大于74C ，不适于TaqDNA 聚合酶进行反应。

3•引物GC 含量在40%~60%之间，Tm 值最好接近72 C 。

GC 含量(composition )过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的

GC 含量不能相差太 大。另外,上下游引物的 Tm 值( meltingtemperature )是寡核苷酸的解链温度,即在一定盐 浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度。有效启动温度，一般高于

Tm 值5~10C 。若按 公式Tm=4 ( G+C) +2 (A+T)估计引物的Tm 值，则有效引物的 Tm 为55~80C,其Tm 值最 好接近72 C 以

使复性条件最佳。

4•引物3端要避开密码子的第 3位。

如扩增编码区域，引物3端不要终止于密码子的第

3位，因密码子的第3位易发生简并，会 影响扩增的特异性与效率。

5. 引物3端不能选择A,最好选择T 。

引物3端错配时，不同碱基引发效率存在着很大的差异，当末位的碱基为

A 时，即使在错 配的情况下,也能有引发链的合成,而当末位链为 T 时,错配的引发效率大大降低,

G 、C 错配的引发效率介于 A 、T 之间，所以3端最好选择T o 6. 碱基要随机分布。

引物序列在模板内应当没有相似性较高, 尤其是 3'端相似性较高的序列,

否则容易导致错误 引发(Falsepriming)。降低引物与模板相似性的一种方法是，引物中四种碱基的分布最好是 随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其

3端不应超过3个连续的G 或C,因这样会使

引物在GC 富集序列区错误引发。

7. 引物自身及引物之间不应存在互补序列。

引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹结构(

Hairpin)使引物本身复性。 这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。 引物自身不能有连续 4个碱基的 互补。 3端的互补重叠以防止引物二聚体(

Dimer 与 4 个碱基的互补。 应尽量使其△G 值不要过高(应小于4.5kcal/mol )。 否则易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使 PCR 反应不能正常进行。 8. 引物5端和中间△G 值应该相对较高，而 3端 M 值较低。

△G 值是指 DNA 双链形成所需的自由能,它反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性,

值越大，则双链越稳定。应当选用 5'端和中间△G 值相对较高，而 3'端A G 值较低（绝对值

不超过9）的引物。引物3端的A G 值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发

DNA 聚合 两引物之间也不应具有互补性,尤其应避免

Crossdimer)的形成。引物之间不能有连续

引物二聚体及发夹结构如果不可避免的话,

△G

反应。（不同位置的△G 值可以用 Oligo6 软件进行分析）

9•引物的5端可以修饰，而 3端不可修饰。

引物的5'端决定着PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大。因此，可以被修饰而不影

响扩增的特异性。引物 5端修饰包括：加酶切位点；标记生物素、荧光、地高辛、Eu3+等; 引入蛋白质结合 DNA序列；引入点突变、插入突变、缺失突变序列；引入启动子序列等。

引物的延伸是从3端开始的，不能进行任何修饰。3端也不能有形成任何二级结构可能。

10.扩增产物的单链不能形成二级结构。

某些引物无效的主要原因是扩增产物单链二级结构的影响，选择扩增片段时最好避开二级结构区域。用有关软件（比如RNAstructure）可以预测估计 mRNA的稳定二级结构，有助于选

择模板。实验表明，待扩区域自由能（△G ）小于58.6lkJ/mol时，扩增往往不能成功。若不

能避开这一区域时，用 7-deaza-2 '-脱氧GTP取代dGTP对扩增的成功是有帮助的。

11.引物应具有特异性。

引物设计完成以后，应对其进行BLAST检测。如果与其它基因不具有互补性，就可以进行下

一步的实验了。

附：

值得一提的是，各种模板的引物设计难度不一。有的模板本身条件比较困难，例如GC含量

偏高或偏低，导致找不到各种指标都十分合适的引物；用作克隆目的的PCR因为产物序列

相对固定，引物设计的选择自由度较低。在这种情况只能退而求其次，尽量去满足条件。

做RealTime时用于SYBRGreen法时的一对引物与一般 PCR的引物，在引物设计上所要求的参数是不同的。引物设计的要求：

1）避免重复碱基，尤其是 G.

2）T m=58-60 度。

3）G C=30-80%.

4）3'端最后 5 个碱基内不能有多于 2 个的 G 或 C.

5）正向引物与探针离得越近越好，但不能重叠。

6）P CR扩增产物长度：引物的产物大小不要太大，一般在80-250bp之间都可；80〜150bp最

为合适（可以延长至 300bp）。

7）引物的退火温度要高，一般要在60度以上；

要特别注意避免引物二聚体和非特异性扩增的存在。

而且引物设计时应该考虑到引物要有不受基因组DNA污染影响的能力，即引物应该跨外显

子，最好是引物能跨外显子的接头区，这样可以更有效的不受基因组DNA污染的影响。

至于设计软件，PRIMER3,PRIMER5,PRIMEREXPRE都应该可以的。

做染料法最关键的就是寻找到合适的引物和做污染的预防工作。对于引物，你要有从一大堆

引物中挑出一两个能用的引物的思想准备---寻找合适的引物非常不容易。

关于BLAST的作用应该是通过比对，发现你所设计的这个引物，在已经发现并在GENEBANK

中公开的不物种基因序列当中，除了和你的目标基因之外，还有没有和其他物种或其他序列当中存在