FQPCR技术的原理及应用

●样品和标准品都要重复 ●重复次数须遵循统计学要求
平台PCR仪介绍
ABI 7500 fast
使用96孔板，样品量大，仪器稳定，结果分析直 观
ABI试剂ROX校正物理方面的误差：枪的误差 （如试剂体积）、耗材质量（如管盖厚度、透光 性能不一致）所导致的光能损失、仪器稳定性 （如孔间、批间温度的波动） Rn= Normalization = Reporter / Referenc
Producer
• • • • • Roche ABI Thermo Stratgene Biorad
Roche
• iCycler • 4来自百度文库0
Stratgene
• MP3000X • MP3600X
Biorad
ABI
• • • • • 7300 7500 7700 StepOne StepOne plus
在PCR反应体系中加入荧光基团， 利用荧光信号累积实现了实时监测 整个PCR进程，对起始模板进行定 量分析的方法。
与普通PCR的区别
• 普通PCR技术： 在PCR结束后对终点产物进行定量分析。
• 实时定量PCR技术：
实时检测PCR扩增，在扩增的指数期对起 始模板进行定量。
• 荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定 的一个值，它可以设定在荧光信号指数 扩增阶段任意位置上，一般荧光域值的 设置是 基线（背景）荧光信号的标准偏 差的 10 倍。
Rotor gene 6500HRM
36孔(普通透明0.2mlPCR管)或者72孔 (特殊0.1ml管) 离心式检测 可以做HRM。
MJ Opticon 2
可以使用8连排管或96孔板， 软件操作简单
• StepOneTM
谢谢！
实时荧光定量PCR技术的原理及应用
(Real time Quantitative PCR)
朱中元
提纲：������
• 实时荧光定量PCR原理������ 数学原理 化学原理 • 实时荧光定量PCR的方法应用 绝对定量 相对定量 • 定量PCR的实验要素 • 平台定量PCR仪器介绍
实时荧光定量PCR定义：
• 每个反应管内的荧光信号到达设定的域 值时所经历的循环数被称为 CT 值 （ threshold value ）。
定量PCR的数学原理
斜率与扩增效率
荧光定量PCR化学原理
非特异性荧光标记： 1、SYBR Green 特异性荧光标记： 2、TaqMan
1、SYBR Green 法
SYBR Green 熔解曲线分析
相对定量：参照因子Calibrator
相对定量分析方法1
-ΔΔCt
前提：目标序列和内参序列的扩增效率接近100 ％且偏 差在 5％以内 1、用内参基因的CT值归一目标基因的CT值：
ΔCT（test)= CT （target,test) - CT （ref,test)
ΔCT（calibrator)= CT （target, calibrator) - CT （ref, calibrator)
定量PCR的实验要素
样品
●DNA纯度：OD260/OD280=1.8，1.6 ~ 2.0 之间 ●DNA用量：0.05 ng –100 ng ●RNA纯度：OD260/OD280=2.0 ●cDNA用量：1-100 ng 总RNA反转录的 cDNA取1 uL
标准品
标准品梯度稀释方法
复管测试
SYBR Green法优缺点
• • • • • • 优点: 对DNA模板没有选择性 适用于任何DNA������ 使用方便--不必设计复杂探针������ 非常灵敏������ 便宜
2、TaqMan探针法
TaqMan作用机理
TaqMan法优缺点
Real-time PCR 方法应用
• •绝对定量(Absolute Quantification，AQ) 病原体检测 转基因食品检测 基因表达研究 • •相对定量(Relative Quantification，RQ) 基因在不同组织中的表达差异 药物疗效考核 耐药性研究
绝对定量与相对定量的定义
绝对定量通过标准品定量
• 绝对定量的标准样品： 已知拷贝数的质粒DNA，做系列稀释。
标准样品的种类： • •含有和待测样品相同扩增片段的克隆质 粒 • •含有和待测样品相同扩增片段的cDNA • •PCR的产物
绝对定量：从荧光到拷贝数
相对定量通过内标定量
• 内标（Endogenous Control）通常是βactin、GAPDH基因等看家基因 • 在细胞中的表达量或在基因组中的拷贝 数恒定，受环境因素影响小 • 内标定量结果代表了样本中所含细胞或 基因组数量
2、用校准样本的ΔCT值归一试验样本的ΔCT值 ΔΔCT= ΔCT（test) - ΔCT（calibrator) 3、计算表达水平比率： 2 –ΔΔCT=表达量的比值
相对定量分析方法2：双标准曲线法
目标基因与内参基因扩增效率不同
待测样品目的基因浓度
待测样品内参基因浓度
F=
对照样品目的基因浓度 对照样品内参基因浓度