二代测序之建库步骤

第一部分DNA酶处理：试剂为PROMEGA( RQ1 RNase-Free DNase )

目的：失活DNase酶

RNA（TE洗脱）8微升

RQ1 RNase-Free DNase 10X Reaction Buffer 1微升

RQ1 RNase-Free DNase 1微升/微克RNA

合计10微升

37℃ 30分钟孵育

加1微升的RQ1 DNase 终止液

65℃ 10分钟使DNase酶失活

（PS:经验这一步最好在核酸提取之前就处理好，具体步骤如下：取样本反复冻融三次，然后一万转离心十分钟，取上清，用0.22微米的滤膜过滤，加DNase，提核酸）

第二部分RNA-seq system V2(cat.7102)

目的：生成并纯化cDNA

一、第一链合成

1. 融解第一链cDNA合成试剂（蓝色盖）和无核酸酶的水（绿色）

2. 短时离心A3ver1 放在冰上，votex A1Ver4和A2ver3，离心后放在冰上；无核酸酶水放在室温；

3. 在冰上，取2ul A1和5ul total RNA （500pg到100ng）放在0.2mlPCR管里；

4. 将PCR管放在PCR仪中运行程序1：

RNA量≤ 1ng时，65℃ 2min，4℃存放

RNA量> 1ng时，65℃ 5min，4℃存放；

5. PCR仪降到4℃后取出PCR管放在冰上，加入制备好的第一链合成试剂，每个样本加入3ul，混匀后，离心放在冰上：

第一链合成试剂：2.5ul buffer mixA2+ 0.5ul 酶混合液A3（共3ul）注意：加酶A3时要慢慢加入，反复吹打枪头至少5次确保酶加入进去

6. 把加入第一链合成剂和样本的PCR管放在PCR仪上运行程序2：

4℃ 1min，25℃ 10min，42℃ 10min，70℃ 15min，4℃hold

二、第二链合成

1. 重悬RNAclean XP beads，放在室温备用

2. 融解第二链合成试剂（黄盖）

3. 瞬时离心B2Ver2，放在冰上。，votex B1Ver3，离心后放在冰上；

4. 每个样本中加入10ul第二链合成混合液（9.7ul buffer mix B1+0.3ul B2 Enzyme mix），轻轻混匀，放在冰上；

5. 把PCR管放在PCR仪上，运行程序3：

4℃ 1min，25℃ 10min，50℃ 30min，80℃ 20min，4℃hold

6. PCR仪降到4℃后取出PCR管，放在冰上，进行cDNA纯化。

三、纯化cDNA

1. 确定RNAclean XP beads室温平衡，颠倒混匀（PS:需要提前取出室温平衡半个小时以上，用之前需重新混匀并马上离心使用）

2. 在上述反应体系中加入beads32ul，吹打混匀10次；

3. 室温放置10min；

4. 把管放在磁力架上，放置5min，吸出45ul结合buffer，加入200ul新鲜配制的70%乙醇，放置30sec，用加样器吸出乙醇，重复洗涤3次；最后洗涤后吸出多余的乙醇，室温干燥15-20min，确保不案子完全干燥没有乙醇残留；继续进行SPIA扩增。

四、SPIA扩增

1. 融解SPIA扩增试剂（红色盖）；

2. 取C3ver7.5 颠倒混匀，瞬时离心后放在冰上，votex C1Ver9和C2ver11，离心后放在冰上；

3. 每个样本中加入SPIA master Mix40ul：20ul buffer Mix C2 +10ul primer Mix C1+10ul Enzyme mix C3 ，与beads充分混匀，放在冰上；

4. 把PCR管放在PCR仪上，运行程序4

4℃ 1min，47℃ 60min，80℃ 20min，4℃hold

5. PCR仪降到4℃后取出PCR管，放在冰上，进行扩增产物SPIA cDNA 纯化或者储存在-20℃。

五、纯化SPIAcDNA

用Qiagen minElute reaction cleanup kit 进行纯化。