凡纳滨对虾抗传染性皮下及造血组织坏死病毒感染的初步研究
几种环境因子对IHHNV在凡纳滨对虾体内增殖的影响
几种环境因子对IHHNV在凡纳滨对虾体内增殖的影响作者：张丽马文婷姚洪旺李娜包海岩来源：《河北渔业》2023年第11期摘要：为阐明在凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）养殖过程中影响传染性皮下及造血组织坏死病毒（IHHNV）增殖的关键因子，在实验室条件下，研究了温度、盐度、氨氮、亚硝酸盐氮等环境因子变化对凡纳滨对虾体内IHHNV增殖的影响。
结果显示：在同样条件下，水温25 ℃和30 ℃凡纳滨对虾体内IHHNV病毒数具有明显差异，且在30℃时最大；2.5‰、10.0‰、20.0‰三个盐度梯度IHHNV增殖组间差异显著，且增殖速度与盐度呈正相关；在氨氮0.05、3.00、7.00 mg/L三个浓度梯度下，IHHNV在凡纳滨对虾体内增殖数量的变化未表现出线性关系，但氨氮0.05 mg/L浓度组凡纳滨对虾体内病毒数明显低于3.00、7.00 mg/L浓度组；在亚硝酸盐氮0.05、5.00、10.00 mg/L三个浓度梯度下，IHHNV在凡纳滨对虾体内增殖数的变化组间差异不显著。
关键词：凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）；环境因子；传染性皮下及造血组织坏死病毒（IHHNV）；增殖随着凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）养殖业的迅猛发展，养殖疾病逐年增多，造成了极大的经济损失。
环境因子作为养虾池塘生态系统的主要部分，对对虾病毒病的暴发起着重要作用。
环境因子超出对虾的适应范围就会成为胁迫因子，这种胁迫既影响生物体也影响病原体。
养殖环境涉及的胁迫因子包括水质理化因子（温度、盐度、pH、溶解氧、环境污染物等）、生物因子（媒介生物等）。
近年来环境胁迫因子对养殖生物的生理病理影响受到越来越多国内外科研工作者的重视。
已有研究表明：疾病暴发主要是宿主、环境和病原体三者经过复杂的相互作用的结果，在一定环境条件下，宿主与其携带的病原体可以共存，当某些环境条件发生了大的变化，可能会导致疾病的暴发。
对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒(福建株)基因组的克隆
浆 ，６ ０ ｒｍｎ １ ００／ ｉ 离心 ｌｍｎ 取上清液再经 ６ ０／ ｉ 超速离心 ３ ， Ｏ ｉ， ００ ｒｍｎ ０ ｈ 沉淀重悬于 Ｔ Ｍ缓冲液（０ ｍ ］ ｍ Ｎ ２ｍ ｏ ／ｄ
收稿 日期 ：０７０ －１ ２０ －６０ 基金项 目： 福建省科技厅重大专项资助项 目（０ ４ ０ —） ９ ８专项资助项 目（０ －２Ｚ ３ ２０ ＮＺ ３１ ：０ ９ ８０ 一Ｈ ） 作者简介 ： 吴吴（ ９０一）， 硕士 生． １８ 女，
先利 用 Ｄ Ａ末 端加 尾和 嵌 套 Ｐ Ｒ克 隆 了 Ｉ Ｎ Ｎ Ｃ ＨＨ Ｖ基 因组 两末 端序 列 ， 并根据 测 定 的末 端序 列 设计 引物 ，Ｃ Ｐ Ｒ扩增 出 中国福建 株 Ｉ Ｎ ＨＨ Ｖ基 因组序 列 ． 关键词： 染性 皮 下及造 血 组 织坏 死病毒 （Ｈ Ｎ ； 套 Ｐ Ｒ； 传 Ｉ Ｈ Ｖ） 嵌 Ｃ 病毒基 因组 ；’ ３ 末端序 列 ５和 ’
１ 材料与方法
１ １ 材料 ．
经病毒检测试剂盒（ 自厦门鹭隆生物科技有限公司） 购 确认已感染 Ｉ Ｈ Ｖ的凡纳滨对虾采集于福建龙 Ｈ Ｎ 海对虾养殖场．ａ Ｎ Ｔ ｑＤ Ａ聚合酶 、 末端脱氧核糖核酸转移酶 、 Ｎ ｓ ｐ Ｄ ８ Ｄ ａ Ｉ Ｍ １一 ｅ、 Ｔ载体和 Ｄ Ａ连接酶购 自大连 Ｎ
凡纳滨对虾血细胞免疫抑制剂的筛选与免疫调控作用的研究的开题报告
凡纳滨对虾血细胞免疫抑制剂的筛选与免疫调控作用的研究的开题报告一、研究背景凡纳滨对虾是我国南方沿海地区重要的经济水产品之一，但其免疫系统相对较弱，易受到各种病原微生物的侵袭。
因此，开发凡纳滨对虾的免疫调控剂对于保障其养殖产业的可持续发展具有重要意义。
目前，免疫抑制剂已被广泛应用于器官移植、自身免疫性疾病等治疗中，而免疫调节剂也被广泛应用于免疫性疾病、癌症、自身免疫性疾病等的治疗中。
因此，研究凡纳滨对虾的免疫调节剂有利于解决其免疫系统弱的问题。
二、研究目的本研究旨在筛选出凡纳滨对虾的免疫抑制剂，并探讨其对免疫系统的调控作用，为凡纳滨对虾的免疫调控提供理论基础，进而提高其免疫能力，推动其养殖产业的可持续发展。
三、研究内容和方法（1）筛选凡纳滨对虾的免疫抑制剂。
采用体外细胞增殖实验和细胞毒活性实验，对凡纳滨对虾血细胞进行筛选，并挑选出具有很强免疫抑制作用的物质。
（2）验证免疫抑制剂的作用。
将筛选出的免疫抑制剂应用于凡纳滨对虾体内，通过测定血细胞数量及免疫指标的变化，验证其对凡纳滨对虾免疫系统的影响。
（3）探究免疫抑制剂的免疫调控作用。
通过测定免疫相关因子的表达水平、免疫细胞的增殖和迁移等指标，探究免疫抑制剂的免疫调控作用机制。
四、预期成果（1）筛选出一种凡纳滨对虾的免疫抑制剂，具有很强的免疫抑制作用；（2）验证该免疫抑制剂的抑制作用和免疫调控作用；（3）揭示该免疫抑制剂的作用机制，为凡纳滨对虾免疫调控剂的研发提供理论基础。
五、研究意义（1）筛选出具有很强免疫抑制作用的物质，可应用于凡纳滨对虾的疾病治疗中；（2）验证该免疫抑制剂的免疫调控作用，为凡纳滨对虾免疫调控剂的研发提供理论基础；（3）揭示该免疫抑制剂的作用机制，为开发更多针对凡纳滨对虾的免疫调控剂提供参考。
凡纳滨对虾群体的ISSR分析及抗病力指标的比较的开题报告
凡纳滨对虾群体的ISSR分析及抗病力指标的比较的开题报告一、研究背景及意义凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）是一种重要的养殖经济动物，其产值已成为全球水产业的支柱之一。
然而，由于对虾养殖密度大、生长速度快、环境异质性强等因素，导致对虾养殖易发生疾病，且抗病力不同。
因此，建立诊断和防治途径、选育抗病性强的对虾品系，对于提高对虾养殖产业发展的质量和效益至关重要。
分子标记技术是一种研究遗传多样性及其遗传机制的有效手段，ISSR为其中的一种常用的分子标记技术，其具有快捷、经济、高效等优点，已被广泛用于对虾的遗传多样性及其育种研究。
因此，本研究旨在利用ISSR分析凡纳滨对虾群体的遗传多样性，探讨其抗病力的分子标记指标，并为对虾的育种研究提供一定的理论基础。
二、研究内容及方法研究内容：1. 对凡纳滨对虾不同群体进行ISSR分析，评估其遗传多样性；2. 利用不同对虾品系进行比较研究，探究其抗病力指标；3. 建立对虾品系的ISSR指纹图谱。
研究方法：1. 样本采集与处理：选取4个地区的凡纳滨对虾进行采集，并进行分离提纯。
DNA提取后，利用ISSR引物扩增，通过PCR扩增产物进行比对分析。
2. ISSR分析：选取合适的ISSR引物，进行PCR扩增、电泳分析、结果分析。
3. 杀菌实验：分别利用不同抗病性品系的对虾，进行细菌感染实验，以评估其抗病力。
4. 数据分析：统计数据并进行分析，建立样本的ISSR指纹图谱。
三、预期结果与意义预期结果：1. 对凡纳滨对虾进行的ISSR分析可获取其遗传多样性信息；2. 可较为准确地判断不同对虾品系的抗病性；3. 可建立凡纳滨对虾ISSR指纹图谱；4. 为对虾的育种研究提供一定的理论基础。
意义：1. 为对虾的遗传多样性研究和抗病性育种提供科学依据；2. 对提高凡纳滨对虾养殖产业发展的质量和效益具有重要推动作用。
分子生物学在水产养殖学上的应用研究进展
分子生物学在水产养殖学上的应用研究进展摘要：随着近些年分子生物学的迅速发展，其技术在水产养殖学上的应用也越来越广泛。
本文综述了近些年来分子生物学技术在水产养殖学上的应用研究进展，并阐述其技术原理、特点以及应用情况，旨在为以后的水产品分子生物学相关研究和实验提供基础资料和可能思路。
关键字：分子生物学；水产养殖；应用进展Abstract：With the rapid development of the molecular biology in recent years,it applies in aquaculture more and more widely.This thesis summarizes the research progress of molecular biology for aquaculture in the recent years and describes its principle,characteristics and application,which aims to provide fundamental data and possible thinking with future aquaculture about molecular biology.Key word：molecular biology;aquaculture;application一直以来，水产养殖业的传统印象都是技术含量低，但随着技术研发的进步，一代代科研人员投身于水产养殖业，致力于用生物技术改变水产现状。
分子生物学作为一门综合性、应用性极强的学科，也开始应用于水产养殖业上，通过分子生物学的一些生物技术，我们可以达到非常好的应用效果，应用分子生物学，可以对水产品或者养殖水域环境进行改善和提高，如提高鱼类性能、疾病防治以及保护水域环境等等。
1 分子生物学概论1.1 分子生物学概念分子生物学是从分子水平研究生命本质的一门新兴边缘学科，其核心内容是在核酸与蛋白质水平上研究基因的复制、表达及其调控，即“基因的分子生物学”，它的发展为人类认识生命现象带来了前所未有的机会，也为人类利用和改造生物创造了极为广阔的前景，是生命科学及相关专业本科生重要的专业基础课。
凡纳滨对虾抗传染性皮下及造血组织坏死病毒感染的初步研究
凡纳滨对虾抗传染性皮下及造血组织坏死病毒感染的初步研究赵永贞;陈秀荔;辛文伦;杨春玲;彭敏;陈晓汉【期刊名称】《动物医学进展》【年(卷),期】2010(031)010【摘要】对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)可导致凡纳滨对虾罹患慢性矮小残缺综合征,引起对虾的产量降低、经济效益下降,对对虾的养殖业危害严重.本试验通过于第3腹节肌肉注射100 μL/gIHHNV的方法对不同家系的对虾攻毒,联合应用PCR和组织病理学检测并鉴定病毒.结果发现14个家系的对虾未感染IHHNV的比率79.3%～96.7%;联合两种方法可快速、灵敏、特异地检测出对虾感染IHHNV的状况.试验结果为对虾流行病调查、健康养殖及无特定病原(SPF)种群选育提供了有效的检测手段.【总页数】4页(P54-57)【作者】赵永贞;陈秀荔;辛文伦;杨春玲;彭敏;陈晓汉【作者单位】广西壮族自治区水产研究所,广西南宁,530021;广西壮族自治区水产研究所,广西南宁,530021;广西壮族自治区水产研究所,广西南宁,530021;广西大学,广西南宁,530021;广西壮族自治区水产研究所,广西南宁,530021;广西壮族自治区水产研究所,广西南宁,530021;广西壮族自治区水产研究所,广西南宁,530021【正文语种】中文【中图分类】S852.65%S945.4【相关文献】1.粤西地区凡纳滨对虾虾肝肠胞虫、传染性皮下和造血组织坏死病毒感染情况的初步调查 [J], 陈禄芝;余霞艳;胡一丞;李色东;2.传染性皮下及造血器官坏死病毒诱导南美白对虾抗白斑综合征病毒感染的初步研究 [J], 张娜;谢艳辉;袁俊杰;李家侨;斯泽恩3.粤西地区凡纳滨对虾虾肝肠胞虫、传染性皮下和造血组织坏死病毒感染情况的初步调查 [J], 陈禄芝;余霞艳;胡一丞;李色东4.凡纳滨对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)可视化环介导等温扩增(LAMP)技术方法的优化与应用 [J], 葛辉;林嘉铭;周宸;吴建绍;杨章武;吴丽云;张哲;杜秀萍;洪伟;林克冰;林琪5.凡纳滨对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)可视化环介导等温扩增(LAMP)技术方法的优化与应用 [J], 葛辉;吴建绍;杨章武;吴丽云;张哲;杜秀萍;洪伟;林克冰;林琪;林嘉铭;周宸因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV) LAMP检测方法的建立
对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV) LAMP检测方法的建立孙妍;董学旺;魏俊利;顾中华;陈浩楠;刘群;张丽;包海岩【期刊名称】《水产研究》【年(卷),期】2024(11)1【摘要】本研究建立了一种检测对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒(Infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus, IHHNV)的环介导等温扩增法(Loop-mediated isothermal amplification, LAMP)。
根据GenBank中注册的IHHNV-VN基因序列设计出6条特异性引物,成功建立了IHHNV-LAMP检测方法。
该方法检出限为6 copies/μl,且与对虾其它常见疫病均无交叉反应。
采用LAMP和常规PCR方法对40份具有典型IHHNV感染症状的对虾样品进行检测,结果显示:LAMP方法的阳性检出率为97.5%,PCR方法的阳性检出率为85%,表明建立的IHHNV-LAMP方法不仅具有高灵敏度、高特异性而且还有较高的准确性,能够为对虾传染性皮下及造血组织坏死病的早期快速诊断提供技术支撑。
【总页数】8页(P30-37)【作者】孙妍;董学旺;魏俊利;顾中华;陈浩楠;刘群;张丽;包海岩【作者单位】天津市动物疫病预防控制中心;天津市水生动物疫病监测中心;天津市农业发展服务中心【正文语种】中文【中图分类】S94【相关文献】1.对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒实时荧光LAMP检测方法的建立及应用2.对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV) PCR检测方法的建立3.对虾白斑综合征病毒和传染性皮下及造血器官坏死病毒双重LAMP检测方法的建立和临床应用分析4.凡纳滨对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)可视化环介导等温扩增(LAMP)技术方法的优化与应用因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
广西凡纳滨对虾IHHNV感染情况的调查与分析
（ 广西水产科 学 研 究院，南宁 ５ ３ ０ ０ ２ １ ； 上海海洋大学 水产与生命学院， 上海 ２ ０ １ ３ ０ ６ ）
摘要： 【 目的 】 了解凡纳滨对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒 （ Ｉ Ｈ Ｈ Ｎ Ｖ） 在广西 的分布 、 流行 特点及趋势 ， 为研究 制定广 西对 虾Ｉ ＨＨ Ｎ的综合防控措施提供参 考。【 方法 】 根据 广西凡纳滨对虾养殖情况 ， 分别在北海市 、 钦州市 、 防城港 市设立 监测 区 ， 每个监测 区设３ ～ ５ 个监测点 ， ２ ０ １ ０ － ２ ０ １ ２ 年每年５ 月和９ 月进行两次采样 ， 应用Ｐ Ｃ Ｒ 对采集样 品进行Ｉ ＨＨ —
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（ Ｇｕ ａ ｎ ｇ ｘ ｉ Ａｃ ａ ｄ ｅ ｍｙ ｏ ｆ Ｆ ｉ ｓ ｈ ｅ ｒ ｙ Ｓ ｃ ｉ ｅ ｎ ｃ ｅ ， Ｎａ ｎ ｎ ｉ ｎ ｇ ５ ３ ０ ０ ２ １ ， Ｃ ｈ ｉ ｎ ａ ； Ｃｏ ｌ ｌ ｅ ｇ ｅ ｏ ｆ Ｆ ｉ ｓ ｈ ｅ ｉｅ ｒ ｓ ａ ｎ ｄ Ｌ ｉ ｆ ｅ Ｓ ｃ ｉ ｅ ｎ ｃ ｅ ，Ｓ ｈ ａ ｎ ｇ ｈ ａ ｉ Ｏｃ ｅ ａ ｎ
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对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)病毒样颗粒的研究的开题报告
对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)病毒样
颗粒的研究的开题报告
标题：对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)病毒样颗粒的研究
摘要：对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒（IHHNV）病毒是威胁
对虾养殖业的一种病原体。
该病毒可引起对虾免疫系统的破坏，导致对
虾死亡率增加，从而导致对虾养殖业的损失。
在此背景下，对IHHNV进
行深入研究，对防治和控制病害具有重要意义。
本研究旨在通过电镜技术和蛋白质组学方法，对IHHNV病毒样颗粒的形态学特征和蛋白质组成进行研究。
首先，使用纯化方法纯化IHHNV
病毒样颗粒。
然后，通过传统电镜技术和高分辨电镜技术观察其形态学
特征，并对其直径、表面形态及核心结构进行分析。
同时，利用蛋白质
组学方法对其蛋白质组成进行分析，通过二维电泳、液相色谱和质谱等
技术进行分离和鉴定。
预期结果为：通过对IHHNV病毒样颗粒形态学和蛋白质组成的研究，揭示其结构与功能的关系，进一步了解其感染机制和致病机理，为病害
防治和控制提供基础研究支持。
关键词：对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒；病毒样颗粒；形态
学特征；蛋白质组学。
对虾传染性肌肉坏死病
对虾传染性肌肉坏死病
张志
【期刊名称】《海洋与渔业》
【年(卷),期】2015(0)11
【摘要】病原传染性肌肉坏死病毒。
症状感染时体色发白,腹节发红,尾部肌肉组织呈点状或扩散的坏死症状,体表有不规则黑斑,则可初步断定患有传染性肌肉坏死病。
流行情况凡纳滨对虾目前是主要易感种类,在整个养殖过程中均可感染,养殖在海水和低盐度的咸淡水中的幼虾和半成虾最容易受到感染。
该病发病缓慢,累计死亡率高达70%,引起病发的原因可能与养殖过程中温度、盐度过高或过低、撒网捕虾或投喂劣质饲料等因素有关。
【总页数】1页(P63)
【作者】张志
【作者单位】广东省水生动物疫病预防控制中心
【正文语种】中文
【相关文献】
1.对虾传染性肌肉坏死病研究进展 [J], 闫冬春;Kathy F.J.Tang;Donald
V.Lightner
2.对虾传染性肌肉坏死病的诊断与预防 [J], 李文旭;张左兵
3.南美白对虾养殖应警惕传染性肌肉坏死病毒 [J], 朱泽闻;赵文武
4.核酸探针斑点杂交检测对虾传染性肌肉坏死病毒 [J], 谢玮;闫冬春;牛余泽;孟莳;赵军
5.对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)的流行病学与检测技术研究进展[J], 杨冰;宋晓玲;黄倢;雷质文
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凡纳滨对虾肠道中地衣芽孢杆菌的分离鉴定及其生物学特性
第39卷第1期大连海洋大学学报Vol.39No.1 2024年2月JOURNAL OF DALIAN OCEAN UNIVERSITY Feb.2024DOI:10.16535/ki.dlhyxb.2023-137文章编号:2095-1388(2024)01-0074-09凡纳滨对虾肠道中地衣芽孢杆菌的分离鉴定及其生物学特性徐振权,韩国威,任静,张子轩,孙敬锋,韩卓然∗(天津农学院水产学院天津市水产生态及重点实验室,天津300384)摘要:为筛选对凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)具有潜在益生效果的菌株,从体质量为(3.1ʃ0.4)g的健康凡纳滨对虾肠道中筛选出一株具有耐高温(80ħ)能力的菌株(命名为RHVJ),采用形态学观察㊁生理生化鉴定㊁基因序列比对㊁病原菌拮抗能力测定㊁安全性与耐受性分析和生长特性检测等方法对其展开研究㊂结果表明:菌株RHVJ为革兰氏阳性杆菌,综合其生理生化特征可初步鉴定该菌属于芽孢杆菌属(Bacillus);菌株RHVJ的16S rDNA序列与地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)的MH305331.1和NR074923.1完全匹配,其gyrB序列与CP038186.1和CP023729.1也达到了100%的一致性;综合菌体形态㊁生理生化及分子生物学特征,判定菌株RHVJ为地衣芽孢杆菌;地衣芽孢杆菌RHVJ可抑制副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)和维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)生长,对凡纳滨对虾无致病性;在胆盐质量浓度为0~1.2g/L㊁pH为3~11环境下培养,以及在37~90ħ下进行5min或15min水浴处理后,菌株RHVJ仍可持续增殖,该菌在27ħ㊁pH7和盐度20条件下生长最佳㊂研究表明,凡纳滨对虾肠道源地衣芽孢杆菌RHVJ环境适应性良好且安全,具有一定的病原菌拮抗能力,可作为候选菌株开发为益生菌制剂㊂关键词:凡纳滨对虾;肠道;地衣芽孢杆菌;益生菌中图分类号:S917.4㊀㊀㊀㊀文献标志码:A㊀㊀凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)是中国主要的对虾养殖品种,具有生长速度快㊁抗病能力强和经济价值高等养殖优势[1]㊂随着凡纳滨对虾养殖业集约化程度的提高,养殖密度不断增大,水质持续恶化,疾病频发已成为制约对虾养殖业发展的主要因素[2]㊂根据感染病原的不同,虾类疾病主要分为病毒性疾病㊁细菌性疾病和寄生虫疾病㊂凡纳滨对虾养殖中常见的病毒性疾病包括白斑综合征(WSSV)[3]㊁桃拉综合征(TSV)[4]㊁传染性皮下及造血组织坏死病(IHHNV)[5]㊁虾血细胞虹彩病毒病(SHIV)[6]等;凡纳滨对虾的主要细菌性病原有弧菌(Vibrio)[7]㊁气单胞菌(Aeromonas)[8]和假单胞菌(Pseudomonas)[9]等,可引起对虾急性肝胰腺坏死病(AHPND)㊁白便综合征(WSF)等疾病;凡纳滨对虾寄生虫感染引起的寄生虫病主要有微孢子虫病(EHP)[10]㊁拟阿脑虫病(Para-nophrys carcini spiralis)[11]和纤毛虫病(Ciliate)[12]等,同样给中国对虾养殖业带来了极大的经济损失㊂由于目前仍无疗效稳定㊁成本低廉和使用方便的产品化疫苗,抗生素仍然是治疗对虾疾病的主要药物,但伴随而来的药物残留和病原菌耐药性问题不容忽视[13]㊂近年来,益生菌因具有无毒㊁无残留㊁无抗药性和无污染等特点,被广泛应用于水产养殖业㊂研究表明,益生菌具有抑制病原菌增殖㊁促进营养物质吸收利用及增强宿主抗病力的作用[14]㊂地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)属芽孢杆菌科,为革兰氏阳性菌,在土壤㊁堆肥和动物肠道中广泛分布,具有耐高温㊁耐酸和耐胆盐等特点,能以孢子的形式抵抗恶劣环境,具有较强的环境适应能力[15]㊂该菌可通过产生抗菌活性物质抑制致病菌增殖[16],同时还可通过分泌丰富的胞外酶系来降解水体中的饵料㊁排泄物和浮游生物残体等残留有机物,避免有机物分解耗氧及败坏水质[17]㊂对水产动物研究发现,饲喂地衣芽孢杆菌后,异育银鲫(Carassiusauratus gibelio)体质量及表观消化率显著㊀收稿日期:2023-06-15㊀基金项目:天津市教委科研项目(2021KJ112)㊀作者简介:徐振权(1995 ),男,硕士研究生㊂E-mail:2854806745@ ㊀通信作者:韩卓然(1992 ),女,博士,讲师㊂E-mail:hzr_0714@增加,饵料系数明显降低,肠道组织中蛋白酶活性显著提高[18];在饲料或养殖水体中添加地衣芽孢杆菌,凡纳滨对虾的生长性能和肝胰脏免疫酶活性显著提高[19],抗白斑综合征病毒感染能力明显增强[20]㊂由此可见,地衣芽孢杆菌具有开发为水产动物益生菌制剂的潜力㊂目前,应用于水产动物的益生菌菌株大多分离自陆生动物,其宿主特性和生存环境与水生动物明显不同:一方面,水产动物为变温动物,而陆生动物为恒温动物,二者体温具有差异;另一方面,陆生动物胃肠道结构及环境pH与水产动物有较大差别㊂而菌株的生长㊁细菌素产量及其在肠道中的定植能力均受环境pH和温度的影响,因此,与其他来源益生菌相比,宿主源益生菌具有更好的定植能力和益生效果[21]㊂为获得虾源益生菌菌株,本研究中从健康凡纳滨对虾肠道内筛选出一株菌株,从形态学㊁生理生化及分子特征等方面对该菌株进行了鉴定,并对其耐受性㊁安全性及生长特性进行了评估,以期为凡纳滨对虾微生态制剂的开发与应用提供科学依据㊂1㊀材料与方法1.1㊀材料健康凡纳滨对虾体长为(5.2ʃ0.2)cm,体质量为(3.1ʃ0.4)g,购自天津立达海水资源开发有限公司,用于肠道益生菌菌株的分离和安全性检测试验㊂在凡纳滨对虾育苗及养殖期间,未向饲料及养殖水体中添加抗生素及益生菌制剂㊂病原菌拮抗试验所用菌株为副溶血弧菌(Vib-rio parahaemolyticus)㊁嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)和维氏气单胞菌(Aeromonas veronii),均由天津农学院水产生态及养殖重点实验室保存并提供㊂益生菌筛选所用MRS培养基,益生菌耐受性㊁生长特性及安全性检测所用LB培养基的配制均参考‘分子克隆实验指南“[22]㊂1.2㊀方法1.2.1㊀芽孢杆菌初筛及纯化㊀用体积分数为75%的乙醇擦拭凡纳滨对虾体表,无菌环境中采集对虾完整肠道组织,并使用匀浆器研磨匀浆,置于80ħ水浴锅中水浴10min㊂随后,用质量分数为0.9%的无菌生理盐水对匀浆液进行10倍梯度稀释,分别取0.1mL各稀释度样品涂布于MRS固体培养基上,37ħ下恒温培养24h㊂选择菌落清晰㊁分散的平板,挑取单菌落进行纯化,获得一株具有耐高温能力的菌株,并命名为RHVJ,随后将该菌株纯培养后保存到甘油中备用㊂1.2.2㊀菌株的形态学观察及生理生化特征鉴定㊀将纯化后的单菌落接种到MRS固体培养基上,37ħ下培养24h,观察菌落形态;挑取单菌落进行革兰氏(购自北京索莱宝科技有限公司)染色,镜检观察细菌菌体形态及颜色㊂按照细菌微量生化反应管(购自杭州微生物试剂有限公司)使用说明书对分离菌株的生化特征进行测定,参考‘伯杰细菌鉴定手册“[23]进行归类判定㊂1.2.3㊀分子生物学鉴定㊀挑取单菌落接种至MRS 液体培养基中,37ħ下培养24h,使用细菌基因组DNA提取试剂盒(购自北京百泰克生物技术有限公司)提取菌液DNA㊂使用16S rDNA通用引物27F(5ᶄAGAGTTTGATCATGGCTCAG3ᶄ)和1492R (5ᶄGGTTACCTTGTTACGACTT3ᶄ),以及gyrB基因通用引物UP1(5ᶄGAAGTCATCATGACCGTTCTG-CAYGCNGGNGGNAARTTYGA3ᶄ)和UP2r(5ᶄAG-CAGGGTACGGATGTGCGAGCCRTCNACRTCNGCRT-CNGTCAT3ᶄ)进行PCR扩增㊂PCR扩增反应体系(25μL):2ˑTaq PCR Master Mix10μL,上㊁下游引物各1μL,DNA模板2μL,无菌双蒸水11μL㊂PCR反应程序: 95ħ下预变性4min,94ħ下变性1min,55ħ下退火1min,72ħ下延伸1min,共进行30个循环;最后在72ħ下再延伸10min,4ħ下结束反应㊂扩增产物经10g/L琼脂糖凝胶检测后,送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序,测序所得序列通过NCBI-Blast在线软件进行检索分析,采用MEGA6.0软件构建系统发育树㊂1.2.4㊀菌株RHVJ耐受性试验㊀将菌株RHVJ接种到LB液体培养基中,37ħ下培养至对数生长期,用于耐胆盐㊁耐pH和耐高温试验㊂1)耐胆盐试验㊂取RHVJ菌株菌液,以2% (体积分数,下同)的接种量分别接种于胆盐质量浓度为0㊁0.2㊁0.4㊁0.6㊁0.8㊁1.0㊁1.2g/L的LB液体培养基中㊂37ħ下恒温培养24h后,使用分光光度计测定菌液在600nm波长处的吸光值(OD600nm),每个胆盐浓度组设置3个平行㊂2)耐pH试验㊂将待测菌液以10%的接种量分别接种于pH为1㊁3㊁5㊁7㊁9㊁11的LB液体培养基中,37ħ下恒温培养24h后,使用分光光度计测定菌液OD600nm值,每个pH组设置3个平57第1期徐振权,等:凡纳滨对虾肠道中地衣芽孢杆菌的分离鉴定及其生物学特性行㊂3)耐高温试验㊂将RHVJ菌液以5%的接种量分别接种于12组等量LB液体培养基中,其中, 6组分别在37㊁50㊁60㊁70㊁80㊁90ħ条件下水浴5min,另外6组分别在37㊁50㊁60㊁70㊁80㊁90ħ条件下水浴15min㊂水浴结束后,37ħ下恒温培养24h,用分光光度计测定菌液的OD600nm 值,每组设置3个平行㊂1.2.5㊀菌株RHVJ生长特性测定㊀参照罗璋等[24]的方法,将等量(50mL)LB液体培养基分装至250mL锥形瓶中,使用NaOH(1mol/L)或HCl (1mmol/L)和NaCl调节LB液体培养基中的pH 和盐度㊂随后,将连续传代两次培养的RHVJ菌液按2%的接种量接种于LB培养基中㊂在37ħ和pH7.0条件下,检测盐度分别为0㊁20㊁30㊁40㊁50时RHVJ的生长特性;在37ħ和盐度20条件下,检测pH分别为3.0㊁4.0㊁5.0㊁6.0㊁7.0㊁8.0㊁9.0㊁10.0时RHVJ的生长特性;在pH7.0和盐度20的条件下,检测培养温度分别为27㊁32㊁37㊁42ħ时RHVJ的生长特性㊂以上各组均设置3个平行,并在恒温摇床中以150r/min培养,每2h测定一次菌液OD600nm值,直至48h检测完毕㊂1.2.6㊀病原菌拮抗试验㊀用牛津杯法[25]检测RHVJ对病原菌(副溶血弧菌㊁嗜水气单胞菌和维氏气单胞菌)的拮抗能力㊂将待测菌株RHVJ和病原菌传代培养后分别制备为1ˑ107㊁1ˑ106CFU/mL 的菌悬液㊂将牛津杯竖直放置于已均匀涂布病原菌菌液的LB固体培养基上,随后注入200μL RHVJ 菌液,密封,37ħ下培养24h,测量抑菌圈大小,每种浓度的病原菌设置3个平行㊂1.2.7㊀菌株RHVJ安全性检测㊀将40尾健康凡纳滨对虾随机分为4组,每组放置10尾虾㊂其中, 3组对虾肌肉注射100μL浓度分别为1ˑ106㊁1ˑ107㊁1ˑ108CFU/mL的RHVJ菌悬液;1组(对照组)对虾肌肉注射等量无菌生理盐水㊂连续观察7d,记录对虾发病死亡情况㊂1.3㊀数据处理采用Graph Pad Prism7.0软件进行统计分析㊂数据集采用Shapiro-Wilk检验法进行正态性检验㊂对于呈正态分布的数据,采用单因素方差分析和Tukey多重比较进行差异分析;对于非参数数据集,采用Kruskal-Wallis检验和Dunn多重比较进行差异分析㊂显著性水平设为0.05㊂2㊀结果与分析2.1㊀菌株形态特征和生理生化特性从健康凡纳滨对虾肠道中分离获得一株菌株RHVJ,对其菌落形态进行观察,结果显示,该菌单菌落边缘整齐,为圆形㊁不透明,有乳白色的凸起(图1(a))㊂革兰氏染色结果显示,RHVJ为革兰氏阳性杆状细菌(图1(b))㊂生理生化试验结果表明:分离菌株能分解葡萄糖㊁淀粉㊁山梨醇㊁七叶苷㊁水杨素和尿素,并具有产酸和产气的能力;可使明胶液化;ONPG㊁V-P㊁甲基红㊁精氨酸双水解酶和硝酸盐还原等试验结果均为阳性;不可分解胆汁七叶苷㊁肌醇㊁卫茅醇㊁乳糖㊁葡萄糖酸盐㊁枸橼酸盐和酒石酸盐;不可利用赖氨酸和鸟氨酸;N-乙酰葡萄糖胺㊁硫化氢和蛋白胨水(靛基质)试验结果呈阴性(表1)㊂根据该菌株的形态学特征和生理生化特性,初步判定菌株RHVJ属于芽孢杆菌属(Bacillus)㊂图1㊀菌株RHVJ的菌落形态和菌体形态Fig.1㊀Colony morphology and micro-morphology of strain RHVJ67大连海洋大学学报㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第39卷表1㊀菌株RHVJ的生理生化特性Tab.1㊀Physiological and biochemical characteristics of the strain RHVJ生化项目biochemical item结果resultV-P试验V-P test+甲基红试验methyl red test+葡萄糖glucose+乳糖lactose淀粉amylum+葡萄糖酸盐gluconate赖氨酸lysine鸟氨酸ornithine山梨醇sorbitol+卫茅醇weimao alcohol尿素urea+水杨素salicin+枸橼酸盐(西蒙氏)citrate(Simmons)N-乙酰葡萄糖胺N-acetylglucosamine精氨酸双水解酶arginine dihydrolase+硝酸盐还原nitrate reduction+肌醇inositol蛋白胨水(靛基质)peptone water(indole)酒石酸盐tartrate硫化氢hydrogen sulfide七叶苷aescin+胆汁七叶苷bile aescinβ-半乳糖苷ONPG+明胶gelatin+㊀注:+表示阳性; 表示阴性㊂Note:+positive; negative.2.2㊀分子生物学特征以RHVJ基因组DNA为模板,通过16S rDNA 扩增获得大小为1411bp的基因片段(图2(a))㊂将扩增后测序所得序列在NCBI上进行Blast同源性比对,结果表明,菌株RHVJ与地衣芽孢杆菌标准菌株MH305331.1㊁NR074923.1基因序列的一致性为100%㊂用MEGA6.0软件构建系统发育树,结果显示,菌株RHVJ与地衣芽孢杆菌KR018738.1㊁MH305331.1和LN774355.1的亲缘关系最近,聚为一支(图3)㊂菌株RHVJ gyrB基因扩增所得的基因片段为1143bp(图2(b));将gyrB基因序列在NCBI 中进行比对,结果表明,菌株RHVJ与地衣芽孢杆菌CP038186.1㊁CP023729.1基因序列的一致性为100%㊂在系统发育树中,菌株RHVJ与地衣芽孢杆菌KF952577.1聚为一支(图4)㊂图2㊀菌株RHVJ的基因扩增电泳Fig.2㊀Electrophoresis of gene amplification of strainRHVJ图3㊀基于16S rDNA扩增序列构建的菌株RHVJ系统发育树Fig.3㊀Phylogenetic tree of strain RHVJ constructed by 16S rDNA amplification sequence图4㊀基于gyrB扩增序列构建的菌株RHVJ系统发育树Fig.4㊀Phylogenetic tree of strain RHVJ constructed by gyrB amplification sequence㊀㊀综合RHVJ菌落与菌体形态㊁生理生化特征及16S rDNA㊁gyrB序列分析结果,最终判定菌株RHVJ为地衣芽孢杆菌㊂77第1期徐振权,等:凡纳滨对虾肠道中地衣芽孢杆菌的分离鉴定及其生物学特性2.3㊀病原菌拮抗试验病原菌拮抗试验结果表明,地衣芽孢杆菌RHVJ对副溶血弧菌和维氏气单胞菌的生长具有抑制作用,抑菌圈直径分别为15㊁9mm,而对嗜水气单胞菌生长则无影响(表2)㊂表2㊀菌株RHVJ对指示菌的抑制效果Tab.2㊀Inhibition effect of strain RHVJ on indicator bacteria菌株strain抑菌圈直径/mm diameter of inhibition zone维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)9副溶血弧菌(Vibro parahaemolyticus)15嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)02.4㊀安全性试验安全性试验结果显示,对凡纳滨对虾注射不同浓度(1.0ˑ106㊁1.0ˑ107㊁1.0ˑ108CFU/mL)地衣芽孢杆菌RHVJ后,7d内均未引起虾死亡,表明菌株RHVJ对凡纳滨对虾具有安全性㊂2.5㊀耐受性试验2.5.1㊀胆盐耐受㊀从图5(a)可见,37ħ下恒温培养24h后,菌株RHVJ在胆盐质量浓度为0~ 1.2g/L的LB液体培养基中均具有增殖能力,但随着胆盐浓度的升高,菌株RHVJ的增殖能力减弱㊂其中,在胆盐质量浓度为0.2~0.6g/L条件下,RHVJ菌液浓度与对照组(0g/L)无显著性差异(P>0.05);在胆盐质量浓度为0.8~1.2g/L 条件下,RHVJ菌液浓度较对照组显著降低(P< 0.05)㊂2.5.2㊀pH耐受㊀从图5(b)可见,37ħ下培养24h后,与中性pH(pH7)条件相比,菌株RHVJ的增殖速率随pH的升高或降低均减小㊂其中,菌液终浓度在pH分别为5㊁7㊁9的培养环境中显著高于pH为1㊁3㊁11的培养环境(P< 0.05)㊂2.5.3㊀高温耐受㊀从图5(c)可见,经不同温度处理后的菌株RHVJ均可继续增殖,但其生长速率随处理温度的升高而受到明显抑制㊂与37ħ处理组相比,经过高温(70~90ħ)处理后的RHVJ 菌株培养24h后的终浓度显著降低(P<0.05);而37㊁50㊁60ħ处理组的菌液终浓度则无明显差异(P>0.05)㊂此外,高温处理菌液5㊁15min对其终浓度无显著性影响(P>0.05)㊂标有不同字母者表示组间有显著性差异(P<0.05),标有相同字母者表示组间无显著性差异(P>0.05)㊂The means with different letters are significantly different in the groups at the0.05probability level,and the means with the same letter are not significant differences.图5㊀菌株RHVJ耐受性试验Fig.5㊀Tolerance test of strain RHVJ2.6㊀菌株RHVJ的生长特性菌株RHVJ在27㊁32㊁37㊁42ħ温度条件下均可生长,其中,在27ħ条件下生长速率最快,细菌终浓度最高(图6(a))㊂菌株RHVJ在0~50盐度条件下均可生长,并可得到终浓度相近的菌液㊂其中,培养0~22h 时,菌株RHVJ在0~30盐度条件下生长速率较快,在40和50盐度条件下生长受到抑制(图6(b))㊂菌株在pH为4~10环境条件下均可生长,pH 为5~9时可得到终浓度相近的菌液㊂其中,当pH 为3时,该菌生长受到抑制;当pH分别为4㊁1087大连海洋大学学报㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第39卷时,细菌生长延滞期明显延长;当pH 为7时,该菌可获得最快生长速率(图6(c))㊂综上,当温度为27ħ㊁pH 为7㊁盐度为20时,菌株RHVJ 可获得最适生长环境㊂图6㊀菌株RHVJ 生长曲线Fig.6㊀Growth curve of strain RHVJ3㊀讨论3.1㊀菌株RHVJ 的分离鉴定水产动物胃肠道及养殖水环境是水产动物源益生菌筛选的主要来源[26]㊂本研究中,从健康凡纳滨对虾肠道中分离出一株高温耐受性强的菌株RHVJ,形态学观察结果显示,该菌具有芽孢杆菌属的关键表型特征[27],其生化特性与从奶牛瘤胃中筛选到的地衣芽孢杆菌[28]一致㊂随后,对菌株RHVJ 的16S rDNA 和gyrB 序列进行分析比对,结果显示,该菌基因序列与地衣芽孢杆菌一致性高达100%,在系统发育树上聚为同一分支㊂综合以上结果,可以确定本研究中分离到的菌株RHVJ 为地衣芽孢杆菌[29]㊂3.2㊀菌株RHVJ 对病原菌的拮抗作用近年来,细菌性疾病的暴发给凡纳滨对虾养殖业带来了不可估量的损失㊂因此,应用具有病原菌拮抗特性的益生菌对抗潜在病原体至关重要㊂研究表明,地衣芽孢杆菌可通过释放抗菌肽㊁溶菌酶㊁生物表面活性剂㊁细菌素和苯乙酸等物质抑制病原菌生长[30]㊂王建超[31]和黄晓东等[32]发现,分离自鲤(Cyprinus carpio )和中华绒螯蟹(Eriocheirsinensis )肠道的地衣芽孢杆菌对弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii )㊁金黄色葡萄球(Staphylococ-cus aureus )和嗜水气单胞菌的生长均有抑制作用㊂方卫东等[29]从海水养殖区底泥筛选到一株可产纤维素酶的地衣芽孢杆菌,该菌对溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus )㊁副溶血弧菌㊁哈维氏弧菌(Vibrio harveyi )㊁嗜水气单胞菌具有拮抗效果㊂本研究中,从凡纳滨对虾肠道中筛选得到的地衣芽孢杆菌RHVJ 为养殖对虾常见致病菌,对维氏气单胞菌和副溶血弧菌均表现出拮抗作用,提示其可用于预防及治疗维氏气单胞菌和副溶血弧菌感染引起的细菌性疾病㊂然而,菌株RHVJ 对嗜水气单胞菌生长未产生影响,这表明,在实际生产中使用不同配伍的益生菌混合制剂,可增强其对更广泛潜在病原体的抑制作用㊂3.3㊀菌株RHVJ 对凡纳滨对虾的安全性评价就益生菌应用而言,只有无毒素的候选菌种才应被考虑纳入益生菌使用范围,并且需要通过动物体内试验来进行安全性评价[33]㊂目前,芽孢杆菌属中的某些菌种已被作为益生菌添加到养殖动物饲料中,并已取得良好效果㊂尽管如此,从复杂微生物群落中分离出的细菌是否存在潜在致病性仍不容忽视,如从患病金鱼(Carassius auratus )肝脏内分离到的一株地衣芽孢杆菌,其产生的内毒素可引起金鱼嗜睡㊁厌食等症状[33]㊂因此,安全性试验是益生菌筛选及开发过程中的重要环节㊂安健等[34]将剂量为1ˑ105~1ˑ109CFU /g 的地衣芽孢杆菌HS140菌液注射至黄颡鱼(Tachysurus ful-vidraco )体内,7d 内未引起黄颡鱼死亡,表明该菌对黄颡鱼无致病性㊂本研究中,注射1ˑ106~1ˑ108CFU /mL 浓度的地衣芽孢杆菌RHVJ,7d 内未引起凡纳滨对虾死亡,表明该菌对凡纳滨对虾无致病性,具备在水产养殖中应用的安全性㊂97第1期徐振权,等:凡纳滨对虾肠道中地衣芽孢杆菌的分离鉴定及其生物学特性3.4㊀地衣芽孢杆菌RHVJ的耐受性及生长特性胃肠道内的胃液和胆汁可通过破坏细胞膜,进而引起DNA损伤的方式发挥其抗菌作用[35]㊂因此,具有耐消化道低pH和胆盐等不利环境因素能力的益生菌菌株才能在动物消化道中定植[36]㊂同时,在饲料制备过程中,添加到饲料中的益生菌菌株活性会受到高温制粒的影响,一些对高温敏感的菌株若未进行包被或其他工艺处理,可能会在饲料制粒过程中失活㊂因此,具有耐酸㊁耐胆盐和耐高温能力的益生菌菌株在实际生产和应用过程中可能会更好地发挥其益生作用㊂孟小亮[37]发现,分离自黄颡鱼肠道的地衣芽孢杆菌,在pH为2~4㊁胆盐质量浓度为0.15~0.60g/L㊁温度为90~100ħ的培养环境中仍可生长㊂分离自中华绒螯蟹的地衣芽孢杆菌对高温(90ħ)及弱酸(pH5)同样具有一定耐受性[38]㊂本研究中,地衣芽孢杆菌RHVJ 在酸性(pH为1~6)㊁高胆盐质量浓度(1.2g/L)及高温环境(90ħ)中仍可生长,表明该菌株可耐受胃肠道环境㊂本研究中,还对菌株RHVJ生长特性进行了研究㊂结果显示,RHVJ菌株在温度27ħ㊁pH7㊁盐度20的环境条件下生长良好㊂此外,尽管盐度(0~50)㊁pH(4~10)和温度(27~42ħ)等不同条件对地衣芽孢杆菌RHVJ的生长产生了一定影响,但培养48h后,该菌仍进行了增殖并获得了较高的终浓度,表明菌株RHVJ具有较好的环境适应性㊂同时,本试验结果为从凡纳滨对虾肠道分离出的地衣芽孢杆菌提供了一个相对优化的生长条件,为进一步研究该菌提供了有益参考㊂4㊀结论1)从凡纳滨对虾肠道中筛选出一株菌株RHVJ,经鉴定为地衣芽孢杆菌㊂2)菌株RHVJ具体外抑菌能力,对凡纳滨对虾无致病性,安全性良好㊂3)菌株RHVJ具耐高温㊁耐胆盐和耐酸性能,表明该菌可耐受胃肠道环境㊂本研究结果丰富了水产益生菌候选菌株的种类,为凡纳滨对虾微生态制剂的开发与应用提供了科学依据㊂参考文献:[1]㊀MOSS S M,MOSS D R,ARCE S M,et al.The role of selectivebreeding and biosecurity in the prevention of disease in penaeidshrimp aquaculture[J].Journal of Invertebrate Pathology,2012, 110(2):247-250.[2]㊀LI F H,XIANG J H.Recent advances in researches on the innateimmunity of shrimp in China[J].Developmental and Comparative Immunology,2013,39(1/2):11-26.[3]㊀GROSS PS,BARTLETT T C,BROWDY C L,et al.Immune genediscovery by expressed sequence tag analysis of hemocytes and hepatopancreas in the Pacific white shrimp,Litopenaeus vannamei, and the Atlantic white shrimp,L.setiferus[J].Developmental and Comparative Immunology,2001,25(7):565-577.[4]㊀黄新新,莫胜兰,陆承平.RT-PCR法检测我国东南沿海凡纳滨对虾的桃拉综合征病毒[J].中国病毒学,2005,20(5):546-548.㊀㊀㊀HUANG X X,MO S L,LU C P.RT-PCR detection of Taura syn-drome virus in Penaeus vannami from southeast seaside of China [J].Virologica Sinica,2005,20(5):546-548.(in Chinese) [5]㊀张娜,谢艳辉,袁俊杰,等.传染性皮下及造血器官坏死病毒诱导南美白对虾抗白斑综合征病毒感染的初步研究[J].中国动物检疫,2016,33(11):94-97.㊀㊀㊀ZHANG N,XIE Y H,YUAN J J,et al.A preliminary study on in-duced resistance to white spot syndrome virus infection in Penaeus vannamei through pre-infection with infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus[J].China Animal Health Inspection, 2016,33(11):94-97.(in Chinese)[6]㊀施礼科,叶键,王力,等.一例南美白对虾十足目虹彩病毒来源初探[J].科学养鱼,2022(12):56-57.㊀㊀㊀SHI L K,YE J,WANG L,et al.Preliminary study on the source ofa case of Penaeus vannamei decapod iridovirus[J].Scientific FishFarming,2022(12):56-57.(in Chinese)[7]㊀吴俊敏,王艺,郝婧薇,等.湛江地区患病对虾池塘中副溶血性弧菌的MLST分型和新型耐药毒株的分离鉴定[J].大连海洋大学学报,2023,38(1):59-67.㊀㊀㊀WU J M,WANG Y,HAO J W,et al.MLST typing of Vibrio parah-aemolyticus from diseased shrimp ponds in Zhanjiang area and iso-lation and identification of novel drug-resistant strains[J].Journal of Dalian Ocean University,2023,38(1):59-67.(in Chinese) [8]㊀ZHOU H H,GAI C L,YE G F,et al.Aeromonas hydrophila,an e-merging causative agent of freshwater-farmed whiteleg shrimp Litopenaeus vannamei[J].Microorganisms,2019,7(10):450. [9]㊀李文珍,王洪奇,王俊义,等.中国对虾红腿病致病菌的研究[J].水产科学,1992,11(6):1-6.㊀㊀㊀LI W Z,WANG H Q,WANG J Y,et al.Studies on pathogenic bacterium of Chinese prawn(Penaeus orientalis) red-leg disease [J].Fisheries Science,1992,11(6):1-6.(in Chinese) [10]㊀彭张明,陈妃业,蒲桂川.对虾肝胰腺微孢子虫病与虾肝肠胞虫关系的研究进展[J].水产学杂志,2020,33(5):74-81.㊀㊀㊀PENG Z M,CHEN F Y,PU G C.Research progress on relation-ship between hepatopancreatic microsporidiosis and Enterocytozo-on hepatopenaei in penaeid shrimp:a review[J].Chinese Journalof Fisheries,2020,33(5):74-81.(in Chinese) [11]㊀周丽,宫庆礼,俞开康.人工越冬对虾拟阿脑虫病病理组织观察[J].海洋湖沼通报,1997(1):33-37.㊀㊀㊀ZHOU L,GONG Q L,YU K K.Observations on the histopathology08大连海洋大学学报㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第39卷of a systemic ciliate(Paranophrys carcini spiralis)disease in theover-wintering prawn,Penaeus chinensis[J].Transaction of Oce-anology and Limnology,1997(1):33-37.(in Chinese) [12]㊀石彭灵,刘兰海,杨品红,等.凡纳滨对虾感染纤毛虫期间对环境因子的响应[J].湖南文理学院学报(自然科学版),2022,34(1):26-30,74.㊀㊀㊀SHI P L,LIU L H,YANG P H,et al.Response of environmental factors to Litopenaeus vannamei infected with Ciliates in freshwa-ter culture[J].Journal of Hunan University of Arts and Science(Nature Science Edition),2022,34(1):26-30,74.(in Chi-nese)[13]㊀BRUGMAN S,IKEDA-OHTSUBO W,BRABER S,et al.A com-parative review on microbiota manipulation:lessons from fish,plants,livestock,and human research[J].Frontiers in Nutrition,2018,5:80.[14]㊀WU Z B,QI X Z,QU S Y,et al.Dietary supplementation of Bacil-lus velezensis B8enhances immune response and resistance againstAeromonas veronii in grass carp[J].Fish&Shellfish Immunolo-gy,2021,115:14-21.[15]㊀VANAKI P,ZABOLI F,KABOOSI H,et al.Isolation and identifi-cation of keratinolytic probiotic Bacillus licheniformis bacteriafrom the soil below poultry slaughterhouse waste[J].BrazilianJournal of Biology,2022,84:e257473.[16]㊀VINOJ G,VASEEHARAN B,THOMAS S,et al.Quorum-quench-ing activity of the AHL-lactonase from Bacillus licheniformisDAHB1inhibits Vibrio biofilm formation in vitro and reducesshrimp intestinal colonisation and mortality[J].Marine Biotech-nology,2014,16(6):707-715.[17]㊀DINDHORIA K,KUMAR S,BALIYAN N,et al.Bacillus licheni-formis MCC2514genome sequencing and functional annotationfor providing genetic evidence for probiotic gut adhesion proper-ties and its applicability as a bio-preservative agent[J].Gene,2022,840:146744.[18]㊀刘波,刘文斌,王恬.地衣芽孢杆菌对异育银鲫消化机能和生长的影响[J].南京农业大学学报,2005,28(4):80-84.㊀㊀㊀LIU B,LIU W B,WANG T.Effects of Bacillus licheniformis on di-gestive performance and growth of allogynogenetic crucian[J].Journal of Nanjing Agricultural University,2005,28(4):80-84.(in Chinese)[19]㊀刘强强,陈旭,谢家俊,等.饲料或养殖水体中添加地衣芽孢杆菌对凡纳滨对虾生长性能和免疫力的影响[J].动物营养学报,2017,29(8):2808-2816.㊀㊀㊀LIU Q Q,CHEN X,XIE J J,et al.Effects of adding Bacillus li-cheniformis to diet or aquaculture water on growth performanceand immunity of Litopenaeus vannamei[J].Chinese Journal ofAnimal Nutrition,2017,29(8):2808-2816.(in Chinese) [20]㊀孙博超,杨运楷,李玉宏,等.饲料中添加复合芽孢杆菌对凡纳滨对虾抗病毒感染能力及抗病基因表达的影响[J].渔业科学进展,2019,40(3):113-121.㊀㊀㊀SUN B C,YANG Y K,LI Y H,et al.Effects of single or mixed Bacillus on WSSV infection and immune-related gene expressionin Litopenaeus vannamei[J].Progress in Fishery Sciences,2019,40(3):113-121.(in Chinese)[21]㊀张碧云,杨红玲,汪攀,等.鱼类肠道微生物与宿主免疫系统相互作用研究进展[J].微生物学报,2021,61(10):3046-3058.㊀㊀㊀ZHANG B Y,YANG H L,WANG P,et al.Advances in the inter-actions between intestinal microorganisms and host immune sys-tem in fish[J].Acta Microbiologica Sinica,2021,61(10):3046-3058.(in Chinese)[22]㊀黄培堂.分子克隆实验指南(精编版)[J].生物技术通讯,2008,19(6):865.㊀㊀㊀HUANG P T.Guide to molecular cloning experiment(refined edi-tion)[J].Letters in Biotechnology,2008,19(6):865.(in Chi-nese)[23]㊀布坎南R E.伯杰细菌鉴定手册:第9版[M].北京:科学出版社,1995.㊀㊀㊀BUCHANAN R E.Berger s Handbook of Bacterial Identification: 9th edition[M].Beijing:Science Press,1985.(in Chinese) [24]㊀罗璋,陈昌福,白晓慧,等.枯草芽孢杆菌BHI344培养条件的优化[J].中国饲料,2007(10):41-43.㊀㊀㊀LUO Z,CHEN C F,BAI X H,et al.Optimization of Bacillus subti-lus BHI344cultivation conditions[J].China Feed,2007(10):41-43.(in Chinese)[25]㊀马绪荣,苏德模.药品微生物学检验手册[M].北京:科学出版社,2000.㊀㊀㊀MA X R,SU D M.Handbook of microbiological examination of drugs[M].Beijing:Science Press,2000.(in Chinese) [26]㊀HAI N V.The use of probiotics in aquaculture[J].Journal of Ap-plied Microbiology,2015,119(4):917-935.[27]㊀倪鑫鑫,龚海燕,马顶虹,等.芽孢杆菌生理生化特性分析[J].安徽农学通报,2015,21(7):47-48,58.㊀㊀㊀NI X X,GONG H Y,MA D H,et al.Analysis of physiological and biochemical characteristics about Bacillus[J].Anhui AgriculturalScience Bulletin,2015,21(7):47-48,58.(in Chinese) [28]㊀李畅洋,高炳南,任雨龙,等.牛瘤胃微生物的分离鉴定与生化特性分析[J].中国畜牧兽医,2022,49(5):1757-1764.㊀㊀㊀LI C Y,GAO B N,REN Y L,et al.Isolation,identification and bi-ochemical characteristics analysis of bovine rumen functional bac-teria[J].China Animal Husbandry&Veterinary Medicine,2022,49(5):1757-1764.(in Chinese)[29]㊀方卫东,唐旭,刘源森,等.一株海洋生境芽孢杆菌FA08的筛选㊁鉴定及其酶学特性和抗菌性能分析[J].海洋与湖沼,2015,46(5):1228-1234.㊀㊀㊀FANG W D,TANG X,LIU Y S,et al.Screening and identifica-tion,enzyme characteristics,and antibacterial activity of a marineBacillus strain fa08[J].Oceanologia et Limnologia Sinica,2015,46(5):1228-1234.(in Chinese)[30]㊀何李黎.地衣芽孢杆菌ZJU12所产细菌素的分离纯化及其理化性质和基因克隆的研究[D].杭州:浙江大学,2006.㊀㊀㊀HE L L.Isolation and purification of bacteriocin produced by Ba-cillus licheniformis ZJU12,and study on its physicochemical prop-erties and gene cloning[D].Hangzhou:Zhejiang University,2006.(in Chinese)[31]㊀王建超.芽孢杆菌的筛选鉴定及对鲤鱼免疫和消化功能影响[D].长春:吉林农业大学,2016.18第1期徐振权,等:凡纳滨对虾肠道中地衣芽孢杆菌的分离鉴定及其生物学特性。
传染性皮下及造血组织坏死病毒对南美白对虾仔虾的人工感染研究
鲁东大学学报(自然科学版)Journal of Ludong University"Natural Science Edition)2021,37(2)：151—156传染性皮下及造血组织坏死病毒对南美白对虾仔虾的人工感染研究王静静，于吉悦，侯子豪，常林瑞，李婷，闫冬春(鲁东大学农学院，山东烟台264039)摘要:传染性皮下及造血组织坏死病毒"IHHNV)是危害对虾养殖产业的重要病原之一，其分布广泛,危害性大，感染性强，给对虾养殖造成巨大的经济损失(IHHN V对宿主的致病性与宿主的年龄、大小密切相关。
本文通过人工投喂的方式对健康南美白对虾仔虾进行室内感染实验，运用普通PCR、荧光定量PCR检测IHHNV感染情况及病毒载量，结果表明仔虾能够通过人工投喂的方式感染IHHNV,且IHHNV感染率为43.3%，病毒载量最高为28.7copies-'g-DNA，此实验结果可为南美白对虾人工养殖中IHHNV的有效防治提供理论依据。
关键词:传染性皮下及造血组织坏死病毒;南美白对虾仔虾;人工感染中图分类号:S9文献标志码:A文章编号：1673-8020(2021)02-0151-06传染性皮下及造血组织坏死病毒"Infectious hypodeemaeand haema iopo oe ioc nec eos os eoeus，IHH-NV)是一种危害严重且分布广泛的对虾病毒，它是已知最小的对虾病毒，具有4.1kb的线性单链DNA分子[1](IHHNV在世界许多国家都有报道，如墨西哥、澳大利亚、新加坡、马来西亚、泰国、印度尼西亚、菲律宾、印度、韩国、巴西、阿根廷、委内瑞拉等[2—3](自2001年以来，中国沿海地区的对虾和蟹中均检测到IHHNV*4近年来，IHHNV在广东、广西、海南、上海、浙江等省份的对虾养殖业中普遍存在*5—8](IHHNV可感染大多数野生和养殖虾，包括细角滨对虾((”a€us stylirostris)、南美白对虾(Pemeus/””am))和罗氏沼虾(MacroQrachium rose^ergH)等。
RT-PCR技术在凡纳滨对虾健康苗种培育中的应用
从海南南疆 生物科技有限公司对虾育苗厂采 集到亲虾 、 、 卵 无节幼体 、 水体 、 亲虾饵料 、 仔虾 、
丰年虫和虾苗等一些待测样品，冰冻后带回宁波 ，
ＴＶ Ｓ 是养殖凡纳滨对虾中最常见 、 危害最严重的急
性传染病 ， １ 是 种单链Ｒ Ａ Ｎ 病毒 ， 在我国有一定的 流行趋 势 ，可导 致 ８％一 ５ ０ ９％的 累积死 亡率 【 ． ６ ＇ ＩＨ Ｖ 已知对虾病毒 中最小的 １ ， ＨＮ 是 种 为单链Ｄ Ａ Ｎ 病毒， 能感染凡纳滨对虾 ， 但对它有一定的抵抗性 ， 并不引起凡纳滨对虾 明显的死亡 ，被 陧性感染后，
上 ，随着对虾及相关产 品进 出口贸易的 日益增多 ，
这些病毒作为主要病原体 已经在世界各地养虾地
检测技术有很多的研究 ，主要集 中在 ＷＳ Ｖ 的研 Ｓ
究上 ， ＩＨ 而 Ｈ ＮＶ和 Ｔ Ｖ的检 测技术 研 究相对 较少 ， Ｓ
区出现 ， 从它们以前和 目前的致病情况 以及将来潜
在 的危害看 ，只有 白斑病 毒（ ｓ ） ｗｓ ｖ 、托拉病 毒
１ 中可看出 ， Ｓ ＷＳ Ｖ阳性对照扩增出 １ 条大约 ３０ ｐ ０ ｂ 的 Ｄ Ａ片段 ； Ｎ 虾苗（ 宁波） Ａ、虾苗（ 宁波） Ｂ和丰年 虫 Ａ 等抽提到 的样品和阳性对照一样扩增 出 １ 条 ３ ０ ｐ Ｄ Ａ片段 ， ０ｂ的 Ｎ 说明这 ３ 个样品有 ＷＳ Ｖ感 Ｓ 染 ；其余样品和 阴性对照 一样未见有扩增产物带 ， 说明这些样品没有被 ＷＳ Ｖ感染． Ｓ 各样品检测 ＩＨ Ｖ 的 Ｐ Ｒ扩增结果见 图 ２ Ｈ Ｎ Ｃ ． 图 ２中可看出 ，Ｉ Ｈ Ｖ阳性对照扩增出 １ Ｈ Ｎ 条大约 ２ ６ ｐ的 Ｄ Ａ 片段 ；虾苗（ ４ ｂ Ｎ 宁波） Ａ抽提到的样 品 和阳性对照一样扩增出 １ ２ ６ ｐ Ｄ Ａ片段 ， 条 ４ｂ 的 Ｎ 说明该虾苗已有 Ｉ Ｈ Ｖ感染 ；其余样品和阴性对 Ｈ Ｎ 照一样未见有扩增产物带 ，说明这些样品没有被
凡纳滨对虾Rab6A基因的克隆及表达
（ ．Ｃ ｌ ｇ ｆ Ａｎｍａ ｃｅ ｃ ｎ ｅｈ ｏｏ ｙ，Ｈｅ ａ ｉｅ ｓ ｙ ｏ ｃｅ ｃ ｎ ｃ ｏ ｏ ｙ，Ｈｅ ａ Ｌ ｏ ａ ｇ，４ １ ０ ，Ｃ ｉａ； １ ｏ ｌ ｅ ｉ ｌＳ ｉ ｅａ ｄ Ｔ ｃ ｎ ｌｇ ｅ ｏ ｎ ｎ ｎＵｎｖ ｒ ｉ ｆ Ｓ ｉｎ ｅａ ｄ Ｔｅｈ ｌｇ ｔ ｎ ｎ， ｕ ｙ ｎ ７０ ３ ｈｎ ２ Ｃ ｌｅ ｅｏ ． ｏ ｌｇ ｆＭｅ ｉａ ｅｈ ｏ ｏ ｙ ａ ｄ Ｅ ｇ ｎ ｅｉ ｇ， ｎ ｎＵ ｉ ｅｓｔ ｆ Ｓ ｉ ｃ ａ ｄ Ｔ ｃ ｏｏ ｙ，Ｈｅ ａ ，Ｌ ｏ ａ ｇ， ７ ０ ３ Ｃ ｉａ ｄ ｃ ｌＴ ｃ ｎ ｌｇ ｎ ｎ ｉ ｅｒｎ Ｈｅ ａ ｎ ｖ ｒｉ ｏ ｃ ｎ ｅ ｎ ｅ ｈ ｌｇ ｙ ｅ ｎ ｎ ｕ ｙ ｎ ４ １ ０ ， ｈｎ ）
Ｒａ ６ 基 因的部分 ｃ ＮＡ 序 列 ， 开放 阅读框 为 ４ ２ｂ ， ｂＡ Ｄ 其 ４ ｐ 可编码 １ ７个氨基 酸 ， 算其 分子质 量约 为 １ ． ７ ４ 推 ６９ ７
ｋ ， 论等 电点 为 ４ ８ ８ Ｒ ｂ Ａ 与其他 物 种的 Ｒ ｂ基 因比对发 现 ， ｕ理 ．２ ， ａ ６ ａ 该基 因氨 基 酸序 列 具有 较 高 的保 守性 。
凡纳滨对虾IRAK-4基因克隆及功能研究的开题报告
凡纳滨对虾IRAK-4基因克隆及功能研究的开题报告一、选题背景凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）是重要的经济水产品之一，其产量在全球居前列。
但由于环境污染、疾病导致的死亡率等问题，对虾养殖业一直面临着重大挑战。
因此，研究凡纳滨对虾免疫系统并提高其抗病能力，对于探索虾类免疫机制和保障养殖业的可持续发展具有重要意义。
免疫应答是维持动物身体健康的重要保障之一。
其中，细胞因子介导的信号转导通路对于免疫应答的传递起到关键作用。
IRAK-4是Toll/IL-1R信号转导通路中的重要成员，通过磷酸化等方式参与信号转导过程，调节免疫应答。
目前，对于凡纳滨对虾免疫系统的研究仍然相对薄弱。
因此，本文选择针对IRAK-4基因进行克隆和功能研究，旨在探索凡纳滨对虾免疫机制的分子基础，并为提高虾类抗病能力提供参考。
二、研究内容和方法（一）IRAK-4基因克隆1.设计特异性引物，从凡纳滨对虾全长cDNA文库中扩增IRAK-4基因全长序列；2.克隆PCR产物并纯化，构建克隆载体；3.进行序列分析，获得IRAK-4基因序列。
（二）IRAK-4基因表达分析1.通过RT-PCR技术，检测IRAK-4基因在不同组织中的表达情况；2.利用qPCR技术，探究IRAK-4基因在感染病原体后的表达变化。
（三）IRAK-4基因功能研究1.利用RNA干扰技术或基因编辑技术，降低或消除IRAK-4基因在凡纳滨对虾中的表达；2.检测凡纳滨对虾免疫应答的变化，并进行相关分析。
三、预期成果1.成功克隆IRAK-4基因全长序列，获得凡纳滨对虾IRAK-4基因的核苷酸序列数据库；2.分析IRAK-4基因表达情况，探究其在凡纳滨对虾免疫应答中的作用；3.通过RNA干扰或基因编辑技术对IRAK-4基因进行功能研究，探索凡纳滨对虾免疫机制的分子基础。
四、研究意义1.通过克隆和表达分析等技术手段，深入探究了凡纳滨对虾IRAK-4基因的分子结构和免疫调控机制，具有推进虾类免疫系统研究的重要作用；2.通过RNA干扰和基因编辑技术，探究了IRAK-4基因对凡纳滨对虾免疫应答的影响，对于优化养殖管理策略和提高养殖效益具有重要意义。
凡纳滨对虾白斑综合征病毒防治研究进展(一)
凡纳滨对虾白斑综合征病毒防治研究进展（一）凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）俗称南美白对虾，原产地南美洲，具有广盐性、生长快、适合高密度养殖等特点，是世界三大对虾养殖品种之一，其养殖产量已达到我国养殖对虾总产量的80%以上（中国渔业统计年鉴,2017）。
然而对虾养殖业养殖强度的扩大和养殖环境的恶化给凡纳滨对虾病害的控制带来了极大的挑战。
白斑综合征病毒（white spot syndrome virus，WSSV），1992年首次发现于中国台湾，随后相继在亚洲各国的对虾养殖区域发现了该病毒。
WSSV 在世界对虾养殖业中广泛且快速的传播，造成了全球范围内水产养殖业的巨大经济损失。
WSSV具有强致病力、强传染性、短病程、高毒性的特点，可感染40多种甲壳纲动物以及水生浮游动物，感染后死亡率高（80%~100%） 。
在20世纪90年代，联合国粮农组织（FAO）、国际兽医局（OIE）以及亚太地区水产养殖发展网络中心（NACA）已将WSSV列为需要报告的严重水生动物病毒之一。
生物的免疫系统主要分为先天免疫系统（innate immune system）和获得性免疫系统（adaptive immune system）。
先天性免疫系统中存在一些先天免疫识别分子也称为模式识别受体（pattern recognition receptor，PRR），可以识别病原相对保守的相关病原模式分子（PAMPs）。
细菌、病毒和真菌的相关病原模式分子（PAMPs）主要存在于一些脂多糖、脂蛋白、单链RNA和双链DNA中。
目前已经发现了几种模式识别受体（PRRs）包括Toll和TLRs、NLRs、RLRs、CLRs。
凡纳滨对虾属于无脊椎动物，体液中不具有免疫球蛋白，缺乏抗体介导的获得性免疫反应，其主要依靠物理防御、细胞免疫和体液免疫抵抗外界病原。
细胞免疫包括吞噬作用、结节形成以及整合素介导的信号转导，而体液免疫包括proPo 级联反应、凝血反应、抗菌肽（AMPs）、凝集素、唐氏综合征细胞粘附分子（Dscam）、Toll和IMD通路，这些分子直接或间接触发一系列防御反应。
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１ ２ １ 实验 动物 分 组 试 验 于 广 西水 产 研 究 所水 ．
２ Ｏ℃保 存 备用 。
族 馆 中进 行 。水 族 馆 中现有 ６组 试 验水 槽 ， 规格 其 是 ５ｃ ０ ｍ×４ ｃ ０ ｍ×８ ｃ 配备水 循环 消毒 、 滤 和充 ０ ｍ， 过 气装 置 系统 ， 验分 ４批 进行 ， 试 每次试 验分 试验 组 和
Ａｂ ｔ ａ ｔ ０ｒ ｉ ｆ ｏ ｔ ｌｃ ｒ ｅ ｓ ｃ ｏ ｅｙ ｒ ｌ ｔ ｄ ｔ ｒ ｉ ｍｏ ｉ ｎ Ｔｈ ｅ ｅ ｒ ｈ ｐ ｏ ｕ ｅ ｅ ｒ ｓ ｉ ｎ ｒ ｔ ｓｒ ｃ ： ｂ ｔ ｒ ｎ ａ ｏ ｔ ｘ ｉ ｌ ｓ ｌ ｅ ａ ｅ Ｏ ｂ ａｎ ｅ ｔ ． ｏ ｏ ｅ ｒ ｓ ａ ｃ ｒ ｄ ｃ ｄ ｄ ｐ ｅ ｓｏ ａ ｍｏ ｅ ｈ ｏ ｇ ｗｉ ｍｉ ｇ ｍ ａｎ ｙ ｆ ｒ ｅ ｎ ｂ ｅ ｖ ｄ Ｆｏ ｘ ｒ ｓ ｉ ｎ ｉ Ｃ ａ ｄ ｏ ｈ ｒ ｂ ａｎ ａ ｅ ｓ ｂ ｍ— ｄ ｌ ｒｕ ｈｓ ｍ ｔ ｎ ｉ ｌ ｏ ｃ ｄ ａ ｄ ｏ ｓ ｒ ｅ ｓ ｅ ｐ ｅ ｓｏ ｎ ＯＦ ｎ ｔ ｅ ｒ ｉ ｒ ａ ｙ ｉ ｍｕ ｏ ｉｔ ｃ ｅ ｓ ｒ ｅ ｈ ｄ Ｉ ｒ ａ ｉ ｉ ｅ ｏ ｒ ｖ ａ ｈ ｕ ｃ ｉ ｎ ｏ Ｃ ａ ｅ ｎ ｔ ｅ ｐ ｔ ｏ ｏ ｙ ｏ ｎ ｈ ｓ ｏ ｈ ｍｉ ｔ ｙ ｍ ｔ ｏ ． ｔ ｐ ｉ ｒ ｙ ａ ｍ ｄ ｔ ｅ ｅ ｌ ｔ ｅ ｆ ｎ ｔ ｆ ＯＦ ｒ ａ ｉ ｈ ａ ｈ ｌ ｇ ｆ ｍ ｌ ｏ
现 １ ４个家 系的对虾 未感 染 Ｉ ＨＨＮＶ 的 比率 ７ ． ～９ ． ； 合 两种 方 法可 快速 、 ９３ ６７ 联 灵敏 、 异地 检 测 出对 特
虾 感染 Ｉ ＨＨＮＶ 的状 况。试验 结果 为对虾 流行病 调 查 、 康 养 殖及 无特 定病 原 （ Ｐ ） 群 选 育提供 了有 效 健 ＳＦ种
毒选 育工 作提供 基础 。
４ ０ ｇ ｍＬ ， 分 混 匀后 放 入 ５ ０ ／ ） 充 ６℃水 浴 锅 中 温浴
５ｈ 取 出冷却 至 室温 ， 入 ３ ０ Ｌ ６ｍｏ／ ； 加 ０ ｌＬ氯化 钠
溶液 ， 振荡 混匀 ２ｒｉ ，００ ０ｒｍｉ离心 １ ｉ ， ｎ １ ０ ／ ｎ ａ ５ｒ ｎ 取 ａ
２ Ｓ ｈ ｏ ｆＬ ｆ ｃｅ ｃ ， ａ ｚ ｏ ｎ ｖ ｒ ｉ Ｌ ｎ ｈ ｕ ， ａ ｓ ， ３ ０ ０ Ｃ ｉ ａ ． ｃｏ ｌ ｏ ｉ ｅＳ ｉｎ ｅ Ｌ ｎ ｈ ｕＵ ｉ ｅ ｓ ｙ， ａ ｚ ｏ Ｇ ｎ ｕ ７ ０ ０ ， ｈ ｎ ： ｔ
３ Ｃ ｌｅ ｅ ｆ Ｌｉ ｅＳ ｉ ｃ ，Ｓ ａ ｎ ｉ ｒ ａ ｎ ｖ ｒ ｉ Ｘ ， ｈ ａ ｘ ， １ ０ ２ Ｃ ｉ ａ ． ｏｌｇ ｆ ｃｅ ｅ ｈ ａ ｘ ｏ ｎ Ｎｏ ｍ ｌＵ ｉｅ ｓ ｙ， ｔ Ｓ ａ ｎ ｉ７ ０ ６ ， ｈ ｎ ）
赵 永 贞 陈 秀荔 ， 文伦 ， 春 玲 彭 敏 陈 晓汉 ¨ ， 辛 杨 ， ，
（．广 西壮 族 自治 区水 产 研 究 所 ， 西南 宁 ５ ０ ２ ；． 西 大 学 ， 西 南 宁 ５０ ２ ） １ 广 ３０１２广 广 ３ ０ １
摘
要： 对虾 传 染性皮 下及 造血组 织坏 死病毒 （ＨＨＮＶ） Ｉ 可导致凡 纳滨 对虾 罹 患慢 性矮 小残缺 综 合征 ，
对 照 组 ， 照 组 设 置 １组 ， 验 组 设 置 ５组 ， 组 设 对 试 每
对虾 传染 性 皮下 及 造 血 组 织 坏 死病 ， 称慢 性 也 矮 小 残 缺 综 合 征 （ ｕ ｔ ｅｏｍｉ ｓｎ ｒｍｅ Ｒ ｎ— ｆｒ ｔ ｙ ｄｏ ， ｄ ｙ
Ｒ Ｓ 。水生 动物疾 病 诊 断 手 册 中将 该 病 定 为 须 报 Ｄ ）
水质 恶化 ， 产 生低溶 氧 、 会 高水温 、 氨 氮 、 硝酸 盐 高 高 等情 况 ， 发低 水 平 感染 Ｉ 激 ＨＨＮＶ 的对 虾 表 现 出症
赵 永 贞 等 ： 纳滨 对 虾 抗 传 染 性 皮 下 及 造 血 组 织 坏 死病 毒 感 染 的 初 步 研究 凡
５ ５
同个体对 该病 毒 的抵抗 性 。该研究 将对 于 常规 而简
碎 后 加 入 １ Ｌ ２ ／ ２ ０ｍｇ ｍＬ蛋 白 酶 Ｋ （ 浓 度 终
单 的检测 Ｉ ＨＨＮＶ 提供 一 个试 验 依 据 ， 同时 也 为 提 早 发现和 确定对 虾 是否感 染病 毒 ， 时采 取措 施 ， 及 减 少 不必要 的经 济损 失 提供 技 术 支 持 ； 同时 也 为 抗病
该 病毒不 能 引起 南 美 白对 虾 大 量 的 死亡 ， 引 起对 只 虾 生长缓 慢 ， 成 巨大 的 经 济 损 失 。Ｉ 造 ＨＨＮＶ 粒 子 直 径为 ２ ｍ， ２ｎ 无囊 膜 ， Ｏ面 体 ， 性 单 链 Ｄ ２ 线 ＮＡ， 长 度 为 ４ １ｋ ， ． ｂ 根据 形 态 学及 生 物化 学等 特 性将 其 分 类 为细小 病毒科 病毒 ＿ 。 ２ ］
引起 对 虾 的 产 量 降 低 、 济 效 益 下 降 ， 对 虾 的 养 殖 业 危 害严 重 。本 试 验 通 过 于 第 ３腹 节 肌 肉注 射 经 对 １０／ ／ ＨＨＮＶ 的方 法对 不 同家 系的对 虾 攻毒 ， 合 应 用 Ｐ Ｒ和 组 织病 理 学检 测 并鉴 定 病 毒 。结 果发 ０ ， ｇＩ Ｌ 联 Ｃ
上清 至 另 一 离 心 管 。加 入 等 体 积 预 冷 异 丙 醇 ， 在
一
１ 材 料 与 方 法
１ １ 材 料 ．
８ Ｏ℃ 放 置 １ ｉ 。 随 后 １ ０ ／ ｉ 离 心 ５ｒｎ ａ ４ ０ ０ ｒｒ ｎ ａ
５ｒｉ， 淀用 ７ ０ｍＬ Ｌ洗 涤２次 ～３ ； ｎ沉 ａ ０ ／ 次 自然 干燥 后 ， 入 １ ０ Ｌ灭 菌 ｄ Ｈ２ 加 人 １ Ｌ １ ／ 加 ０ ｄ Ｏ， ０ｍｇ ｍＬ 胰 ＲＮＡ酶 ３ ７℃水 浴 ３ ｉ， ／ ０ｒ ｎ ８ｇ Ｌ的琼 脂 糖凝 胶 ａ 电泳检 测基 因 组 ＤＮＡ 的纯 度 ， 紫 外 分 光 光 度 计 用
法估 计 含 量， 释 Ｄ 稀 ＮＡ 样 品 至 ５ ｇ ｕ 置 ０ｎ ／ Ｌ，
一
健 康 的南美 白对 虾来 自广西 水产 研究所 广 西 国 家级南 美 白对 虾 育 种 中 心 ， 选 体 重 为 １ ３ ～ 筛 ． ５ｇ
１ ５ ，０个家 系 ８ ０尾对 虾为试 验所 需对 虾 。 ． ５ｇ ２ ４
告 的 甲壳类 其他 重要 疾病 之一 ［ 。其 病原 为对 虾 传 １ ］ 染性 皮下及 造血 组 织 坏死 病毒 （ｎ ｅｔ ｕ ｙ ｏ ｅ— Ｉｆｃｉ ｓｈ ｐ ｄ ｒ ｏ
ｅ ｌａ ｄ ｈ ｅ ｔ ｐ ｉｔｃ ｎ ｃ ｏ ｉ ｉｕ ，Ｉ ＨＮＶ ） ｒ ａ ｎ ａ ｍａ ｏ ｏｅｉ ｅ ｒ ｓｓ ｖｒ ｓ Ｈ ，
作 者 简 介 ： 永 贞（９ ８ ） 男 ， 肃 张 掖 人 ， 士 ， 要 从 事 对 虾 的 遗 传 育种 工 作 。 ＊通 讯 作 者 赵 １７一 ， 甘 博 主
料 料 豢 ｛
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随着养 殖水 体 中养 殖密 度 的不 断扩 大而 造成 的
下一 代 和其 他 种 群Ｌ ］ ４ 。研 究 者 已经 采 用 抑 制 性 消
减杂 交 的方法 寻 找差 异 表 达 基 因 ， 这将 为进 一 步探 讨致 病机理 提供 了参 考［ 。 ６ ］
本研 究 通 过 室 内 水 族 箱 攻 毒 试 验 ， 合 应 用 联
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的检 测 手 段 。
关键 词 ： 纳滨 对虾 ； 染 皮 下及 造血 组 织坏死病 毒 ； 凡 传 聚合 酶链反 应
中 图分 类 号 ： ８ ２ ６ ； ９ ５ ４ ￥ ５ ． ５ ￥ ４ ． 文献 标 识 码 ： Ａ 文 章 编 号 ：０ ７ ５ ３ （ ０ ０ １ — ０ ４０ １ ０—０ ８ ２ １ ）００ ５—４