引物的设计

举例
3. 硒对大鼠睾丸SelV的表达影响：对照组/硒饲养组
检测类型：mRNA 高等生物：单一序列 背景知识：1. DNA量多，结构稳定 2. mRNA量少，易降解 3. 引物设计要尽量跨内含子，消除DNA影响 4. mRNA从3’开始反转录为cDNA， 对>1000bp 的mRNA的5’反转效率差
引物：是PCR扩增产物开端部分，被消耗完


dNTPs：是PCR扩增产物后续部分，被消耗完
10*PCR（Mg2+）：缓冲能力降低或失效

Taq酶：反复高温循环，催化能力降低或失效
PCR是一个复杂、竞争、动态的过程
1. 引物+正确的模板位置 2. 引物+错误的模板位置（错配） 3. 引物自身的发夹（hairpin）结构 4. 引物自身的二聚体（dimer）结构 5. 上、下游引物之间的相互作用 好的引物设计，就是保1的绝对优势，减少2-5干扰
上游引物 下游引物 目的片段
设置完成 → 点击OK ，出现新对话框
点击OK → 出现新对话框search result
ΔG值为负值，说明热稳定性高，结合紧密
ΔG值最好> -10
Oligo 6.0使用
• 打开软件，file→new sequence ，对话框内 粘帖序列 • 工具条accepted →出现多个对话框，关注 melt temperature对话框
Oligo 6.0评价引物
Tm utility使用
• 打开软件，调节Mg2+=2.0时，直接粘贴序列
Primer Premier 5.0使用
• 打开软件，file→new → DNA sequence • 序列框内粘帖，出现对话框，选择as is，OK 原
反向
互补
反向互补
点击Primer → 出现新对话框，点击search
5’ ATGCATG A AT ATG ATGC 3’
上游测：5’
下游测：3’
测序背景知识
1. 测序有效长度<700bp，且约前100bp没有信号或信号差 2. 测位点，位点放中间 3. 特异性的基因引物需要提供， 通用的引物（测质粒）不需要提供 4 测<700bp全长，需要上、下游测，拼接 测>700bp全长，除上、下游测外，中间需要添加引物
跨内含子方法——1
DNA mRNA 两条引物至少有一条引物跨内含子
跨内含子方法——2
DNA mRNA
引物不跨内含子，但中间的内含子序列>1000bp
Байду номын сангаас
扩增程序72℃ 15S ：
足够扩增<200bp的产物， 但不能扩增出>1000bp的产物，消除干扰
举例
4. DBP的rs7041和 rs4588的多态性测序 添加带荧光的ddNTPs，电泳
引物设计
PCR原理、成份
PCR的通俗理解： 扩增出大量的、正确的DNA目标片段！
成份要求： 工作环境：PCR bufer（Mg2+） 导向者：引物 DNA原料：4种脱氧核糖核酸
合成机器：酶
温度要求：
94℃：DNA双链打开
54 ℃：引物寻找正确位置 72℃：酶全速加工？
背景知识
5’ 3’
PCR成分最终的结局：
长度 标尺
上游 下游 进度条
框选合适序列
查看发夹、二聚体和错配
改变选框 的长度
完全匹配时，above the threshold 错配严重时，above the threshold
错配打分最好控 制在<100
分类
分类
核酸 类型
名称
功能、特殊要求
检测有或者无 检测表达量多少；跨内含子 序列保守，针对单个序列 序列不保守，针对群体序列 测序有效长度、位点信息 添加酶切序列 片段<200bp，越短越好 避免二级结构处设计引物
5’
3’
5’
3’
举例
5.大鼠SelV的克隆 前提：克隆mRNA的哪部分序列？（CDs） 用什么质粒？ 宿主是什么？ 使用什么工具酶？（双酶切）
5’ 3’
举例
• 结核杆菌gyrB基因扩增
• 背景：GC% >60% 二级结构严重
对策： 退火温度 >60℃ 使用1-10%的DMSO（二甲基亚砜）
DNA（HBV、结核杆菌） RNA(mRNA、microRNA等) 序列 高等（哺乳动物、鱼） 保守？ 低等（细菌、病毒） 测序 克隆 用途 定量 高GC
举例
1. 性别鉴别——人的SRY基因
检测类型：DNA 高等生物：单一序列
2. 沙门菌检测
检测类型：DNA 低等生物：群体序列（先比对序列找保守区）
竞争：
引物 dNTPs Taq酶
设计思路
设计准则：
引物Tm值比退火温度高3-5℃
重要性：3’ >>5’
避免在3’出现G/C
依据GC%，确定退火温度：
40-60%，适中，55℃-60℃；
>60%，高GC%，58-62℃
设计工具
Tm utility：计算GC%和Tm值
Primer Primer5.0寻找合适的引物位置