最新SDS-PAGE凝胶电泳操作

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SDS-PAGE凝胶电泳操作

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一、常规试剂的配制

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1. 30% 聚丙烯酰胺贮液：丙烯酰胺 150g，甲叉双丙烯酰胺4g，双蒸水4

500ml，滤纸过滤后，棕色瓶避光4℃保存；

2. 1.5mol/L，pH 8.8 Tris-HCl分离胶缓冲液：18.15g Tris，用1mol/L HCl 5

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定容至100ml，棕色瓶避光4℃保存；

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3. 1.0mol/L，pH 6.8 Tris-HCl分离胶缓冲液：12g Tris，用1mol/L 调

pH至100ml，棕色瓶避光4℃保存；

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4. 10% SDS溶液：10g SDS加水定容至100ml，完全溶解室温保存；

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5. 10% AP溶液：0.1g AP（过硫酸铵）加水定容至1ml，用前新鲜配制；

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6. 1×SDS-PAGE电泳缓冲液：25mM Tris（3.0285g/L），192mM甘氨酸12

（14.41g/L），0.1%SDS（1g/L），pH 8.30；

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7. 染色液：0.25g 考马斯亮蓝R-250溶解于45ml甲醇，45ml水，10ml冰

醋酸，过滤除去杂质；

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8. 脱色液：45ml甲醇，45ml水，10ml冰醋酸；

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9. 固定液：50ml甲醇，40ml水，10ml冰醋酸；

10. 2×SDS-PAGE上样缓冲液：10% SDS 0.4ml，0.375M Tris-HCl（pH 6.8）

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0.333ml，甘油0.2ml，1% 溴酚兰10μL，β-疏基乙醇100μL，加水定容至1ml，19

分装后-20℃保存。

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二、样品的处理

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1. 蛋白含量较低的酶制剂或原料样品

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（1）粉剂（或颗粒）样品

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称取样品1g，加入3-5ml蒸馏水进行搅拌溶解1h（搅拌时间可根据实际情24

况进行增减），4000rpm离心10min，取离心上清液等体积加入20%的三氯乙酸聚25

沉30min，离心，弃去离心上清液，用70%的丙酮溶液洗涤沉淀，4000rpm离心

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10min，重复洗涤3-5次，将丙酮洗涤液吹干，加入适量（1-3ml）PBS溶解沉淀，

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溶解液即可用于电泳实验。

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（2）液体样品

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液体样品经离心后，取离心上清液等体积加入20%的三氯乙酸聚沉30min，

离心，弃去离心上清液，用70%的丙酮溶液洗涤沉淀，4000rpm离心10min，重30

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复洗涤3-5次，将丙酮洗涤液吹干，加入适量（1-3ml）PBS溶解沉淀，溶解液

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即可用于电泳实验。

2. 蛋白含量相对较高的酶制剂或原料样品

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（1）粉剂（或颗粒）样品

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称取样品1g，加入3-5ml蒸馏水进行搅拌溶解1h（搅拌时间可根据实际情

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况进行增减），4000rpm离心10min，取离心上清液用于电泳实验。

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（2）液体样品

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液体样品经离心后，取离心上清液用于电泳实验。

3. 未知样品

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对未知样品进行归类（是否为酶制剂，是哪一类酶），根据已知电泳图谱确

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定该类物质能跑出清晰电泳条带的蛋白浓度范围，在对未知样品进行电泳实验

前，测定其蛋白含量，根据其结果进行适当处理。

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三、凝胶的配制

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1. 设备检漏

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将电泳玻璃板按顺序装好并固定，在电泳玻璃板间注满蒸馏水，静置

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15-20min，观察是否有水浸出，若无则进行下一步操作，反之，则拆除进行重

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新安装，并重复检漏至无液体浸出。

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注：如样品数量不多，一块凝胶板就已足够，则另一边使用凝胶隔板，防

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止跑胶时短路。

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2. 分离胶的制备

根据目的蛋白的分子量大小选择合适的凝胶浓度，不同浓度的SDS-PAGE分

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离胶的最佳分离范围如下表

将检漏的蒸馏水倒出，按下表进行SDS-PAGE分离胶的配制（使用凝胶试剂

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盒）

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注：如室温高于30℃，可适量减少TEMED30-50%，防止胶过快凝结；

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如室温低于20℃，可适量增加TEMED30-50%，防止胶过慢凝结。

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常用分离胶的浓度为10%。按上表进行配制，所有试剂加入烧杯中，充分混58

匀后，迅速进行注胶，注胶过程要平稳，避免产生气泡，注胶完成后用蒸馏水59

进行水封（水封的目的是为了使分离胶上延平直，并排除气泡，且防止氧化），凝胶聚合好的标志是胶与水层之间形成清晰的界面。

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3. 浓缩胶的制备

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分离胶制备完成后，静置60-90min，确保分离胶凝结完全后，倒出水封液体并用滤纸把剩余的水分吸干，按下表进行SDS-PAGE浓缩胶的配制。

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