发酵工程PPT课件：3 微生物代谢调节(2-3)

⑤、不同种类的微生物亦能产生同一种次级代谢物.
例如：如产黄青霉、点青霉、土曲霉、构巢曲霉、 发癣霉属的一些真菌都能产生青霉素；
⑥、 次级代谢产物的合成比生长对环境因素更敏感。
例如： 生长可在0.3～300 mmol/L磷酸盐浓度
下进行，而次级代谢物合成的最适浓度为 0.1～10mmol/L。
二、 次级代谢物的生物合成
3 微生物代谢调节
第二节 微生物次级代谢
初级代谢与次级代谢定义：
• 初级代谢：为生物提供能量、合成中间体及其关键大分 子，如Pr、核酸等的各种相互关联的代谢网络(包括分解 与合成)。
• 次级代谢：主要涉及合成过程，其终产物、次级代谢物 对菌生长不是必需的，对其生命活动可能具有某种意义， 通常在生长后期开始形成。
例如：金黄色假单孢菌的耐Trp结构类似物的 突变株的硝吡咯菌素高产原因是由于促进所需前体， 色氨酸的生物合成。
（2）前体导向抗生素的合成
次级代谢物的前体源自初级代谢，前体叉向次级 代谢物合成途径的第一个酶往往是关键。
因为：它决定前体流向抗生素合成的数量，其代 谢流的分布和抗生素的产量。途径中可能存在其他限 制性酶。
原，双键的引入或还原，氧原子的引入和芳香环的氧化 裂解，这些反应是由脱氢酶或加氧酶催化的。
②、生物甲基化是各种代谢物，特别是聚酮化物的 生物合成中的重要反应。
③、卤化作用对分子中含卤元素(大多数是氯)的次级 代谢物是很重要的。
许多次级代谢物是用不同的中间体作为建筑单位合成的。
例如：
① 、大环内酯类抗生素：其糖苷配基是由脂肪酸衍生 的，其糖部分是由葡萄糖衍生的。
如初级代谢和次级代谢均需要同一种必需的前体，则 低浓度的前体需先满足生长的需要。
例1、这在抗生素链霉菌的营养缺陷型的放线菌素生产 中获得证实。AA营养缺陷型所需的AA正好是放线菌素的 组成部分时，这种营养缺陷型必然是低产菌株。
例2、低浓度的氯化物限制含氯的抗生素，灰黄霉素的 生产。
高浓度的前体是抗生素合成所必需的，除去前体生物合成 的反馈调节机制有可能使抗生素增产。
Martin等将可作为次级代谢物前体的初级代谢的中 间体分为：
①、短链脂肪酸； ②、异戊二烯单位； ③、AA； ④、糖与氨基糖； ⑤、环己醇与氨基环己醇； ⑥、脒基； ⑦、嘌呤与嘧啶碱； ⑧、芳香中间体与芳香AA； ⑨、甲基(C1库)。
小结：
次级代谢物的生物合成过程除了在前体的形成和 聚合过程外，遵循一般的生物合成规律。
② 、真菌毒素和橘霉素：是由五个C2单位(Ac-CoA加 上4个丙二酰CoA)，2个甲基和由C1库来的羧基合 成的。
③ 、新生霉素：具有更为复杂的来源，它是由葡萄糖、 莽草酸、GLN、C1库、Tyr和乙酸或Leu合成的。
（2）诱导抗生素生物合成
前体具有调节抗生素生产的作用，尤其在细胞 中的特殊合成酶的活性已被激活的情况下。
研究微生物次级代谢的意义：
a) 获得与次级代谢有关的基础理论知识，并用于设 计更为有效的途径来合成这类复杂的化合物或改 造它们，以获得所需的生物性质；
b) 有助于优化次级代谢产物的工业生产。
c) 借助于生物合成途径的知识，利用基因工程技术 可以帮助构建在遗传学上能产生新化合物的突变 株。
次级代谢物生物合成步骤： ① 养分摄入； ② 通过中枢代谢途径养分转化为中间体； ③ 次级代谢物前体的生物合成； ④ 如有必要，改变其中的一些中间体； ⑤ 前体进入次级代谢物生物合成专有途径； ⑥ 次级代谢的主要骨架形成后作最后的修饰，成为产物。
这些酶往往受到反馈、碳、氮或磷的调节。另一 些酶可能受到高浓度前体的诱导。
引向初级和次级代谢物的支路途径的生理调节随不同 的M及其代谢途径而有所不同。
例如：莽草酸途径的关键中间体分枝酸在初级代谢中 一方面引向Phe和Tyr；另一方面导向对-羟苯甲酸和对-氨 基苯甲酸；另一分枝途径形成各种吩嗪(phenazine)次级代 谢物和Trp。
（3）前体与诱导物的区别
诱导作用在次级代谢物的合成控制上起重要作 用。有时难于区分这种促进作用是真的诱导物的作 用还是前体的作用。
①、诱导物与前体的作用时期不同。
一般把那些能在生长期内生产期前促进抗生素生物 合成的化合物看做诱导物，而前体往往只在生产期内起 作用，甚至Pr合成受阻的情况下也行。
②、诱导物应能被非前体的结构类似物取代。 如Met除了可作为头孢菌素合成的前体，提供S的
例3：
L-Val被认为是环孢菌素A的前体和生物合成的诱 导物。加入Val可促进T．inflatum固定化细胞合成环 孢菌素A。
例4：
赤霉素受葡萄糖的阻遏。这可通过加入3-甲基3,5-二羟基戊酸克服。
例5：
丙醇和丙酸具有促进红霉素生产的作用，丙酸的 作用稍差些。在发酵前期加入丙醇会干扰生长，从而 降低抗生素的合成。先前认为，丙醇的促进作用完全 是由于起前体的作用，现已清楚，除了作为前体外， 它还能诱导红霉素链霉菌的AC-CoA羧化酶。此诱导作 用似乎发生在转录水平，因在发酵中加入放线菌素D可 以阻抑这种作用。
（2）芳香中间体
A 莽草酸途径的中间体或终产物：形成许多次级代 谢物的芳香部分。 B 芳香氨基酸生物合成途径：负责大多数放线菌和 许多植物次生代谢物的生物合成。 C 聚多酮途径：大多数真菌产生的芳香代谢物是由 乙酸通过聚多酮途径合成的。
举例： ①、氯胺苯醇和棒杆菌素的生色团是由分枝酸衍生
的。 ②、利福霉素的芳香成分来自莽草酸。
③、绿脓菌素的吩嗪骨架源自邻氨基苯甲酸。
④、新生霉素和黄青霉素的芳香部分来自酪氨酸。
⑤、放线菌素、吲哚霉素、硝吡咯菌素的芳香环源 白色氨酸。
（3）经修饰的糖前体
①、氨基糖苷类抗生素：
其糖大多数来自葡萄糖，其碳架以整体方式结 合到抗生素中。但往往需要经过修饰或转化。
糖的修饰：差向异构化，异构化Leabharlann Baidu氨化，去羟 基，重排(生成分枝糖)，脱羧，氧化和还原。
例3：肽类抗生素的形成中非蛋白的AA成分通常是限制 因素。
例4：缺少Ac-CoA会限制四环素的生产。
例5：金色链霉菌低产菌株的特征是Ac-CoA倾向于走 TCA循环而被氧化；高产菌株没有这一倾向。
例6：诺尔斯链霉菌合成制霉菌素的能力的提高与其前 体，丙二酸和甲基丙二酸合成的增加有关。
（1）前体合成的分子调节机制
作用，更为重要的作用在于诱导节孢子的形成，而后者 的多寡影响头孢菌素的合成。 Met可被Leu取代。
③、诱导物的另一个特征是其诱导系数特别高。 如诱导链霉素形成的A因子，其诱导系数为106。
（三）、 前体的限制性
前体常常是次级代谢物生物合成的限制因素。 例1：在发酵过程中加适量苯乙酸可强烈促进苄青霉 素的生产； 例2：丙酸或丙醇促进大环内酯抗生素的生物合成。
添加前体时宜少量多次或流加，控制发酵液中前体的 残留浓度在适当范围。
例如：苯乙胺浓度在0.05％～0.08％。
（四）、 把前体引入次级代谢物生物合成的专用途径
前体一旦合成，便流向次级代谢物生物合成的专用途 径。
在某些情况下单体聚合成聚合物，如聚多酮、寡肽和 聚醚类抗生素等。这些特有的生物合成中间产物需作后几 步的结构修饰，进行的深度取决于产生菌的生理条件。
（一）、 前体的概况和来源
1、前体的定义
Rose的定义（1979）： 前体(precursor)是在细胞内生成的，或由培养基 提供的，能被代谢形成某种终产物的物质。
Stanbury等的定义(1984)： 前体指加入到某一培养基中的一些化学物质被直接 结合到所需产物中。
前体现代定义：
指加入到发酵培养基中的某些化合物能被M 直接结合到产物分子中去，而自身的结构无多大 变化，且具有促进产物合成的作用。
次级代谢途径同初级代谢的分解代谢、无定向代 谢和组成代谢紧密相关。
其前体通常是正常的或经修饰的初级代谢的中间 体。
2、前体的来源
（1）养分转化为中枢途径的中间体 糖经分解代谢反应转化为较小的5-C，4-C，
3-C和2-C单位(如戊糖，丁糖，丙糖，乙酸盐， α-KG，OXA等)。
有些中间体可直接用作前体。但有些需经 修饰才能作为前体。
角生物碱、戊二酰胺、吲哚衍生物、内酯、萘、 核苷、杂肽、吩嗪、聚乙炔、多烯、吡咯、喹 啉、萜烯、四环类抗生素等；
② 、含有少见的化学键：
例如： β-内酰胺环、聚乙烯和多烯的不饱和
键、大环内酯的大环和含有普通AA和经修 饰的AA组成的环肽等；
③、 一种M所合成的次级代谢物往往是一组结构相似的 化合物。
举例： TDP-葡萄糖衍生物是泰乐菌素生物合成的中间体。 UDP-葡萄糖参与新生霉素的生物合成。 CDP-葡萄糖则参与核苷类抗生素。 有些抗生素带有甲基化糖。
（5）甲基的来源
抗生素生物合成中的所有甲基化作用均以Met 作为甲基供体，通过甲基转移酶进行。
而Met的甲基源自N5-四氢叶酸。
转甲基时Met先活化，即在Mg2+和ATP存在下 生成高能甲基供体：S-腺苷酰甲硫氨酸(SAM)。以 SAM进行甲基化后自己变成S-腺苷酰高半胱氨酸 (SAH)，后者可被水解为腺苷和高半胱氨酸。
举例： 产黄青霉能产生5种具有相同母核、不同侧链的天
然抗生素，结构上的差别使它们具有不同的生物活性。 组分的比例取决于遗传和环境因素，这是由于参与
次级代谢物合成的酶的专一性不强所致；
④、 一种微生物的不同菌株可以产生分子结构迥异的次 级代谢物。
例如：灰色链霉菌可生产链霉素、白霉素、吲哚霉素、 灰霉素、灰绿霉素和灰争霉素等；
中间体：
指养分或基质进入一途径后被转化为一种或多种 不同的物质，它们均被进一步代谢，最终获得该途径 的终产物。
前体与中间体的区别：
前体的结构往往略需改变后才进入到代谢途径中 去；有时指同一物质。
次级代谢物前体的种类：
Betina认为，次级代谢物的前体大多数源自初级代谢的 中间体：
①、糖类； ②、莽草酸和(或)芳香AA； ③、非芳香AA； ④、C1化合物； ⑤、脂肪酸(尤其是乙酸和丙酸)； ⑥、TCA环的中间体； ⑦、嘌呤和嘧啶。
例1：
在带小棒链霉菌中头霉素C的一种前体，α-氨基 己二酸是由赖氨酸合成途径来的。它与Pr合成竞争 此前体的供应。加入过量的Lys， Lys途径中间体， 二氨基庚二酸或α-氨基己二酸到发酵液中可增加头霉 素的发酵单位。
例2：
产黄青霉的青霉素酰基转移酶可转化异青霉素N， 除去青霉素N的侧链，换上天然青霉素的其他侧链。侧 链的置换取决于发酵液中含有适当的前体，如苯乙酸或 苯氧乙酸11则。故苄青霉素的发酵单位随发酵液中的限 制性苯乙酸的增加而提高
（二）、 前体的作用
（1）抗生素建筑材料
例如： 丙酮酸可用于Ala、Val、Leu等的合成，是几种
肽类抗生素（头孢菌素簇或青霉素簇）合成的重要 中间体。
次级代谢物通常由初级中间体产生，将初级中间体转 化为次级终产物有三个生化过程：
①、生物氧化和还原； ②、生物甲基化； ③、生物卤化。
其特征如下： ①、氧化还原反应：一般涉及醇的氧化或羰基的还
（3）添加前体的策略
研究前体添加策略对有些抗生素高产稳产有重要意义。
举例：青霉素G生产需要加入苯乙酸或苯乙胺，发酵 培养基中常用玉米浆的原因之一是这种原料含有苯乙胺。 苯乙酸具有促进青霉素生物合成的作用，可在基础料中和 过程中添加，其理论用量为0.47g苯乙酸/g青霉素G； 0.50g苯乙酸/g青霉素V。实际用量应考虑利用率。高产菌 株对前体的利用率(可>90％)比低产菌株高许多。
有些复杂抗生素是由来自不同生物合成途径的几个部 分组成的。
次级代谢物： 也曾被称为分化代谢物(idiolites)、特殊代谢物。 分化代谢物是指在最低培养基上给突变株提供次级
代谢物的前体才能形成的。
微生物产生的次级代谢物有：
抗生素 色素 生物碱 毒素
一、 微生物次级代谢的特性
①、种类繁多，结构特殊，含不常见化合物：
例如： 氨基糖、苯醌、香豆素、环氧化合物、麦
糖的转化：以核苷二磷酸衍生物，如UDP-葡萄 糖形式进行。UDP-葡萄糖由葡萄糖-1-P的葡萄糖基转 给UTP获得。
②、大环内酯类抗生素的糖的生物合成： 是以TDP-衍生物作为中间体形式进行的。
③、己糖胺的形成： 是通过己酮糖和谷氨酰胺的转氨作用完成的。
④、有些次级代谢物完全由糖组成(如氨基环多醇抗生素)； 另一些糖以糖苷的形式存在于次级代谢物中。