植物转基因技术原理及要点

(Agrobacterium tumefaciens),
是一种革兰氏阴性土壤杆菌,
它含有Ti质粒,能诱导被侵 染的植物细胞形成肿瘤, 即诱发冠瘿瘤.Ti质粒(包 括Ri质粒)上有一段转移 DNA,在农杆菌侵染宿主 植物时,这段DNA可以转 移进植物细胞,并稳定地 保留在植物细胞染色体中, 变为植物细胞新增加的一 群基因,最终能通过有性 世代遗传给子代 。
例 Gus检测
原理：β－Ｄ－葡萄糖酸苷酶基因（Gus），催 化β－葡萄糖苷酯类物质水解。其中很多水解 产物具有发色团或形成荧光物质。 例：组织化学法测定Gus活性 作用底物为X-gluc,产物是一种不可溶的5,5二溴，4,4-二氯靛蓝；
转基因植物的PCR检测
外源基因整合的PCR-Southern杂交检测 外源基因拷贝的IPCR检测 外源基因表达的RT-PCR
返回
电击法的主要原理是将原生质体
在溶液中与DNA混合,然后利用高 压电脉冲作用,使原生质体膜的某 些部位被击穿而产生可回复的小 孔,外源DNA可通过小孔进入原生 质体内,而且不影响经电击处理的 原生质体再生植物的能力.
返 回
花粉管通道法是利用开花植物授粉
后形成的花粉管通道,直接将外源目 的基因导入尚不具备正常细胞壁的卵、 合子或早期胚胎细胞,实现目的基因 转化.
转基因方法
DNA间接转化法 农杆菌介导基因 转移
转化的优点
转化的缺点
受体种类，可以在原生质体、 转化双子叶植物为主。大 蛋细胞和细胞团、组织器官 多数单子叶植物和裸子植 或整株等多级水平上进行， 物对农杆菌的侵入不敏感， 方法成熟可靠，简便易行， 限制了该法在禾谷类作物 周期短，转化率高； 中的应用。 转化体常出现“嵌合”现 象，需在严格条件下加以 选择以淘汰未转化细胞
CaMV35P
chs
β-glucuronidose
NOS ter
3.受体材料的准备 细胞的全能性：分化细胞脱分化
再分化
4.遗传转化
（1）间接转化法——农杆菌介导转化法
（2）直接转化法
A、 基因枪转化法 B、 电击法 C、花粉管通道法 D、 PEG介导基因转化法
根癌农杆菌
返 回
基因枪转化法由美国Cornell大学的
Sanfor (1987)提出,它的主要原理是将包 含目的基因的载体包被在微小的金属微 粒(钨粒或金粒)表面,通过高压驱动力加 速微粒穿透植物细胞壁,导入受体组织细 胞内,然后通过组织培养再生出完整的植 株.微粒上的外源DNA进入细胞后,整合到 染色体上并得到表达,从而实现基因的转 化.。
6.炼苗
7.转基因苗的筛选与鉴定
培养过程中利用标记基因筛选
选择标记基因(Slective gene)
抗生素类选择基因 抗除草剂类选择基因 生物安全性标记类选择基因 ……
标记基因
报告基因(Report gene)
β-D-葡萄糖酸苷酶基因(Gus) 荧光素酶基因(Luc) 氯霉素乙酰转移酶基因(Cat) 绿色荧光蛋白基因(Gfp) ……
植物转基因技术原理及要点
李琳玲
1.技术路线源自文库
目的基因分离 植物表达载体的构建
遗传转化
受体材料的准备 转化组织
炼苗
转化植株筛选
组织脱分化
1.目的基因的分离


（1）已知基因的获得
①化学合成法 ②PCR扩增


（2）未知基因的获得
①构建基因组文库，筛选目的基因 ②构建cDNA文库，筛选目的基因 ③mRNA差异显示技术筛选差异表达基因 ④差异蛋白质谱表达技术筛选功能基因 ……
杂交鉴定
外源基因整合的Southern 杂交鉴定 外源基因转录的Northern杂交检测 外源基因表达蛋白的检测 外源基因整合及表达的原位杂交检测
Southern杂交过程
8.转基因植物成果检测
Thank you !
DNA直接转化法
无宿主限制，适用于各种单、 转化效率低，需要专门设 备（电击仪、显微操作仪 （1）基因枪转化法 双子叶植物，操作简单 或基因枪），多数需要原 （2） 电击法 生质体与愈伤组织，周期 （3） PEG介导基 太长（电击法） 因转化法
（4）花粉管通道法
5.转化组织 ——农杆菌介导之叶盘转化法
返 回
PEG介导基因转化的主要原理是聚乙二醇
(PEG)、多聚-L-鸟核苷酸(pLO)、磷酸钙及高 pH值条件下诱导原生质体摄取外源DNA分 子.PEG可促使细胞膜与DNA间接触与粘连, 并通过引起膜表面电荷的紊乱及干扰细胞间 的识别,利于细胞膜间的融合以及外源DNA进 入原生质体.
返 回
表1 几种植物转基因方法比较


2.植物表达载体的构建
④
pGEM-T
⑤
⑥ ⑥
① ②
①银杏叶RNA提取 ②反转录cDNA ③chs全长cDNA的克隆 ④TA克隆及测序
③
⑦
⑤向chs两端引入酶切位点 ⑥双酶切 ⑦定向克隆 ⑧导入农杆菌
⑧
例 pBI121-chs构建
pBI121图谱
银杏chs基因植物表达载体构建示意图
chs
带有转化基因的农杆菌活化
共培养 侵染 叶盘 受体植物
诱导成苗
遗传转化主要的影响因素：
1.预培养时间：一般0~3天，过长不利于侵染 2.农杆菌浓度：用MS（pH=7.0）盐溶液调OD值（一般在 0.2~1.0） 3.侵染时间：时间应适中，太短转化率低；太高则后期农杆 菌难以除净，毒害材料。 4.共培养时间 5.乙酰丁香酮（AS）处理：处理方式及浓度 (A) 仅共培养基中加AS (B) 仅菌液中加AS 实验结论：A与C效果最好且差异不明显 (C) 菌液和共培养基中均加AS AS使用浓度：50μM~200μM