[医学]肺癌个体化治疗
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• 新技术平台
病理评估与质量控制
肿瘤组织标本
组织切片
病理学评估
• 组织标本来源
• H&E 染色片用于病理评估 • 非小细胞性肺癌诊断及类型
•手术标本
• 白片用于提取DNA
• 肿瘤细胞比例
•支气管下活检
•
•经皮穿刺活检
• 标本处理及贮存
•新鲜冻存：液氮或-80C
建议最少切片数： --手术标本，5 µm X4 --小活检标本，5 µm X8
蛋白检测
RNA检测
DNA检测
chromosome
新一代测序技术
一代
• Sanger Sequencing
二代
• Roche - 454 • Illumina – GA II • SOLiD
三代
• Helicose • PacBio • Illumina = HiSeQ, MiSeq • Ion Torrent • Oxford Nanopore
KLC1-ALK
KL9;A20
TFG-ALK
T3;A20
ALK-PTPN3
HIP1-ALK ......J Thorac Oncol. 2014;9: 285–294
（～20%）
AALKLKK激ina酶se结do构m域ain
• 在非小细胞肺癌中已确定了几种EML4ALK 融合变异体，并证明其具有功能活 性
丝氨酸/苏氨酸激酶（STKs）
脂质激酶
• NSCLC中，驱动突变也常见于编码GTP结合蛋白的基因， G蛋白通过与下游分子的相互作用，调节细胞生长、分化和凋亡。
酪氨酸激酶 丝氨酸/苏氨酸激酶 脂质激酶
PI3K–AKT–mTOR pathway RAS–RAF–MEK–ERK pathway
Lung Cancer Squamous Cell Cancer Adenocarcinoma
ALK (+)
70% 分离 30% 缺失
ALK临床研究的数据均使用FISH诊断
I期临床 PROFILE 1001
II期临床 PROFILE 1005
III期临床 PROFILE 1007
PROFILE 1014
PROFILE 1029
分离探针FISH
27
Crizotinib
NCT00932893 NCT00932451 NCT01154140
ALCL: 间变性大细胞淋巴瘤 IMT: 炎性肌纤维母细胞瘤 DLBCL: 弥漫大B细胞淋巴瘤 NSCLC: 非小细胞肺癌
荧光原位杂交
Fluorescence in situ hybridization, FISH
2p21 EML4
ALK: Anaplastic Lymphoma Kinase Positive: >15%
各种NGS比较
Seq. Chem. Read length (bp) # of reads/run
3730XL (2002)
Sanger 800
96-384
GSFLX/Titani um [454]
(2005)
Pyroseq
G1/G2
SOLiD
[Illumina] v2.03/3.0
(2006) [ABI](2007)
非小细胞肺癌中的ALK基因 融合
举例
（～80%, 其中81%， 未知19%）
EML4-ALK
E13;A20
E20;A20
E20ins18;A20
E6;A20
E6ins33;A20
E14;ins11del49A20
E2;A20
E2;ins117A20
E3;ins69A20
E14;del12A20
E14;del36A20
SBS
SBL
Heliscope[ Helicose]
(2008)
SBS
Pacific Bio Complete Genomics
(2009) (2009)
SBS
SBL
225-400
33-75
33-50
25
800
32
400,000 – 1 40-100 x 40-100 x 500 x 106
TBD
NA
Phase III clinical trials
FDA将FISH作为克唑替尼的伴随诊断方法
其它融合基因
各种靶分子的检测方法
Virchows Arch (2014) 464:347–358
分子检测的要点
• 规范化操作（SOPs）
人员 实验室 标本 设备 试剂 流程
• 多学科合作
临床 病理 影像
E17;ins30A20
E17ins61;ins34A20
E17ins68;A20
E15del19;del20A20
E18;A20
E6;A19 ......
KIF5B-ALK
KI24;A20 KI17;A20 KI15;A20
V1 V2
V3a V3b V4 V5a V5b V6 V7
V8a V8b
“V4” “V5”
• 肿瘤细胞总数 • 标识肿瘤丰富的区域富集肿
瘤细胞
•FFPE
选择合适的检测方法及流程的优化
--http://www.egfr-mutation.com
~ 50% in Chinese
驱动基因异常及临床意义
1 2
3 4
5 6 7
8
9 10 11
12
13
14 15 16 17
18
19
20 21 22 23 24
J Clin Oncol 31:1097-1104, 2013
J Clin Oncol 31:1097-1104, 2013
分子检测技术
x 106
106
106
Accuracy Cost/Mb
99.999% $800
99.5% $80
99.0% $5
99.94%
99.95%
TBD
TBD
$4
$3
TBD
$2
Baidu Nhomakorabea
NGS: Next Generation Sequencing
分子检测方法的选择
检测试剂
方法：伴随诊断 Companin diagnotics
• 转化需要ALK酪氨酸激酶的活性。 • 证据表明ALK抑制剂可致体内肿瘤缩小 ，
提示癌基因依赖，可以作为潜在的靶点
V1 V2 V3a/b V4 V5 V6 V7a/b V8a/b "V4" "V5" Unnamed Unknown
肿瘤中已知的ALK融合基因类型
t(2;10)(p23;p11)
KIF5B-ALK
肺癌个体化治疗
肺癌的驱动基因
肺癌驱动基因
• NSCLC中，驱动突变的关键基因大多数为信号传导蛋白 (如蛋白激酶) 编码基因， 信号传导蛋白通过将磷酸基团从ATP转移至特异性靶蛋白，调节细胞增殖和生存。
90酪氨酸激酶（TKs） 56跨膜 （i.e.受体酪氨酸激酶, RTKs）
518蛋白激酶
34非跨膜
病理评估与质量控制
肿瘤组织标本
组织切片
病理学评估
• 组织标本来源
• H&E 染色片用于病理评估 • 非小细胞性肺癌诊断及类型
•手术标本
• 白片用于提取DNA
• 肿瘤细胞比例
•支气管下活检
•
•经皮穿刺活检
• 标本处理及贮存
•新鲜冻存：液氮或-80C
建议最少切片数： --手术标本，5 µm X4 --小活检标本，5 µm X8
蛋白检测
RNA检测
DNA检测
chromosome
新一代测序技术
一代
• Sanger Sequencing
二代
• Roche - 454 • Illumina – GA II • SOLiD
三代
• Helicose • PacBio • Illumina = HiSeQ, MiSeq • Ion Torrent • Oxford Nanopore
KLC1-ALK
KL9;A20
TFG-ALK
T3;A20
ALK-PTPN3
HIP1-ALK ......J Thorac Oncol. 2014;9: 285–294
（～20%）
AALKLKK激ina酶se结do构m域ain
• 在非小细胞肺癌中已确定了几种EML4ALK 融合变异体，并证明其具有功能活 性
丝氨酸/苏氨酸激酶（STKs）
脂质激酶
• NSCLC中，驱动突变也常见于编码GTP结合蛋白的基因， G蛋白通过与下游分子的相互作用，调节细胞生长、分化和凋亡。
酪氨酸激酶 丝氨酸/苏氨酸激酶 脂质激酶
PI3K–AKT–mTOR pathway RAS–RAF–MEK–ERK pathway
Lung Cancer Squamous Cell Cancer Adenocarcinoma
ALK (+)
70% 分离 30% 缺失
ALK临床研究的数据均使用FISH诊断
I期临床 PROFILE 1001
II期临床 PROFILE 1005
III期临床 PROFILE 1007
PROFILE 1014
PROFILE 1029
分离探针FISH
27
Crizotinib
NCT00932893 NCT00932451 NCT01154140
ALCL: 间变性大细胞淋巴瘤 IMT: 炎性肌纤维母细胞瘤 DLBCL: 弥漫大B细胞淋巴瘤 NSCLC: 非小细胞肺癌
荧光原位杂交
Fluorescence in situ hybridization, FISH
2p21 EML4
ALK: Anaplastic Lymphoma Kinase Positive: >15%
各种NGS比较
Seq. Chem. Read length (bp) # of reads/run
3730XL (2002)
Sanger 800
96-384
GSFLX/Titani um [454]
(2005)
Pyroseq
G1/G2
SOLiD
[Illumina] v2.03/3.0
(2006) [ABI](2007)
非小细胞肺癌中的ALK基因 融合
举例
（～80%, 其中81%， 未知19%）
EML4-ALK
E13;A20
E20;A20
E20ins18;A20
E6;A20
E6ins33;A20
E14;ins11del49A20
E2;A20
E2;ins117A20
E3;ins69A20
E14;del12A20
E14;del36A20
SBS
SBL
Heliscope[ Helicose]
(2008)
SBS
Pacific Bio Complete Genomics
(2009) (2009)
SBS
SBL
225-400
33-75
33-50
25
800
32
400,000 – 1 40-100 x 40-100 x 500 x 106
TBD
NA
Phase III clinical trials
FDA将FISH作为克唑替尼的伴随诊断方法
其它融合基因
各种靶分子的检测方法
Virchows Arch (2014) 464:347–358
分子检测的要点
• 规范化操作（SOPs）
人员 实验室 标本 设备 试剂 流程
• 多学科合作
临床 病理 影像
E17;ins30A20
E17ins61;ins34A20
E17ins68;A20
E15del19;del20A20
E18;A20
E6;A19 ......
KIF5B-ALK
KI24;A20 KI17;A20 KI15;A20
V1 V2
V3a V3b V4 V5a V5b V6 V7
V8a V8b
“V4” “V5”
• 肿瘤细胞总数 • 标识肿瘤丰富的区域富集肿
瘤细胞
•FFPE
选择合适的检测方法及流程的优化
--http://www.egfr-mutation.com
~ 50% in Chinese
驱动基因异常及临床意义
1 2
3 4
5 6 7
8
9 10 11
12
13
14 15 16 17
18
19
20 21 22 23 24
J Clin Oncol 31:1097-1104, 2013
J Clin Oncol 31:1097-1104, 2013
分子检测技术
x 106
106
106
Accuracy Cost/Mb
99.999% $800
99.5% $80
99.0% $5
99.94%
99.95%
TBD
TBD
$4
$3
TBD
$2
Baidu Nhomakorabea
NGS: Next Generation Sequencing
分子检测方法的选择
检测试剂
方法：伴随诊断 Companin diagnotics
• 转化需要ALK酪氨酸激酶的活性。 • 证据表明ALK抑制剂可致体内肿瘤缩小 ，
提示癌基因依赖，可以作为潜在的靶点
V1 V2 V3a/b V4 V5 V6 V7a/b V8a/b "V4" "V5" Unnamed Unknown
肿瘤中已知的ALK融合基因类型
t(2;10)(p23;p11)
KIF5B-ALK
肺癌个体化治疗
肺癌的驱动基因
肺癌驱动基因
• NSCLC中，驱动突变的关键基因大多数为信号传导蛋白 (如蛋白激酶) 编码基因， 信号传导蛋白通过将磷酸基团从ATP转移至特异性靶蛋白，调节细胞增殖和生存。
90酪氨酸激酶（TKs） 56跨膜 （i.e.受体酪氨酸激酶, RTKs）
518蛋白激酶
34非跨膜