贴壁细胞的脂质体转染(转)
细胞实验的基本操作
细胞实验的基本操作【细胞培养】一、细胞的复苏：非原代培养的细胞一般冻存于液氮之中，需要培养时要先从液氮中取出使之复苏。
细胞复苏的原则——快速融化：必须将冻存在－196℃液氮中的细胞快速融化至37℃，使细胞外冻存时的冰晶迅速融化，避免冰晶缓慢融化时进入细胞形成再结晶，对细胞造成损害。
具体操作如下：1、实验前准备：1.1、将水浴锅预热至37℃，并将含10%FBS的培养液置于其中预热；。
1.2、用75％酒精擦拭紫外线照射30min的超净工作台台面。
1.3、在超净工作台中按次序摆放好消过毒的离心管、吸管、培养瓶等等。
2、取出冻存管及迅速解冻：2.1、根据细胞冻存记录按标签找到所需细胞的编号。
2.2、从液氮罐中取出细胞盒，取出所需的细胞，同时核对管外的编号。
2.3、迅速将冻存管投入到已经预热的水浴锅中迅速解冻，并要不断的摇动，使管中的液体迅速融化，约1-2min后冻存管内液体完全溶解，取出用酒精棉球擦拭冻存管的外壁，再拿入超净台内。
3、平衡离心将细胞悬液吸到离心管中，1000～1500rpm离心3分钟；4、制备细胞悬液吸去上清液，加入10 ml培养液，用吸管轻轻吹打均匀，使细胞悬浮；5、细胞计数细胞浓度以5×105/ml为宜。
6、培养细胞将复合细胞计数要求的细胞悬液吸到培养瓶中，将培养瓶放入37℃和5％CO2的培养箱内培养（略微拧松培养瓶盖），换液的时间由细胞情况而定。
通常，除少数特别注明对DMSO 敏感的细胞外，绝大部分细胞株（包括悬浮性细胞），在解冻之后，可直接放入含有10-15ml（5－10倍）新鲜培养基的培养角瓶中，待隔天再置换新鲜培养基以去除DMSO 即可，如此可避免大部分解冻后细胞无法生长或贴附的问题。
二、细胞的传代：培养的细胞生长至一定密度之后，由于培养液中营养逐渐消耗、代谢物逐步积累（可见到培养液变黄），而且细胞的生长空间也受到限制，就会影响到细胞的继续生存。
这时就需要分离出一部分细胞和更新培养液，这一过程就叫做传代。
脂质体转染mrna细胞原理
脂质体转染mrna细胞原理
脂质体转染mRNA细胞的原理是利用脂质体作为载体，将目的mRNA包裹在其内部，然后通过与细胞膜融合让mRNA进入细胞质，最终达到将目的mRNA表达出来的目的。
脂质体是由磷脂和胆固醇等组成的微小囊泡结构，与细胞膜结构相似。
其内部的疏水层可以容纳水溶性的物质，包括mRNA分子。
脂质体转染mRNA的步骤如下：
1. 准备目的mRNA：目的mRNA是指需要转染到细胞内进行表达的mRNA，可以是外源的mRNA，也可以是经过In vitro 转录合成的人工合成mRNA。
这些mRNA一般会在实验室中事先准备好。
2. 制备脂质体：将脂质体粉末或液体悬浮液溶解在适当的缓冲液中，形成脂质体溶液。
脂质体通过磷脂的双层结构来包裹mRNA，形成稳定的脂质体-mRNA复合物。
3. 混合脂质体与mRNA：将目的mRNA与脂质体溶液混合，并进行充分的混合和搅拌。
这样就可以使mRNA和脂质体发生相互作用，形成脂质体-mRNA复合物。
4. 转染细胞：将脂质体-mRNA复合物加入到需要转染的细胞培养液中，使其与细胞接触。
脂质体复合物会与细胞膜融合，从而使脂质体内的mRNA进入细胞质。
5. mRAN转录和表达：在细胞质中，脂质体释放的mRNA会
被细胞的核糖体识别，进而进行mRNA转录和翻译，最终使
该mRNA编码的蛋白质在细胞内得到表达。
脂质体作为转染载体具有一定的优势，如制备简单、生物相容性好等。
但是，脂质体转染也存在一些问题，如转染效率较低、引起细胞毒性等。
因此，在实际应用中需对转染条件进行优化，以提高转染效率和减少毒性。
脂质体转染实验原理与操作步骤总(精)
脂质体转染的实验原理与操作步骤大全日期:2012-06-25 来源:互联网作者:青岚点击:3644次摘要:细胞转染的方法主要包括:电穿孔法、显微注射、基因枪、磷酸钙共沉淀法、脂质体转染法、多种阳离子物质介导、病毒介导的转染等, 理想的细胞转染方法是具有高转染效率、对细胞的毒性作用小等, 本文主要介绍细胞转染常用的方法 -脂质体转染的原理和操作步骤等。
找产品,上生物帮 >> >>细胞转染的方法主要包括:电穿孔法、显微注射、基因枪、磷酸钙共沉淀法、脂质体转染法、多种阳离子物质介导、病毒介导的转染等, 理想的细胞转染方法是具有高转染效率、对细胞的毒性作用小等,本文主要介绍细胞转染常用的方法 -脂质体转染的原理和操作步骤等。
脂质体 (lipofectin regeant, LR 试剂是阳离子脂质体 N-[1-2, 3-Dioleyoxy , Propyl]-n, n , n-Trimethylammonium Chloride(DOTMA和 Dioleoyl photidye-thanolamine(DOPE的混合物 [1:1(w/w]。
它适用于把 DNA 转染入悬浮或贴壁培养细胞中 ,是目前条件下最方便的转染方法之一。
转染率高,优于磷酸钙法,比它高5~100倍,能把 DNA 和 RNA 转染到各种细胞。
用 LR 进行转染时, 首先需优化转染条件, 应找出该批 LR 对转染某一特定细胞适合的用量、作用时间等,对每批 LR 都要做:第一,先要固定一个 DNA 的量和DNA/LR混合物与细胞相互作用的时间, DNA 可从1~5μg和孵育时间 6小时开始,按这两个参数绘出相应 LR 需用量的曲线,再选用 LR 和 DNA 两者最佳的剂量,确定出转染时间 (2~24小时。
因 LR 对细胞有一定的毒性,转染时间以不超过 24小时为宜。
细胞种类:COS-7、 BHK 、 NIH3T3、 Hela 和 Jurkat 等任何一种细胞均可作为受体细胞。
脂质体转染原理及操作步骤
脂质体转染原理及操作步骤脂质体转染是一种常用的基因传递技术，用于将外源的核酸（例如DNA、RNA）转入细胞内。
脂质体是由人工合成的类似于细胞膜的双层脂质膜组成，具有较好的生物相容性和可降解性，因此可以用来包裹并传递外源核酸进入目标细胞内。
本文将详细介绍脂质体转染的原理和操作步骤。
脂质体由两个疏水性脂质尾部和一个亲水性脂质头部组成，形成类似生物细胞膜的双层结构。
这种双层结构使得脂质体可以包裹水溶性的外源核酸，并形成脂质体-核酸复合物。
当复合物与细胞膜接触时，由于脂质体的类似性，这些复合物可以与细胞膜融合，并释放外源核酸进入细胞。
然而，简单地将脂质体-核酸复合物添加到细胞培养基中并不能有效地将外源核酸转入细胞内。
为了提高转染效率，常常需要使用电穿孔或钙磷共沉淀等方法，以增加细胞膜的通透性。
操作步骤：1.准备工作：-完整的脂质体转染试剂盒。
-DNA或RNA溶液。
-靶细胞。
-无菌操作条件下的实验室。
2.重组脂质体的合成：-按照试剂盒说明将脂质体复合物合成。
-使用无菌的工具和试剂。
3.核酸引物的制备：-将外源DNA或RNA与引物混合，使其形成核酸复合物。
4.细胞处理：-将培养皿中的细胞进行冲洗，去除培养基。
-将适量的细胞培养基添加到培养皿中，以保证细胞的正常生长。
5.导入核酸：-将所制备的核酸复合物滴加到细胞培养基中。
-将细胞培养皿置于无菌环境中，以便细胞吸收和利用核酸。
6.细胞培养：-按照细胞类型和所使用的培养基，将细胞置于恰当的培养条件下，并进行培养。
-根据需求添加所需要的生长因子和抗生素。
7.观察和分析：-在一定的培养时间后，观察细胞是否发生了显著的变化。
- 使用适当的实验方法（如PCR、Western blot等）检测外源基因的表达。
-观察并记录实验结果。
以上是脂质体转染的原理和操作步骤。
脂质体转染是目前常用的基因传递技术之一，可以用于研究基因功能、疾病治疗等领域。
随着技术的不断发展，转染效率和特异性将逐渐提高，为研究和治疗带来更多的机会和挑战。
脂质体转染操作步骤
脂质体转染操作步骤进行实验之前，请先规划好实验，一般细胞转染需要24h-72h，所以要充分了解细胞生长速度，计算所需脂质体和DNA的储备量，并确认准备好所需试剂：Opti-MEM无血清培养基，Lipofectamine转染试剂，以及DNA，这个一定要确认好。
1、细胞铺板（1）一般会选择复苏细胞传代3-4次（汇合率达到90%之前对细胞进行传代，不要长到100%），从解冻过程中恢复过来可以稳定生长的细胞进行细胞转染，传代次数高(>30-40)时，细胞的生长速度和形态会改变。
（2）如果提总蛋白，一般选择六孔板进行转染，因为转染的细胞提取蛋白的总量能达到200ug，一般够做并且需要的DNA和Lipofectamine又相对比较少。
（3）传代条件取决于所用的细胞系。
对于快速生长的细胞，倍增时间为16小时(如HEK293)。
对于生长缓慢的细胞，倍增时间为36小时(如原代细胞)。
（4）转染当天，将细胞铺板。
如果在转染前一天或更早时间铺板，转染效率可能下降，如果是简单细胞系的转染，可以直接在前一天晚上铺板，第二天来转染。
转染时，细胞密度会影响转染效率，细胞密度保持在汇合率为70-90%（这个前提是转染24h，如果转染48h则需要汇合率为50-70%），细胞的铺板和转染也可同时进行。
2、细胞转染吸去培养皿中的培养基，用PBS或者无血清培养基清洗一次。
更换无血清培养基。
准备转染制备液，用灭菌后的EP管制备。
以六孔板为例，A液：用200μl Opti-MEM稀释4μg质粒；B液:用200μl Opti-MEM稀释10μl lipo2000，分别将A液、B液轻轻混匀，静置5min，吸取B液加入至A液中，轻轻混匀，室温静置20min。
加入转染试剂到每个孔的培养基中，6h后，更换成完全培养基，继续培养到24-48小时（不同的质粒和脂质体最佳搭配比例不同，转染前，应该摸一个最佳配比。
质粒：脂质体=1：1，1：1.5，1：2，1：2.5，1：3，1：3.5的梯度比例来检测最佳转染比例，一般质粒有带荧光，可以通过观察每组荧光强弱来判断转染效率）。
贴壁细胞的脂质体转染
一、实验材料1、宿主细胞CHO（贴壁细胞）2、脂质体LIPOFECTAMINE 2000（invitrogen公司）3、6孔细胞培养版4、无血清培养基OPTI-MEM（GIBICO）5、转染级质粒二、实验步骤invitrogen的LIPOFECTAMINE 2000说明书上列举了24孔、12孔、6孔……板的实验体系，因为需要转染的细胞量大，所以一直采用的是6孔版做的转染。
以下是以6孔板为例说明一下我的体系和方法吧！1、转染前一天，以合适的细胞密度接种到6孔培养板上。
（我的接种密度是3~4*105/ml.）转染时，细胞要达到90~95%的融合。
2、溶液1：240ul 无血清培养基 + 10 ul lipofectamine 2000 per well （总体积250 ul）（温育5min）3、溶液2：X ul 无血清培养基 + 4 ug 质粒 per well（总体积250 ul）4、将溶液1与溶液2混合，室温下置20min。
5、与此同时，将6孔板中的细胞用无血清培养基冲洗细胞两遍后，加入2ml 无血清培养基。
6、将溶液1与溶液2的混合液逐滴加入孔中，摇动培养板，轻轻混匀。
在37℃，5％的CO2中保温5~6小时。
7、6小时后，更换含有血清的全培养基，在37℃，5％的CO2中48~72h检测转染水平。
8、如果做稳定转染，换全培养基培养后24h，即可以1：10或更高的稀释比例（根据细胞的生长情况）接种到新的培养基。
三、个人经验：我觉得贴壁细胞的脂质体转染还是很容易的，有了经验之后，现在做转染得心应手，转染前后细胞的形态几乎不发生变化，几乎没有细胞死亡。
转染率很高。
以下是个人经验，与大家分享。
1.细胞的状态。
这点非常重要，不要急于求成，一定要让细胞处于最佳的生长状态再做。
有文献说传代不要超过17代。
我总是在细胞复苏后的3代左右做，那时细胞状态最好，不要用传了很多代的细胞去做，细胞的形态都会发生变化了。
2.细胞的融合度。
脂质体转染原理及操作步骤
脂质体转染原理及操作步骤
脂质体转染是一种常用的基因传递方法，通过将目标基因以及负载该基因的脂质体添加到细胞培养物中，使其与细胞膜融合，并将基因导入到细胞内。
脂质体转染的操作步骤如下：
1. 提取脂质体：首先，从脱脂牛奶或其它来源中提取脂质体。
可以通过超声处理、离心等方法将脂质体分离出来。
2. 混合目标基因与脂质体：将目标基因与脂质体混合，目标基因可以是质粒DNA、RNA等。
将基因加入脂质体溶液中，进
行充分混合。
3. 孵育：将脂质体-基因混合物在室温下孵育一段时间，通常
为15-30分钟。
这一步主要是让脂质体与基因充分结合。
4. 加入细胞：将孵育好的脂质体-基因混合物加入需要转染的
细胞培养物中。
细胞种类可以是哺乳动物细胞、脊椎动物细胞、细菌等。
5. 孵育细胞：将细胞培养物保持在适宜的培养条件下，孵育一定时间，让细胞充分吸收脂质体-基因复合物。
6. 收获转染细胞：经过一定时间的孵育后，可从培养物中收获转染细胞。
可以根据实验需要进行后续分析。
需要注意的是，脂质体转染的效率与脂质体组分、浓度、孵育时间、细胞类型等因素密切相关，需要进行参数优化才能达到较高的转染效果。
贴壁细胞转染条件
贴壁细胞转染条件一、前言贴壁细胞是指生长在培养皿上的细胞，常用于细胞培养和转染实验。
转染是指将外源性DNA或RNA导入到目标细胞中，使其表达特定的基因或蛋白。
贴壁细胞转染条件影响着转染效率和细胞生长状态，因此需要进行优化。
二、影响贴壁细胞转染效率的因素1. 细胞密度：过低的密度会导致转染效率低下，而过高的密度则会影响细胞生长状态。
一般来说，应该选择处于对数生长期的细胞进行转染。
2. 转染剂：常用的转染剂有磷脂体、聚乙烯酰胺（PEI）等。
不同的转染剂对不同类型的细胞有不同的适用性，需要根据实验需求进行选择。
3. 转染时间：过短或过长的时间都会影响转染效率。
一般来说，应该根据实验需求和具体情况确定最佳转染时间。
4. 转染浓度：过高或过低的浓度都会影响转染效率。
一般来说，应该根据实验需求和具体情况确定最佳转染浓度。
5. 细胞状态：细胞处于不同的生长状态时，对转染的敏感度也不同。
一般来说，处于对数生长期的细胞对转染更为敏感。
三、常用的贴壁细胞转染方法1. 磷脂体介导法：将DNA或RNA与磷脂体混合后加入培养皿中进行转染。
优点是操作简单，适用于大多数贴壁细胞；缺点是转染效率较低。
2. 电穿孔法：利用高压电脉冲使细胞膜发生短暂的孔洞，从而导入外源性DNA或RNA。
优点是转染效率高；缺点是操作复杂且易造成细胞损伤。
3. 聚乙烯酰胺（PEI）介导法：将DNA或RNA与PEI混合后加入培养皿中进行转染。
优点是适用范围广，转染效率高；缺点是有毒性且易形成颗粒堵塞孔径。
四、常用的贴壁细胞转染条件1. 细胞密度：一般来说，应该选择处于对数生长期的细胞进行转染，细胞密度应该控制在70%左右。
2. 转染剂：常用的转染剂有磷脂体、PEI等。
具体选择应根据实验需求和细胞类型进行。
3. 转染时间：一般来说，转染时间应该控制在4-6小时左右。
4. 转染浓度：具体选择应根据实验需求和细胞类型进行。
5. 细胞状态：处于对数生长期的细胞对转染更为敏感。
脂质体转染原理
脂质体转染原理
脂质体转染是一种常用的基因传递工具，可以将外源DNA有效地引导进入目标细胞。
其原理基于脂质体的特殊结构和细胞膜的特性。
脂质体是由疏水性和亲水性分子组成的结构，可以形成类似细胞膜的双层结构。
在细胞培养条件下，脂质体会与目标DNA 结合，形成脂质体/DNA复合物。
当脂质体/DNA复合物与目标细胞接触时，由于脂质体与细胞膜的亲和性，复合物可以通过与细胞膜融合的方式进入细胞。
一旦脂质体/DNA复合物进入细胞，复合物会被内吞作用包裹成内吞体，内吞体随后与溶酶体融合形成溶酶体内嘌呤体。
在溶酶体内，复合物会被酸性环境和溶酶体内含的酶分解，释放出DNA分子。
最后，释放出的DNA会进入到细胞核中，并与细胞核中的染色体相结合，启动目标基因的表达。
脂质体转染的原理可以归纳为三个步骤：脂质体与DNA结合形成复合物，复合物与细胞膜融合进入细胞，复合物在细胞内释放DNA并进入细胞核。
这个过程提供了一种可靠的手段，用于将外源DNA引导进入目标细胞，实现基因传递和表达。
转染步骤111
转染步骤111基因转染技术简介常用的基因转染技术是将外源基因导入靶细胞需要一定的载体和导入方法，基因转技术则是将纯化的含有靶基因的质粒DNA送入细胞内，常用的基因转染技术是将外源基因导入靶细胞需要一定的载体和导入方法，基因转技术则是将纯化的含有靶基因的质粒DNA送入细胞内，并在细胞内表达。
转染方法有多种，根据不同的细胞，贴壁或悬浮细所可选用不同的方法，其目的是要达到设置转染效率，影响转染产率的因素有多种，包括转染方法、操作技术、质粒DNA 的纯度、靶细胞的生长状态等，下面重点介绍向几种常用的转染技术：被用于作靶基因转染的细胞，其生长状态如何，将直接决定了基因转染效率。
如为贴壁生长的细胞，一般要求在转染前一日，必需应用胰酶处理成单细胞悬液，重新接种于培养皿或瓶，细胞密度以铺满培养器皿的60%为宜，转染当日，在转染前4小时换一将近新鲜培养液。
对于悬浮细胞，也需在转染前4小时换一次新鲜培养液。
用于转染的质粒DNA必须无蛋白质，无RNA和其了化学物质的污染，OD260/280比值应在1.8以上。
应用酚-氯仿抽提法制备的质粒DNA一般难以达到此标准，目前大多采用进口的术提取纯化试剂盒。
具体的基因转染技术有鳞酸钙介导的转染法、DEAE葡聚糖介导转染法、脂质体介导转染法及电击基因转导尘等。
靶基因被导入细胞后，一般在转染后48小时，靶基因即在细胞内表达。
根据不同的实验目的，48小时后即可进行靶基因表达的检测等实验。
如若建立稳定的细胞系，则可对靶细胞进行筛选，根据不同基因载体中所含有的抗性标志选用相应的药物，最常用的直核表达基因载体的标志物有潮霉素（hygromycin）和新霉素（neomycin）。
常规转染技术可分为两大类，一类是瞬时转染，一类是稳定转染（永久转染）。
前者外源DNA/RNA不整合到宿主染色体中，因此一个宿主细胞中可存在多个拷贝数，产生高水平的表达，但通常只持续几天，多用于启动子和其它调控元件的分析。
细胞的脂质体转染法和电穿孔法
细胞的脂质体转染法和电穿孔转染法（一）脂质体转染一、实验试剂及器材Lipofectamine® 3000 Transfection Reagent，质粒DNA(0.5-5 μg/μL储液)，Opti-MEM®减血清培养基，培养板，酒精灯，离心机，微量移液器，离心管等。
二、实验步骤1. 接种细胞至70－90%汇合度时转染；2. 使用Opti-MEM®减血清培养基稀释Lipofectamine® 3000试剂（2管），充分混匀（6孔板Opti-MEM®培养基为125 μL× 2，Lipofectamine® 3000为3.75和7.5 μL）；3. 在每管已稀释的Lipofectamine® 3000试剂中加入稀释的DNA（用P3000TM试剂稀释）（1:1比例）；4. 室温孵育5分钟；5. 加入DNA－脂质体复合物至细胞中；6. 37°C(PK-15在39°C下培养)孵育细胞2–4天，然后分析转染细胞。
三、注意事项1. 在无血清培养基（如Opti-MEM®减血清培养基）中制备DNA－Lipofectamine® 3000脂质体复合物，直接将其加入含细胞培养基的细胞中（在血清／抗生素存在或不存在时均可）；2. 转染后无需去除转染复合物或者更换／添加培养基；3. Lipofectamine® 3000试剂用量各有不同，测试推荐的两种浓度的Lipofectamine® 3000试剂，以确定最佳用量，开始新的转染；4. Lipofectamine® 3000试剂应放在4℃储存（切勿冷冻）。
附上Lipofectamine 3000 REagent Protocol：（二）电穿孔转染法一、实验试剂及器材BTX ECM2001®2001细胞电融合仪，细胞，胰蛋白酶，电转液，DMEM，培养板，离心机等。
OPTI-MEM进行贴壁细胞培养的实验方法
OPTI-MEM进行贴壁细胞培养的实验方法日期：2012-05-17来源：互联网作者：青岚点击： 194次•MEM细胞培养基无血清培养基可以提供细胞贴壁需要的一些基质，本文总结了利用无血清培养基OPTI-MEM进行贴壁细胞的脂质体转染试验材料，步骤、个人经验以及问题分析。
贴壁细胞的脂质体转染一、实验材料1、宿主细胞CHO(贴壁细胞)2、脂质体LIPOFECTAMINE 2000(invitrogen公司)3、6孔细胞培养版4、无血清培养基OPTI-MEM(GIBICO)5、转染级质粒二、实验步骤invitrogen的LIPOFECTAMINE 2000说明书上列举了24孔、12孔、6孔......板的实验体系，因为需要转染的细胞量大，所以一直采用的是6孔版做的转染。
以下是以6孔板为例说明一下我的体系和方法吧!1、转染前一天，以合适的细胞密度接种到6孔培养板上。
(我的接种密度是3~4*105/ml.)转染时，细胞要达到90~95%的融合。
2、溶液1：240ul 无血清培养基 + 10 ul lipofectamine 2000 per well (总体积250 ul)(温育5min)3、溶液2：X ul 无血清培养基 + 4 ug 质粒 per well(总体积250 ul)4、将溶液1与溶液2混合，室温下置20min。
5、与此同时，将6孔板中的细胞用无血清培养基冲洗细胞两遍后，加入2ml 无血清培养基。
6、将溶液1与溶液2的混合液逐滴加入孔中，摇动培养板，轻轻混匀。
在37℃，5%的CO2中保温5~6小时。
7、6小时后，更换含有血清的全培养基，在37℃，5%的CO2中48~72h检测转染水平。
8、如果做稳定转染，换全培养基培养后24h，即可以1：10或更高的稀释比例(根据细胞的生长情况)接种到新的培养板，加抗生素进行筛选。
三、个人经验：我觉得贴壁细胞的脂质体转染还是很容易的，有了经验之后，现在做转染得心应手，转染前后细胞的形态几乎不发生变化，几乎没有细胞死亡。
耐药细胞株的筛选
耐药细胞株的筛选
一种是脂质体转染后，单克隆筛选稳定细胞株。
另外一种是应用逆转录病毒，慢病毒转染，筛选稳定细胞株。
脂质体转染：在转染24小时后，消化XXX细胞并计数。
将细胞种到96孔板，保证每个孔2-3个细胞，这样才能得到单克隆。
待细胞贴壁后，加入抗生素筛选。
筛选时间和浓度视细胞而定。
一般G418（Geneticin,遗传霉素）作用一个星期，嘌呤霉素作用2-3天。
脂质体法筛单克隆时间较长，且效率低，大概只有1%。
慢病毒转染：先要用包装细胞，一般为293细胞，包装出病毒，再用病毒转染目的细胞。
包装病毒视不同类型的病毒而定，一般要3-5天的时间。
包装好的病毒要测滴度，根据滴度决定转染目的细胞的病毒量。
转染目的细胞1-2天后加抗生素筛选得到稳定细胞株。
脂质体的转染原理
脂质体的转染原理
脂质体是一种由脂质和溶剂组成的胶束结构，可以用于体外和体内的基因转染。
转染是指将外源基因导入目标细胞内的过程。
脂质体的转染原理基于脂质体与细胞膜之间的相互作用和脂质体内基因的释放。
转染过程中，首先将目标基因（如DNA或RNA）与脂质体包裹在一起，形成脂质体-基因复合物。
这些复合物通过静电相互作用、疏水相互作用和膜融合等方式与细胞膜结合。
一旦脂质体-基因复合物结合到细胞膜上，脂质体与细胞膜之间的相互作用促使脂质体通过了细胞膜。
一种可能的机制是脂质体与细胞膜之间形成一个小的膜破裂，从而使基因从脂质体中释放出来。
经过释放，目标基因便能进入到细胞质中，通过细胞内的各种机制被转录成RNA 或翻译成蛋白质。
总的来说，脂质体转染的原理是通过脂质体与细胞膜的相互作用、基因释放和细胞内过程，将外源基因导入到目标细胞中。
脂质体转染实验步骤和细胞转染技术总述
脂质体转染实验步骤和细胞转染技术总述
一、脂质体转染实验步骤
1）细胞处理：细胞培养，细胞脱落，细胞悬液浓缩；
2）添加脂质体：将DNA与相应脂质体混合，可以将DNA结合到脂质体上；
3）细胞接种：将脂质体/DNA混合物接种到细胞悬液中，使DNA能够被细胞吞噬；
4）转染放置：将接种混合物保持在室温静置一定的时间，从而使DNA能够被细胞吞噬；
5）细胞活化：在静置期间，DNA会被细胞内吞噬，当添加激活剂和营养培养基时，细胞会活化；
6）细胞培养：在细胞活化后，细胞会被培养，并进行观察，以评估DNA转染的效果；
7）细胞收集：在培养过程中，可以通过浓缩细胞悬液，将转染后的细胞收集起来，以便进行其他分析。
细胞转染是将外源DNA片段转染到细胞中，从而改变其基因表达的技术。
目前常用的细胞转染技术有电转染、磁珠转染、质粒转染、脂质体转染等。
1）电转染
电染是一种最常用的染技术，即通过将DNA片段置于细胞悬液中，然后用微电流刺激，使DNA片段直接进入细胞。
脂质体转染_实验报告
一、实验目的本实验旨在通过脂质体转染技术将目的基因导入细胞内，研究脂质体转染方法对基因表达的影响，为后续基因功能研究提供技术支持。
二、实验材料1. 细胞：人胚肾细胞HEK2932. 载体：pGL3-Basic（含有报告基因）3. 脂质体：Lipofectamine 30004. 细胞培养试剂：DMEM培养基、胎牛血清、青霉素-链霉素溶液5. 实验仪器：超净工作台、CO2培养箱、酶标仪、显微镜、PCR仪等三、实验方法1. 细胞培养：将HEK293细胞接种于6孔板，待细胞汇合至80%时进行实验。
2. 脂质体-DNA复合物制备：将pGL3-Basic质粒DNA和Lipofectamine 3000试剂按照说明书比例混合，室温孵育20分钟。
3. 细胞转染：将脂质体-DNA复合物加入细胞培养孔中，轻轻混匀，37℃、5%CO2培养箱中孵育6小时。
4. 洗涤：弃去转染液，用PBS缓冲液洗涤细胞两次。
5. 优化培养条件：将细胞分为实验组和对照组，实验组加入脂质体-DNA复合物，对照组加入等量无DNA的脂质体。
6. 重组蛋白表达检测：收集细胞，提取总蛋白，进行Western blot检测目的蛋白表达水平。
7. 报告基因表达检测：收集细胞，提取总RNA，进行实时荧光定量PCR检测报告基因表达水平。
四、实验结果1. Western blot结果：实验组细胞中目的蛋白表达水平明显高于对照组（P<0.05），表明脂质体转染成功。
2. 实时荧光定量PCR结果：实验组细胞中报告基因表达水平明显高于对照组（P<0.05），表明脂质体转染对基因表达有显著促进作用。
五、实验讨论1. 脂质体转染技术在基因研究中的应用：脂质体转染技术具有操作简便、转染效率高、安全性好等优点，是基因研究中最常用的转染方法之一。
2. 本实验中，脂质体转染成功地将目的基因导入细胞内，并显著提高了报告基因的表达水平。
这表明脂质体转染技术在本实验中具有良好的效果。
脂质体转染技术步骤
脂质体转染实验步骤脂质体（LR）试剂是阳离子脂质体DOTMA和DOPE的混合物（1：1）。
它适用于把DNA转染入悬浮或贴壁培养细胞中，是目前条件下最方面的转染方法之一。
转染率高，优于磷酸钙法，比它高5-100倍，能把DNA和RNA转染到各种细胞。
用LR进行转染时，首先需要优化转染条件，应找出该批LR对转染某一特定细胞适合的用量、作用时间等，对每批LR都要做。
先要固定一个DNA的量和DNA/LR混合物与细胞相互作用的时间，DNA可从1-5ug和孵育时间6h，开始，按这两个参数绘出相应LR需用量的曲线，再选用LR和DNA两者最佳的剂量，确定出转染时间。
因LR对细胞有一定的毒性，转染时间以不超过24h为宜。
细胞种类：COS-7、BHK、NIH-3T3、Hela和Jurkat等任何一种细胞均可作为受体细胞。
1、操作步骤（方法一）：（1）：取6孔培养板，向每孔中加入2ml含（1-2） x 10^5个细胞的培养基，37℃、18% CO2培养基40%-60%汇合时。
（2）转染液制备：在聚苯乙烯管中制备以下两液（为转染1个空细胞所用的量）。
A液：用不含血清培养基稀释DNA使浓度为1-10ug，终量100ul。
B液：用不含血清培养基稀释LR，使终浓度为2-50ug，终量100ul。
轻轻混合A液、B液，室温中置10-15min，稍后会出现微浊现象，但并不妨碍转染。
（3）转染准备：用2ml不含血清培养基漂洗2次，再加入1ml不含血清培养基。
（4）转染：把A/B复合物缓缓加入培养基中，摇匀，置37℃温箱中6-24h，吸除无血清转染液，换入正常培养基继续培养。
（5）其余处理：如观察、筛选、检测等与其他转染法相同。
（6）注意：转染时切勿加血清，血清对转染效率有很大影响。
2、快速脂质体转染法操作步骤（方法二）：●∙∙∙∙∙∙∙ 将细胞以5 x 10^5个/孔接种于6孔板中培养24h，使其达到50%-60%板底面积。
●∙∙∙∙∙∙∙ 在试管中配制DNA-脂质体复合物。
三种不同方法转染THP-1巨噬细胞效果比较
三种不同方法转染THP-1巨噬细胞效果比较一、前言。
宝子们，今天咱们来唠唠转染THP - 1巨噬细胞这个事儿。
转染啊，就像是给细胞送快递，把一些我们想要的东西送进细胞里面去。
这THP - 1巨噬细胞在科研里可老重要了，研究它的转染效果对好多项目都有意义呢。
咱今天就专门来比较三种不同的转染方法，看看它们谁更厉害些。
二、转染方法简介。
1. 脂质体转染法。
这脂质体转染法就像是一个小包裹。
脂质体就像是一个脂质做成的小袋子，把要转染的东西包在里面，然后再跟细胞接触。
细胞就像是一个小房子，脂质体这个小包裹就想办法把东西送到房子里去。
这个方法操作起来相对简单，不需要啥特别复杂的仪器，实验室里比较常用。
不过呢，它有时候效率不是特别高，就像快递有时候送不到目的地一样。
2. 电穿孔转染法。
电穿孔转染法可就有点猛了。
它是给细胞加一个电脉冲，就像给细胞来一下子电击，把细胞膜上打出一些小通道，这样要转染的东西就顺着这些通道进到细胞里了。
这个方法转染效率有时候能比较高，但是对细胞伤害也比较大。
就好比强行把门打开把东西塞进去，门可能会有点损坏，细胞也可能会被电得有点不舒服，状态不太好。
3. 病毒载体转染法。
病毒载体转染法就像是找了个小间谍。
利用病毒能进入细胞的特性，把我们要转染的东西放在病毒里面，然后让病毒带着这些东西进入细胞。
这个方法转染效率可能也不错，而且能转染一些比较难搞的细胞。
不过呢，病毒这东西有点危险，得小心处理，要是处理不好，就像放了个小炸弹在实验室里，可能会带来一些意想不到的麻烦。
三、效果比较。
1. 转染效率方面。
脂质体转染法的转染效率相对来说是比较低的，就像在一群细胞里，只有一小部分细胞能收到我们的“快递”。
电穿孔转染法在合适的条件下，转染效率能比脂质体转染法高不少，能让更多的细胞得到转染。
病毒载体转染法呢，它的转染效率也比较可观，在一些情况下可能比电穿孔转染法还要好一点，能把东西送到更多的细胞里。
2. 细胞毒性方面。
转染技术2
pcDNA3.1-GFP转染细胞实验2009年08月07日09时21分55秒来源：未知浏览：286次【原理】外源基因进入细胞主要有三种方法：电击法、磷酸钙法和脂质体介导法，实际上其基本原理都是利用不同的方法在细胞上短时间暂时性的穿孔让外源质粒进入，但是由于前两者的效率低且伤害较大，所以现在除了对于一些特殊细胞系，一般的转染方法都利用脂质体。
利用脂质体转染和其他方法一样，最重要的就是防治其毒性，因此脂质体与治理的比例，细胞密度以及转染的时间长短和培养基中血清的含量都是影响转染效率的重要问题，通过实验摸索的合适转染条件对于效率的提高有巨大的作用。
图所示是脂质体介导转染的示意图，它显示了外源质粒进入细胞的一般过程。
本实验学习和掌握外源基因导入真核细胞的主要方法—脂质体介导的转染。
了解外源基因进入的一般性方法，观测外源蛋白的表达（绿色荧光蛋白）。
【试剂与仪器】1 ．小牛血清。
2 ．双抗溶液（链霉素100μg+ 青霉素100 单位）。
3 ．DMEM 培养基。
4 ．转染试剂（LIPOFECTAMINE 2000 ）。
5 ．细胞培养基（DMEM+10%NCS ）。
6 ．PBS 。
7 ．无血清培养基。
8 ．胰酶（Trypsin ）。
9 ．培养皿，移液管，量筒，恒温水浴箱，离心机，15ml 离心管，微量移液器，荧光显微镜和CCD 。
【操作步骤】1 ．转染前一天，胰酶消化细胞并计数，细胞铺板，使其在转染日密度为90% 。
细胞铺板在0.5ml 含血清，不含抗生素的正常生长的培养基中（参见表6 了解建议的细胞密度）。
2. 对于每孔细胞，使用50μl 无血清DMEM 培养基稀释0.8μg-1.0μg DNA 。
多孔操作可以批量制备。
3. 对于每孔细胞，使用50μl DMEM 培养基稀释1μl-3μl LIPOFECTAMINE 2000 试剂。
LIPOFECTAMINE 2000 稀释后，在5 分钟内同稀释的DNA 混合。
脂质体转染操作步骤
脂质体转染操作步骤
（一）准备材料
1.质粒：一般是由受体细胞胞浆抽提的质粒，其中含有DNA操纵因子、胞质蛋白等；
2.抗体：主要由混合物或单一蛋白质组成，用于鉴定质粒抗原性以及
抑制免疫反应；
3.细胞培养液：一般为包含细胞培养基和生长因子的混合物；
4.转染试剂：也称转染缓冲液，主要由多种物质，如阿拉伯胞浆清酯、卡夫培糖、酚红、多数体核酸等组成，用于载体细胞的传感和质粒的迁移。
（二）脂质体转染操作
1.取出细胞培养液，将受体细胞倒入培养管中，用浓度为0.25%（体
积比）的牛血清添加至8-10%，以细胞膜生长抗性抑制剂（如抗生素或吲
哚美辛）等抑制细胞膜的分裂，加以培养；
2.将培养液中的受体细胞的数量控制在2×105/ml以上，用酚酞红法
检测，检测结果达到要求后，把受体细胞从培养管中放入6 ml的离心管中，进行6000 g的离心；
3.将离心液放入新的容器中，把细胞抽出，再加入细胞稀释缓冲液
（以PBS或缓冲液为主，加入百维素或多数体核酸）至1×106/ml，离心5000 g；
4.将离心液抽出，用转染试剂缓冲液把细胞洗涤，再分别加入DNase I, 抗体和质粒，放入摇床中。
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一、实验材料
1、宿主细胞CHO（贴壁细胞）
2、脂质体LIPOFECTAMINE 2000（invitrogen公司）
3、6孔细胞培养版
4、无血清培养基OPTI-MEM（GIBICO）
5、转染级质粒
二、实验步骤
invitrogen的LIPOFECTAMINE 2000说明书上列举了24孔、12孔、6孔……板的实验体系，因为需要转染的细胞量大，所以一直采用的是6孔版做的转染。
以下是以6孔板为例说明一下我的体系和方法吧！
1、转染前一天，以合适的细胞密度接种到6孔培养板上。
（我的接种密度是3~4*105/ml.）转染时，细胞要达到90~95%的融合。
2、溶液1：240ul 无血清培养基+ 10 ul lipofectamine 2000 per well （总体积250 ul）（温育5min）
3、溶液2：X ul 无血清培养基+ 4 ug 质粒per well（总体积250 ul）
4、将溶液1与溶液2混合，室温下置20min。
5、与此同时，将6孔板中的细胞用无血清培养基冲洗细胞两遍后，加入2ml 无血清培养基。
6、将溶液1与溶液2的混合液逐滴加入孔中，摇动培养板，轻轻混匀。
在37℃，5％的CO2中保温5~6小时。
7、6小时后，更换含有血清的全培养基，在37℃，5％的CO2中48~72h检测转染水平。
8、如果做稳定转染，换全培养基培养后24h，即可以1：10或更高的稀释比例（根据细胞的生长情况）接种到新的培养基。
三、个人经验：
我觉得贴壁细胞的脂质体转染还是很容易的，有了经验之后，现在做转染得心应手，转染前后细胞的形态几乎不发生变化，几乎没有细胞死亡。
转染率很高。
以下是个人经验，与大家分享。
1.细胞的状态。
这点非常重要，不要急于求成，一定要让细胞处于最佳的生长状态再做。
有文献说传代不要超过17代。
我总是在细胞复苏后的3代左右做，那时细胞状态最好，不要用传了很多代的细胞去做，细胞的形态都会发生变化了。
2.细胞的融合度。
细胞的融合度必须要达到90%才能做，细胞太少，容易死的。
3.无血清培养基OPTI-MEM（GIBICO）很好用，有条件的话，就用它代替PBS洗细胞两遍（我曾比较过OPTI-MEM与PBS或无血清的DMEM，前者的转染效率确实高）。
注意洗的时候要轻，靠边缘缓缓加入液体，然后不要吹吸细胞，而是转动培养板让液体滚动在细胞表面。
如果洗的太厉害，细胞又损失一部分，加了脂质体后，细胞受影响就更大了，死亡细胞会增多。
4.加入无血清培养基后5~6小时更换全培养基。
无血清培养基培养时间过长，对细胞是有毒性的，这里有血的教训！
5.转染的质粒一定纯度好、浓度高、无内毒素。
浓度不要低于0.35ug/ul。
低浓度的质粒，我做的结果都不好。
6.48小时mRNA表达最高；72h蛋白表达最高。