_氨基丁酸受体介导的四逆散改善睡眠作用

表 1 RT-PCR 引物
待测基因 内参基因
序列 Forward： 5＇-ATGGGTCAGAAGGACTCCTAT-3＇ Reverse： 5＇-AACCGTGAAAAGATGACCCA-3＇
Forward： 5＇-TCTGAGCACACTGTCGGGAAG-3＇ GABAAα1
Reverse： 5＇-ACCCATCTTCTGCTACAACCACTG-3＇
RT-PCR （ Reverse transcription and polymerase chain reaction，逆转录-聚合酶链反应） 1． 5． 4． 1 PCR 引物 引物由上海捷倍基因技术公司合成，见 表 1。 1． 5． 4． 2 PCR 扩增 应体系如下： 见表 2。在 PCR 仪中 48℃ 孵育 45 分钟、94℃ 孵育 2 min 后进入 PCR 循环： 94℃ 30 s； 60℃ 1 min； 68℃ 2 min； 共循环 40 次，68℃ 延伸 7 min。
关键词 四逆散； γ-氨基丁酸； 睡眠
GABA（ γ-aminobutynic acid，γ － 氨基丁酸） 是哺乳动物中枢 神经系统内重要的抑Байду номын сангаас性神经递质，常见催眠药物和麻醉剂多 是通过增强 GABA 介导的神经传递来发挥作用的［1］。本实验 室研究发现，全方四逆散水煎液能明显延长阈上剂量戊巴比妥 钠所致小鼠睡眠 时 间，缩 短 入 睡 潜 伏 期，增 加 阈 下 剂 量 戊 巴 比 妥钠致小鼠入睡率［2］。通过多导脑电图描记，表明四逆散水煎 液可显著延长正常及失眠大鼠的总睡眠时间，在睡眠时相上表
计量 4． 0 μl 0． 4 μl 2． 0 μl 2． 0 μl 0． 8 μl 0． 4 μl 0． 4 μl 1． 0 μl 9． 0 μl
γ- 氨基丁酸受体介导的四逆散改善睡眠作用*
黄莉莉，于 爽，李廷利＊＊ （ 黑龙江中医药大学药学院，黑龙江 150040）
摘 要 目的：基于 γ-氨基丁酸-苯二氮卓类受体探讨四逆散改善睡眠作用机制。方法：观察了四逆散联合苯二氮卓类受体
阻断剂氟马西尼对戊巴比妥钠所致小鼠睡眠时间的影响，以及四逆散对 γ-氨基丁酸-苯二氮卓类受体 al 和 a5 亚单位 mRNA 表达的 影响。结果：四逆散 1． 25g / kg 连续给药 7 天，可以明显延长戊巴比妥钠所致小鼠的睡眠持续时间和缩短其潜伏期。氟马西尼 3． 5 mg /kg 可以明显阻断四逆散 1． 25g / kg 对戊巴比妥钠所致小鼠睡眠的增强作用。四逆散能使小鼠大脑皮质 γ-氨基丁酸 A 受体 a5 亚 单位的 mRNA 表达明显上调，有效剂量为 1． 25g / kg，给药起效时间为 7 天，给药 9 天效果较显著。结论：γ-氨基丁酸-苯二氮卓类受 体介导四逆散改善睡眠作用。
现为延长慢波睡眠和 REMS，并使觉醒时间显著减少［3，4］。为 此，本研究基于 GABA 能神经系统介导中枢神经抑制作用，探 讨四逆散改善睡眠作用机制。
1 材料与方法
1． 1 试验药物 四逆散冻干粉： 外观： 冻型饱满，复水性好，呈
* 基金项目： 本项目为国家自然科学基金资助项目（ 批准文号： 81073177）
The study on blood enriching function of Siwu Decoction and its active monomers on Blood-deficiency mice
Guo Ping1 ，Wang Shengqi2 （ 1 Shandong University of Traditional Chinese Medicine，Jinan 250355；
中药药理与临床 2012； 28（ 6）
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血虚证小鼠造血系统的影响． 中国实验方剂学杂志，2001； 7 （ 6 ） ∶ 35 ～ 38 6 惠爱武，冯文革，赵岗，等． 芍药苷对荷瘤小鼠化疗的减毒增效作 用研究． 陕西中医，2011； 32（ 7） ∶ 925 ～ 926 7 郭平，郭霞． 芍药苷对辐射致血虚证小鼠骨髓细胞白介素及其受体 基因表达的作用． 中药药理与临床，2009； 25（ 5） ∶ 25 ～ 27 8 郭平，宋卓彦，王升启． 芍药苷对辐射致血虚小鼠骨髓蛋白质表达 的影响． 中药药理与临床，2007； 23（ 4） ∶ 17 ～ 19
9 孙汉英，房明皓，任天华，等． 川芎嗪对骨髓移植小鼠骨髓造血的 影响． 中国血液流变学杂志，2001； 11（ 2） ∶ 93 ～ 96 10 张道宏，王婷婷，陈勤． 川芎嗪对免疫低下小鼠免疫功能的影响． 中药药理与临床，2007； 23 （ 4） ∶ 23 ～ 24 11 郭平． 川芎嗪对人骨髓成纤维样基质细胞蛋白质表达的影响． 山 东中医药大学学报，2007； 31（ 3） ∶ 230 ～ 234 12 郭平． 川芎嗪对辐射致血虚证小鼠骨髓细胞蛋白质表达的影响． 山东中医药大学学报，2007； 31（ 4） ∶ 322 ～ 325
Forward： 5＇-GCCTTGGAAGCAGCTAAAATC-3＇ GABAAα5
Reverse： 5＇-GAAGTCTTCTCCTCAGATGCTCTG-3＇
扩增长度 224bp 584bp 376bp
表 2 反应体系
加样 AMV / Tfl DNTP 混合物 Down 对照引物 Up 对照引物 MgSO4 AMV 反转录酶 Tfl DNA 多聚酶 模板 Rnase － free water
2 Academy of Military Medical Sciences，Beijing 100850）
Objective： To compare and research the blood enriching function of Siwu Decoction and its active monomers，paeoniflorin and ligustrazine，on radiation-induced blood-deficiency mice． Methods： The blood-deficiency mice were induced by using a single dose of 3． 5 Gy 60Co γ radiation． By using white blood cell count in peripheral blood and myeloid colony cell culture，the number of CFU-GM，BFU-E， CFU-E and CFU-mix were counted and the thymus and spleen index were measured． Results： Siwu Decoction 10g / kg，paeoniflorin 26． 5 mg / kg，and ligustrazine 11． 0 mg / kg can all significantly raise the number of white blood cell in peripheral blood and the number of myeloid colony cell，Siwu Decoction can notably raise thymus index，and Siwu Decoction and ligustrazine can significantly raise spleen index． Conclusion： Siwu Decoction，paeoniflorin and ligustrazine have blood enriching function． Among them，the function of Siwu Decoction is most significant and extensive． Ligustrazine has a significant effect on recovering spleen index． Key word Siwu Decoction； paeoniflorin； ligustrazine； blood-deficiency（ 血虚）
＊＊ 通讯作者
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中药药理与临床 2012； 28（ 6）
淡黄色，网状疏松。主要成分含量： 芍药苷不低于 2． 7% 、柴胡 皂甙 A 不低于 2． 3% 、柚皮苷不低于 3． 3% 、甘草次酸不低于 2． 7% 。四逆散冻干粉临用前用蒸馏水溶解，配成相应浓度的冻干 粉溶液。地西泮： 山东省平原制药厂 H37023039，2． 5 mg / 片。 1． 2 动物 小白鼠，清洁级，体重 16 ～ 18g，雄性，由黑龙江中 医药大学 GLP 实验室提供，证号： SCXK2008004。 1． 3 试剂 氟马西尼注射液（ 江苏恩华药业集团有限公司 H20055902，0． 5mg /5 ml） 。二乙基焦炭酸酯 （ 美国 Promega 公 司） ，Trizol RNA 提取试剂（ 美国 Invitrogen 公司） ，RT-PCR 试剂 盒（ 美国 Promega 公司） ，PCR Marker（ 美国 Promega 公司） ，GoldView 染料（ Buffer 公司） ，琼脂糖（ 原平皓生物技术公司） ，戊巴 比妥钠（ 国药集团化学试剂有限公司，批号 WS20060401，临用 时以蒸馏水配制成 0． 5% 溶液） 1． 4 仪器 TCT3 PCR 仪（ 德国 Eppendorf 公司） ，ChampGel 2000 数码凝胶成像分析系统（ 北京赛智创业科技有限公司） ， MDF-192 超低温冰箱（ 日本三洋公司） ，Ultrospec 3100 pro 分光 光度计（ 英国 Amersham Biosciences） 1． 5 方法 1． 5． 1 四逆散冻干粉改善睡眠作用的量效关系研究 小鼠随 机分成 6 组，每组 11 只，分别灌胃给予不同浓度的四逆散冻干 粉溶液 0． 2ml /20g，即 5g / kg、2． 5g / kg、1． 25g / kg、0． 63g / kg、0． 31g /kg，空白组给予同体积的蒸馏水，连续灌胃 7d，于末次给药 30 min 后，腹腔注射戊巴比妥钠 50 mg / kg，分别记录各组入睡 的潜伏期及持续时间。 1． 5． 2 四逆散冻干粉改善睡眠作用的时效关系研究 动物随 机分成 5 组，每组 10 只。给药组灌胃给予四逆散冻干粉溶液 1． 25g / kg，连续灌胃时间分别为 3 d、5 d、7 d、9 d，空白组给予同 体积的蒸馏水，末次给药 30 min 后，腹腔注射戊巴比妥钠 50 mg / kg，分别记录各组入睡的潜伏期及持续时间。 1． 5． 3 四逆散冻干粉联合氟马西尼对戊巴比妥钠所致小鼠睡 眠的影响 小鼠随机分为 6 组，每组 10 只，分别为空白组、四逆 散组、四逆散 + 氟马西尼组、地西泮组、地西泮 + 氟马西尼组、氟 马西尼组。灌胃给予蒸馏水或四逆散冻干粉溶液（ 1． 25g / kg） ， 连续灌胃 9 天，地西泮（ 2． 5 mg / kg） 灌胃给予 1 次，氟马西尼（ 3． 5 mg / kg） 于注射戊巴比妥钠前 20 min 腹腔注射，所有各组末次 灌胃给药（ 水） 30 min 后，腹腔注射戊巴比妥钠 50 mg / kg，分别 记录各组翻正反射消失的潜伏期及持续时间。 1． 5． 4 四逆散冻干粉对小鼠大脑皮质 GABAA 受体基因表达 的影响 动物随机分为 3 组，每组 4 只，分别为空白组、四逆散 组，地西泮。灌胃给予蒸馏水或四逆散冻干粉溶液 1． 25g / kg， 连续灌胃 9 天，地西泮 2． 5 mg / kg 灌胃给予 1 次，所有各组动物 末次灌胃给药（ 水） 30 min 后，断头处死，在冰皿上迅速分离出 大脑皮质。RNA 抽提按照试剂盒说明，常规提取 RNA。采用紫 外分光光度计测定总 RNA260 nm 和 280 nm 波长处的光吸收 值，得到 A260 / A280 比值，其比值均≥1． 8，纯度较好。