提取酒醅总RNA试验方案

酒醅总RNA提取试验方案

各种提取方法所用到的研钵等器皿用锡箔纸包裹，180℃烘箱高温干热灭活RNA酶12 h，其他耗材120℃高温高压灭菌40 min。

一、改良CTAB法

预处理：10g-20g酒醅置于含90ml无菌水三角瓶中，震荡10—15min，取上层液体5-10ml 于离心管，12000r/min离心5min，弃上清，重复此步骤以无菌去离子水洗涤一次，沉淀加入3-5ml 5%中温淀粉酶液混匀，40-50℃保温1小时，加1ml液化酶混匀，40-50℃保温1小时，12000r/min离心5min，弃上清，加无菌去离子水混匀，加3-5ml 5%纤维素酶液混匀，40-50℃保温1小时，12000r/min离心5min，弃上清，加无菌去离子水混匀，重复此步骤以彻底去除干扰物质[3]。

测两个指标：①加入之后测淀粉、纤维素指标变化：碘液法？分光光度计测透光率？

②微生物数量变化，看预处理之后微生物死没死：涂平板

淀粉的测定：碘-淀粉比色法

原理:淀粉可与碘生成蓝色配合物，在一定浓度范围内，配合物颜色的深浅与样品中淀粉的含量成正比，即吸光度值与淀粉含量之间的关系符合朗伯比尔定律，故可用分光光度法测定样品中淀粉的含量。

仪器及试剂:分光光度计，50mL烧杯，研钵，100mL无色容量瓶（2个），洗瓶，漏斗，滤纸，具塞刻度试管（15ml），恒温水浴装置，移液管（1ml,2ml），I2-KI溶液（碘化钾8g；蒸馏水100ml；碘1g。先将碘化钾溶于蒸馏水中，待全部溶解后再加碘，振荡溶解。注：将此液保存在棕色玻璃瓶内。），乙醚，80%乙醇

测定方法：

①标准曲线的制作

试剂的配制:(1)2 g／L淀粉标准溶液的配制：称取0.2 g可溶性淀粉于50ml干净烧杯中,用蒸馏水打湿，搅匀，加入25ml沸腾的蒸馏水，搅拌均匀，在电炉上再保持沸腾,5min拿下，再加入蒸馏水25 ml，搅拌冷却至室温后转移至100ml无色容量瓶中，用蒸馏水定容，摇匀。

(2)0.2％I2-KI标准溶液的配制：称取0.2 g碘和0.5 g碘化钾，放入50ml烧杯中，加蒸馏水溶解，转移至100ml棕色容量瓶中，用蒸馏水定容，摇匀。0.02％I2-KI标准溶液的配制：移取上述标准溶液10．00ml于100 ml棕色容量瓶中用蒸馏水定容，摇匀。

取100 ml棕色容量瓶8个，按下表进行，用水稀释至刻度，摇匀，第一个容量瓶里的溶液

②测定:（称离心管质量m1，离心弃上清后质量m2）向离心后的沉淀（记质量m2-m1）加入8mlI2-KI溶液→直至溶液呈现透明蓝色→蒸馏水补足到10ml，混匀，静置10min→610nm 波长测定吸光度值，由标准曲线查出样品中淀粉的含量。

×100%

③结果计算:淀粉质量分数=c×10×10−3

m

式中：c—从标准曲线查得的样品淀粉含量，mg/ml；

m—试样的称样量，g；

10—样品体积

10-3—将mg换算成g。

纤维素含量的测定：分光光度法

实验原理:纤维素(cellulose)为β－葡萄糖残基组成的多糖，在酸性条件下加热能分解成β－葡萄糖。β－葡萄糖在强酸作用下，可脱水生成β－糠醛类化合物。β－糠醛类化合物与蒽酮脱水缩合，生成黄色的糠醛衍生物。颜色的深浅可间接定量测定纤维素含量。

仪器 :试管、量筒、烧杯、移液管、容量瓶、布氏漏斗、天平、水浴锅、电炉、分光光度计。溶液： 60％H2SO4溶液；浓H2SO4(AR) ；2％蒽酮试剂：将2g 蒽酮溶解于100mL 乙酸乙酯中，贮放于棕色试剂瓶中；纤维素标准液：准确称取100mg 纯纤维素，放入100mL 量瓶中，将量瓶放入冰浴中，然后加冷的60％H2SO460～70mL，在冷的条件下消化处理20～30min，然后用60％H2SO4稀释至刻度，摇匀。吸取此液5.0mL 放入另一50mL 量瓶中，将量瓶放入冰浴中，加蒸馏水稀释至刻度，则每mL 含100μg纤维素。

操作步骤：

1. 求纤维标准回归方程

⑴ 6支小试管，分别放入0、0.40、0.80、1.20、1.60、2.00mL 纤维素标准液，然后分别加入

2.00、1.60、1.20、0.80、0.40、0mL 蒸馏水，摇匀，则每管依次含纤维素0、40、80、120、

⑵向每管加0.5mL2％蒽酮，再沿管壁加5.0mL 浓H2SO4，塞上塞子、摇匀，静置1min。然后在620nm 下，求测不同含量纤维素溶液的吸光度。

⑶以测得的吸光度为Y 值，对应的纤维素含量为X 值，求得Y 随X 而变的回归方程。

2. 样品纤维素含量的测定

（1）称取风干的棉花纤维0.2g 于烧杯中，将烧杯置冷水浴中，加入60％H2SO460mL，并消化30min，然后将消化好的纤维素溶液转入100mL 容量瓶，并用60％H2SO4定容至刻度，摇匀后用布氏漏斗过滤于另一烧杯中。

（2）上述滤液5mL 放入100mL 容量瓶中，在冷水浴上加蒸馏水稀释至刻度，摇匀后用。（3）取2中的溶液2mL 于具塞试管中，加入0.5mL2％蒽酮试剂，并沿管壁加5mL 浓H2SO4，塞上塞子，摇匀，静置12min，然后在620nm 波长下，求测吸光度。

计算 :根据测得的吸光度按回归方程求出纤维素的量，然后按下式计算样品纤维素的含量：Y(%)=X*10-6*a*100*w

式中： X—按回归方程计算出的纤维素含量（ug）；

10-6—将ug换算成g的系数；

a—样品稀释倍数 W—样品重量(g)；

Y(%)-样品中纤维素含量（%）

RNA提取步骤：①+等菌体体积玻璃粉（目测即可）+ 1mlCTAB试剂（2%CTAB，2%PVP，1.4M 氯化钠，100mM Tris，20Mm EDTA，1%β-巯基乙醇或者10%β-巯基乙醇（v/v））（以上均在超净工作台内操作）

②冰浴5min，漩涡震荡器震荡10min，室温静置5-10min（使核酸和蛋白质完全分离）

③65℃水浴30min(每隔10min上下颠倒震荡)，室温静置5min

④12000g，4℃，离心10min（先打开大离心机降温），收集上层水相于新离心管中，加入等体积酚-氯仿-异戊醇（通风橱操作），稍微漩涡震荡（抽提RNA，同时除去蛋白），12000g，