RNA转录与转录后加工

第7章 RNA转录与转录后加工1 本章主要内容1)转录的基本概念2)大肠杆菌RNA聚合酶及其转录3)真核生物的RNA聚合酶及其转录4)RNA的转录后加工和反转录2 教学目的和要求通过本章学习，掌握转录的基本概念，原核转录的主要参与者（RNA聚合酶和启动子）以及原核转录的过程（起始、延伸和终止）。

1)掌握真核转录的三种主要RNA聚合酶、所转录的基因类型和参与转录过程各种因子等。

2)了解不同前体RNA的加工机制。

3)了解反转录的特点3 重点难点1) 转录2) 大肠杆菌RNA聚合酶、原核转录的过程3) 真核生物的RNA聚合酶、真核转录过程、转录因子4) RNA的转录后加工、反转录4 教学方法与手段讲授与交流互动相结合，采用多媒体教学。

5 授课内容1) RNA转录概述2) 细菌基因的转录3) 真核生物的转录4) RNA的转录后加工5) RNA的反转录第一节 RNA转录概述一、信使的发现•1955年Brachet用洋葱根尖和变形虫进行实验：–若加入RNA酶，则蛋白质合成就停止；–若再加入来自酵母的RNA，又可合成蛋白质。

这表明什么？•同年Goldstein和Plaut用同位素标记变形虫RNA前体——•发现标记的RNA在核内。

•标记追踪实验：经过一段时间又发现被标记的RNA在细胞质中，•这表明什么？•1956年E. Volkin和 L.Astrachan：•用同位素脉冲一追踪标记•表明T2噬菌体新合成的RNA的碱基比和自身的DNA碱基比相似，而和细菌的碱基比不同。

T2感染细菌时注入的是DNA，而在细胞里合成的是RNA。

•这表明什么？•最令人信服的证据是Hall.B.D和Spiegeman,S的DNA-RNA的杂交实验：•将T2噬菌体感染E.coli后产生的RNA分离出来，分别与T2和E.coli的DNA进行分子杂交。

•结果这种RNA只能和T2的DNA形“杂种”链，而不能和E.coli的DNA进行杂交。

Jacob和Monod预言:（1）这种“ 信使”应是一个多核苷酸；（2）其分子平均不小于5105bp,足以携带一个基因的遗传信息；（3）它们至少是暂时连在核糖体上；（4）其碱基组成反映了DNA的序列；（5）它们能高速更新。

Jacob和Monod将它定名为: 信使RNA (Messenger RNA) 或mRNA。

二、几个基本概念•转录(transcription):是指以DNA为模板，在依赖于DNA的RNA聚和酶催化下，以4种rNTP（ATP、CTP、GTP和UTP）为原料，合成RNA的过程。

•在有些病毒中，RNA也可以指导合成RNA。

•转录是基因表达的第一步，也是最关键的一步。

三、 RNA合成的基本特点•1960年Weiss,S,B等发现RNA聚合酶(RNA Pol)。

其特点是：（1）以核糖核苷三磷酸（rNTR）为底物；（2）以DNA为模板；（3）按5′-3′方向合成；（4）无需引物的存在能单独起始链的合成；（5）第一个引入的rNTP是以三磷酸形式存在；（6）在体内DNA双链中仅一条链作为模板；（7）RNA的序列和模板是互补的。

确定有义链•1963 J.Marmur和Doty Spiegelnan区分有义链。

采用枯草杆菌的SP8噬菌体为材料，SP8 DNA 双链有“ 轻”、“ 重”差异明显。

•现在将作为转录模板的DNA单链称为模板链或反义链（antisen strand），•非模板链称为有义链（sense strand）或编码链。

•在体外DNA的两条链都可作为RNA合成的模板。

•怎样用实验证实mRNA的合成总是延着5’- 3′方向进行的？•E.coli在 0C时需13秒钟才能加上一个核苷酸，但在37C每秒就可加上40个核苷酸;•利用这个差别以14C来标记U, 在0C培养E.coli，。

•提取这种正在伸长的mRNA分子,发现——•14C标记首先出现在伸长的3′端，因此可以证明合成是延着5′-3′方向进行的。

四、 RNA合成和DNA复制的区别(1) 转录时只有一条DNA链为模板，而复制时两条链都可作为模板；(2) DNA-RNA杂合双链不稳定，RNA合成后释放，而DNA复制叉形成后一直打开，新链和母成子链；(3) RNA合成不需引物,而DNA复制需引物；(4) 转录的底物是rNTP，复制的底物是dNTP；(5) 聚合酶系不同。

第二节细菌基因的转录一、细菌的RNA聚合酶1. 全酶 (Holo Enzyme)和核心酶(Core Enzyme)(1) 全酶（Holo Enzyme）•用于转录的•依靠空间结构与DNA模板结合 (σ与核心酶结合后引起的构象变化)•专一性地与DNA序列(启动子)结合•结合常数：1014／mol•半衰期：数小时（107／mol 1秒以下）•转录效率低，速度缓慢（σ的结合）（2）核心酶（Core Enzyme）•作用于转录的延伸过程（终止）•依靠静电引力与DNA模板结合（蛋白质中碱性基团与DNA的磷酸根之间）•非专一性的结合（与DNA的序列无关）•结合常数：1011／mol•半衰期：60秒E.Coli RNApol 的亚基组成core enzyme（3）全酶的组装过程•此外，新发现的一种ω亚基的功能尚不清楚。

2. 各亚基的特点和功能（1）σ因子• σ因子可重复使用• 修饰RNApol构型• 使Holo Enzyme 识别启动子的Sextama Box(－35区), 并通过σ与模板链结合E.coli中不同的因子可识别不同的启动子（2）α因子•核心酶的组建因子•促使RNApol 与DNA模板链结合•前端α因子－－使模板DNA双链解链为单链•尾端α因子－－使解链的单链DNA重新聚合为双链（3）β因子•完成NMP之间的磷酸酯键的连接;•Editing 功能 (排斥与模板链不互补的碱基);•与Rho （ρ）因子竞争RNA 3’－end;•构成Holoenzyme 后,β因子含有两个位点;•I site (initiation site . Rifs): 该位点专一性地结合;•ATP或者GTP (需要高浓度的ATP或GTP);•E site(elongation site RifR): 对NTP非专一性地结合（催化作用和Editing 功能）.（4）β’ 因子•参与RNA非模板链（sense strand）的结合（充当SSB）•有义DNA链结合位点（β’亚基提供）•DNA/RNA杂交链结合位点（β亚基提供）•双链DNA解链位点（前端α亚基提供）•单链DNA重旋位点（后端α亚基提供）•σ因子作用位点原核生物RNApol (Core) 的结构与功能RNA pol 执行多种功能(1) 识别DNA双链上的启动子；(2) 使DNA变性在启动子处解旋成单链；(3) 通过阅读启动子序列，RNA pol确定它自己的转录方向和模板链；(4)最后当它达到终止子时，通过识别停止转录。

二、原核生物转录的起始延伸1．启动子（promoter）的结构和功能启动子(promoter)：是指DNA分子上被RNA聚合酶识别并结合形成起始转录复合物的区域，它还包括一些调节蛋白因子的结合位点。

启动子由两个部分组成●上游部分— CAP-cAMP结合位点：（基因表达调控的正控制位点）CAP（catabolite gene Activator Protein）降解物基因活化蛋白，环腺苷酸（cAMP）的受体蛋白●下游部分— RNApol的进入（结合）位点－35 ~ －10包括识别位点和结合位点（R B位点）2． RNA聚合酶的进入位点（1）Sextama 框（Sextama Box）–-35序列，RNA聚合酶的松弛（初始）结合位点–RNA聚合酶依靠其σ亚基识别该位点，为转录选择模板——识别位点（R位点）–大多数启动子中共有序列为 T82T84G78A65C54A45–重要性:很大程度上决定了启动子的强度（RNApol 的σ因子）（2） Pribonow 框（Pribonow Box）•-10序列是由Pribnow和Schaller（1975）发现，故也称为Pribnow框盒（Pribnowbox）。

•-10序列，RNA聚合酶的牢固结合位点——结合位点（B位点）•一致序列：T80A95T45A60A50T9（TATP U AT），因此又称TATA Box•位置范围－4 到－13（3）转录起始位点（I）•＋1位点•RNA聚合酶的转录起始位点•转录开始时模板上的第一个碱基在原核中常为A或G•而且位置固定典型启动子的结构3．起始过程(1) 全酶与模板DNA接触，生成非专一的,不稳定的复合物在模板上移动；(2) 起始识别：全酶与－35序列结合，产生封闭的酶-启动子二元复合物（closedbinary complex）；(3) 全酶紧密地结合在-10序列处，模板DNA局部变性，形成开放的启动子二元复合体；(4) 酶移动到I，第一个rNTP转录开始,σ因子释放,形成酶-启动子-rNTP三元复合体（ternary complex）。

图起始过程图RNA核心酶和全酶在DNA上的分布:①σ和1/3的RNA pol结合成全酶，或在非特异位点的松散复合体中，或在启动子中的二元复合体中；②其中半数的核心酶从事转录；③余下的核心酶大量存在于闭合松散复合体中；④估计数量很少的全酶是游离的。

4．RNA链延伸三原核生物转录的终止1．终止子的种类（1）不依赖ρ因子的终止子(内在终止子) ：体外实验中，只有核心酶和终止子就足以使转录终止（2）依赖ρ因子的终止子：蛋白质辅助因子－－ρ因子存在时，核心酶终止转录两者有共同的结构特征（序列差异）①不依赖ρ因子的终止子(强终止子)•结构特征:☻一是形成一个发夹结构茎…. 7~20 bp的IR序列形成（富含G/C）环….中间不重复序列形成发夹结构的突变可阻止转录的终止☻二是6 ~ 8 个连续的U串(发夹结构末端)②、依赖ρ因子的终止子a 结构 IR序列中的 G／C 对含量较少发夹结构末端没有固定特征b 靠与ρ的共同作用而实现终止2．原核生物转录的终止（1）不依赖ρ因子的终止子终止转录①新生RNA链发夹结构形成造成高度延宕（典型的有60秒左右）②RNApol暂停为终止提供了机会，6 ~ 8个连续的U串可能为RNApol与模板的解离提供了信号RNA－DNA之间的 rU－dA 结合力较弱于是：RNA－DNA解离→三元复合体解体→ RNApol解离→转录终止③真正的终止点不固定，在 U串中的任何一处④IR序列和U串同等重要IR中的G／C对含量的减少U串的缩短或缺失⑤DNA上与U串对应的为富含A／T的区域说明：AT富含区在转录的终止和起始中均起重要的作用（2）依赖ρ因子的终止子终止转录①通读（read through）：ρ因子的转录终止过程中， RNApol 转录了 IR 序列之后，虽发生一定时间的延宕，但如果没有ρ因子存在，则RNApol 会继续转录②ρ因子a、活性形式为六聚体促进转录终止的活性，NTPase 活性b、RNA长度大于50nt时，依赖RNA的NTPase活性最大说明：ρ因子识别和结合的是RNA③ρ因子对终止子的作用a、ρ因子与RNA结合（终止子上游的某一处，RNA的5’端）b、ρ因子沿RNA从5’→3’移动（NTP水解供能）（终止子处的较长时间的延宕给ρ因子追赶的机会）c、ρ因子与 RNApol 相互作用而造成转录的终止RNA Pol转录DNAρ因子附着到RNA识别位点上●ρ因子跟在R NA Pol 后沿RNA移动● RNAPol在终止位点停下，并被ρ因子追上●在转录泡中ρ因子使DNA-RNA杂种双链解开●转录终止,释放出RNA Pol, ρ子和RNA④终止反应还需要 RNA 与 DNA 的相互作用•即：需要一定的RNA序列•因为：其与模板的结合力必须弱到一定数值，才能配合ρ因子与 RNApol 的作用（发夹结构下游的AU序列）•序列不同的终止子→不同的终止程度→基因表达调控的途径之一要点回顾◆几个基本概念5’----GCAGTACATGTC-----3’编码链 DNA3’----CGTCATGTACAG-----5’模板链5’----GCAGUACAUGUC-----3’ mRNAN -----Ala--Val--His--Val------C 蛋白质➢不对称转录1.DNA双链上，一股链可转录，另一股不转录。