人组织激肽释放酶成熟蛋白在大肠杆菌中的高效表达
大肠杆菌表达蛋白酶
大肠杆菌表达蛋白酶大肠杆菌表达蛋白酶是指在大肠杆菌(Escherichia col i)中表达的蛋白酶,这些蛋白酶可以是细菌自身的酶,也可以是外源基因在大肠杆菌中表达的酶。
大肠杆菌作为一种常用的宿主细胞,在基因工程和生物技术中被广泛用于蛋白质表达。
以下是一些关于大肠杆菌表达蛋白酶的要点。
1.内源蛋白酶:大肠杆菌自身产生多种蛋白酶,这些酶在细菌的生长和代谢过程中发挥作用,如负责细胞内蛋白质降解的Lon酶和ClpP酶。
2.外源蛋白酶表达:外源蛋白酶基因可以通过基因克隆技术插入到大肠杆菌的质粒或染色体中,然后通过转录和翻译过程在大肠杆菌中表达。
为了提高外源蛋白酶的表达水平,常使用强启动子和优化密码子使用。
3.表达系统的选择:大肠杆菌表达系统有多种类型,如T7表达系统、Lac 和Tac表达系统、PL和PR表达系统等,不同的系统具有不同的特点和适用场景。
4.优化表达条件:为了提高蛋白酶的表达效率和活性,需要优化培养条件,如温度、pH、氧气供应、诱导剂的使用等。
5.蛋白质折叠和修饰:外源蛋白酶在大肠杆菌中表达后,可能需要适当的折叠和后翻译修饰才能获得活性。
这可能需要在表达过程中添加辅助因子或在表达后进行体外修饰。
6.蛋白酶的纯化和分析:表达的蛋白酶可以通过各种蛋白质纯化技术进行纯化,如亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤等。
纯化后的蛋白酶可以进行活性分析、结构分析等进一步研究。
7.应用:大肠杆菌表达蛋白酶在生物医药、农业、工业等领域有广泛的应用,例如在药物开发、疾病诊断、生物催化等方面。
大肠杆菌表达蛋白酶的研究和应用是生物技术领域的一个重要分支,对于理解蛋白质的功能、结构和相互作用具有重要意义,同时也为生物制药和生物工程提供了重要的工具。
KLK8通过调节EGF对结直肠癌细胞凋亡的影响及其机制
383欢迎关注本刊公众号·论 著·《中国癌症杂志》2021年第31卷第5期CHINA ONCOLOGY 2021 Vol.31 No.5基金项目:国家自然科学基金(81471852);上海市自然科学基金(20ZR1412900)。
通信作者:许平波 E-mail: xupingboshanghai@KLK8通过调节EGF对结直肠癌细胞凋亡的 影响及其机制花 晴,申雪芳,许平波复旦大学附属肿瘤医院麻醉科,复旦大学上海医学院肿瘤学系,上海200032[摘要] 背景与目的:结直肠癌是中国常见的消化道恶性肿瘤之一。
组织激肽释放酶相关肽酶8(kallikrein-related peptidase 8,KLK8)是一种丝氨酸蛋白酶,其异常表达对多种肿瘤的发生、发展具有重要作用,但其对结直肠癌细胞凋亡的影响鲜有报道。
表皮生长因子(epidermal growth factor ,EGF )可通过多种机制抑制细胞凋亡,在肿瘤的发生、发展过程中发挥重要作用。
探讨KLK8通过调节EGF 对结直肠癌细胞凋亡的影响及其机制。
方法:采用GEO 芯片数据集GSE21815、GSE37182和GSE71187分析结直肠癌组织中KLK8的表达水平。
采用KLK8质粒和KLK8 siRNA 构建结直肠癌细胞系RKO 和SW480细胞的KLK8过表达稳定转染细胞株和KLK8敲低细胞株,采用AnnexinⅤ-FITC/PI 双染法流式细胞术检测过表达前后结直肠癌细胞的凋亡。
以癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas ,TCGA )数据库为基础,采用基因集富集分析法(gene set enrichment analysis ,GSEA )下的“GO”基因集对KLK8高表达和低表达的结直肠癌组织进行基因表达分析。
采用酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay ,ELISA )法检测过表达KLK8对EGF 蛋白水平的影响。
某理工大学《现代分子生物学》考试试卷(630)
某理工大学《现代分子生物学》课程试卷(含答案)__________学年第___学期考试类型:(闭卷)考试考试时间:90 分钟年级专业_____________学号_____________ 姓名_____________1、分析题(5分,每题5分)1. 写出原核表达实验步骤。
答案:原核表达实验步骤如下:(1)按上述步骤提取该组织的RNA,反转录为cDNA。
(2)以cDNA为模板,用上述引物扩增出带酶切位点的A基因片段。
(3)用BamHI和EcoRI分别切割目的片段和载体,连接酶将A 基因和载体连接起来构成重组质粒。
(4)将重组质粒转入感受态的大肠杆菌BL21中,涂布,根据载体所携带的抗性标记筛选出稳定遗传重组质粒的单克隆。
(5)摇菌、扩大培养,待菌液生长到对数生长期,收集菌体,裂解、收集蛋白质。
(6)将总蛋白制备成溶液通过镍柱,由于A蛋白携带有His标签,可以被吸附在镍柱上,然后加缓冲液将吸附在镍柱上的A蛋白洗脱下来,即可得到A蛋白溶液。
解析:2、判断题(80分,每题5分)1. 动物细胞中线粒体有自己的基因组,其编码基因可以在线粒体中完成转录和翻译过程。
()答案:错误解析:2. B型双螺旋是DNA的普遍构型,而Z型则被确定为仅存在于某些低等真核细胞中。
()答案:错误解析:B型双螺旋是DNA的普遍构型,而Z型在高等真核生物中也有发现,往往与基因表达调控有关。
3. 细胞内DNA复制后的错配修复不需要消耗能量。
()答案:错误解析:细胞内DNA复制后的错配修复需要水解ATP提供能量。
4. 一个基因就是一个转录单位。
()答案:错误解析:转录单位是一段可被 RNA聚合酶转录成一条连续的mRNA的DNA,包括转录起始和终止信号。
转录单位不同于基因,转录单位可能同时包含一个基因,也可能同时包含几个基因,另外,转录单位还包含启动子,非编码序列等。
所以,转录单位包含的DNA范围比基因广。
5. tRNA转录后加工有剪接反应,它是由蛋白质催化的。
iptg诱导大肠杆菌表达原理
IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)是一种化学诱导剂,常用于激活大肠杆菌表达系统中的T7启动子。
通过加入IPTG,可以促进靶蛋白的表达,从而实现对目的蛋白的高效生产。
下面我们来详细了解一下IPTG诱导大肠杆菌表达的原理。
1. T7启动子T7启动子是一种强效启动子,它可以在大肠杆菌中高效转录外源DNA。
T7启动子的活性受到T7 RNA聚合酶的调控,而T7 RNA聚合酶是一种高度特异性的RNA聚合酶,在大肠杆菌中并不存在。
当T7启动子与T7 RNA聚合酶相结合时,便可高效产生目的蛋白。
2. IPTG的作用IPTG是一种结构类似于乳糖的化合物,它可以结合到lac重pressor 蛋白上,从而阻止其对T7启动子的抑制作用。
在含有T7启动子和T7 RNA聚合酶的表达系统中,当添加IPTG后,它与lac repressor蛋白结合,使其失活,进而释放T7启动子,使T7 RNA聚合酶能够充分地转录外源DNA,从而高效表达目的蛋白。
3. IPTG浓度的选择在IPTG诱导大肠杆菌表达的过程中,IPTG的浓度选择非常重要。
一般来说,IPTG的最佳浓度应该能够充分激活T7启动子,同时又不会对大肠杆菌本身的生长造成太大的影响。
通常情况下,0.1-1.0mM的IPTG浓度是比较常用的范围。
4. IPTG诱导的时间和温度除了IPTG的浓度外,诱导时间和温度也会影响大肠杆菌表达系统的效果。
通常情况下,IPTG诱导的时间可以根据不同的目的蛋白进行优化,一般为4-16小时。
而温度则可以选择在37摄氏度左右进行诱导。
5. 相关注意事项在进行IPTG诱导大肠杆菌表达时,还需要注意一些相关的技术细节。
需要对大肠杆菌培养基进行预处理,保证培养基中的IPTG没有降解或者受到污染。
另外,在IPTG诱导的过程中需要监测大肠杆菌的生长情况,及时调整诱导条件,以保证目的蛋白的高效表达。
IPTG诱导大肠杆菌表达的原理主要是通过结合到lac repressor蛋白上,解除其对T7启动子的抑制作用,从而实现T7启动子的高效激活,使T7 RNA聚合酶能够高效转录外源DNA,最终实现对目的蛋白的高效表达。
人中性粒细胞弹性蛋白酶及其抑制剂研究
人中性粒细胞弹性蛋白酶及其抑制剂研究人中性粒细胞弹性蛋白酶(human neutrophi l elastase,HNE)在机体各种炎症反应、组织损伤重构(如肺炎)、成人呼吸窘迫综合征、肺纤维化、急(慢)性肺损伤、肺水肿、动脉粥样硬化、硬皮病等病理过程中起重要作用,并且具有促进病毒、细菌的侵人及癌细胞转移的功能。
炎症机制研究显示,体内该酶及其内源性抑制剂的平衡失调可导致组织基质降解和炎症的恶化。
目前,国外用HNE抑制剂来治疗这一类炎症疾病的研究非常广泛,并已成功开发出第一个以抑制HNE为治疗途径的上市药物西维来司钠(sivelestat sodium hydrate),从而促进了HNE抑制剂的研究与开发。
1 BM的生理、病理作用及结构特征HNE,又称人白细胞弹性蛋白酶(human leukocyte elastase,IRE),属于基质金属蛋白酶类(matrix metalloproteinases,MMPs),即MMP-12,是一种金属离子依赖性基质降解酶,需要微量Zn2+和Ca2+离子的存在才具有酶活性,其底物类型非常广泛,几乎可降解细胞外基质中的所有蛋白。
白细胞、巨嗜细胞、肥大细胞内都存在着这种酶,中性粒细胞中其含量很高,大约每106个细胞中含有HNE的总量为 3μg。
生理条件下,HNE可以协助清除异源性物质,促进吞噬细胞消除有害病菌,并帮助消化受损组织,有助于伤口的愈合与组织再生。
而HNE过量表达则会对机体组织、基质造成危害,表现为破坏血管壁组分,使中性粒细胞更容易渗出血管并向炎症部位趋化集中及释放IL-8、TNF-α等炎症因子;它还能降解细胞基质,催化caspase 3诱导的细胞凋亡。
据报道,HNE还能增强病毒、细菌及癌细胞对正常细胞的黏附能力,促进微生物的入侵及癌细胞的增殖和转移。
HNE存在于中性粒细胞嗜苯胺蓝颗粒中,是由 218个氨基酸组成的单一肽链,分子质量大约25.9 kD,含4个二硫键,是丝氨酸蛋白酶家族一员,因此与其他丝氨酸家族蛋白酶具有30%~40%的同源性,最适pH值接近中性。
研究高效蛋白质表达的技术和方法
研究高效蛋白质表达的技术和方法蛋白质是生物体内功能最为重要的分子之一,控制着细胞的生理过程。
研究蛋白质表达的技术和方法,对于深入了解蛋白质功能以及相关疾病治疗具有重要意义。
本文将介绍几种高效蛋白质表达的常用技术和方法。
一、刺激蛋白质表达的条件在进行蛋白质表达之前,首先需要确定适当的表达条件。
刺激蛋白质表达最常用的方法之一是通过诱导表达来增加蛋白质的合成量。
常用的诱导剂包括 IPTG、甘油和丙酮酸等。
此外,还可以根据表达蛋白的特性来选择合适的表达宿主和培养条件。
二、重组蛋白质表达系统重组蛋白质表达系统是一种常见的高效表达蛋白质的方法。
目前广泛应用的系统包括大肠杆菌表达系统、昆虫细胞表达系统和哺乳动物细胞表达系统。
1. 大肠杆菌表达系统大肠杆菌表达系统是最常用的蛋白质表达系统之一。
其优点在于操作简便、蛋白质产量高、成本低等。
大肠杆菌表达系统可以利用原核细胞内丰富的蛋白质合成机器进行表达,常见的载体系统包括pET、pGEX等。
2. 昆虫细胞表达系统昆虫细胞表达系统利用昆虫细胞进行外源蛋白质的表达。
此系统适合表达复杂、大型蛋白质,且具有较高的蛋白质折叠和翻译后修饰能力。
常用的昆虫细胞包括sf9和S2等。
3. 哺乳动物细胞表达系统哺乳动物细胞表达系统是表达重组蛋白质的黄金标准。
相比于其他表达系统,哺乳动物细胞能够正确地翻译和修饰蛋白质。
常见的哺乳动物细胞包括CHO、HEK293等。
三、蛋白质表达的改进方法除了选择适当的表达系统外,还可以通过一些改进方法来提高蛋白质表达的效率和产量。
1. 信号肽优化信号肽是控制蛋白质合成和定位的重要序列。
通过对信号肽序列的优化,可以提高目标蛋白质的合成量和稳定性。
2. 确定适当的宿主菌株不同的大肠杆菌宿主菌株对蛋白质表达效果有差异。
在进行蛋白质表达之前,选择合适的宿主菌株能够提高表达效率。
3. 调节表达体系中其他环境因素除了上述方法外,还可以通过调节表达体系中其他环境因素,如温度、基因拷贝数、培养基组成等来提高蛋白质表达效率和产量。
重组蛋白质的表达与纯化技术
重组蛋白质的表达与纯化技术蛋白质是生命体活动的重要组成部分,对于生命体的生长、繁殖和免疫功能起着至关重要的作用。
而重组蛋白质则是利用基因工程技术,将人工合成的外源基因导入到特定的宿主细胞中,通过细胞表达和纯化技术得到的转录翻译产物。
这种技术不仅可以生产天然蛋白质,还可以生产人工合成的新型蛋白质,对于疾病的治疗和新药的研发有着重要的意义。
一、蛋白质表达技术蛋白质表达是获得大量重组蛋白质的重要方法。
选择适当的宿主细胞和表达载体是获得高水平表达的关键。
常用的宿主细胞包括大肠杆菌、酵母菌、昆虫细胞、哺乳动物细胞等。
1.大肠杆菌表达系统大肠杆菌表达系统具有生长快、表达量高等优点,广泛应用于重组蛋白质的表达和纯化。
其表达载体主要有pET和pBAD两种,pET系统一般用于产生可以形成包涵体的重组蛋白,pBAD系统用于在分泌表达中产生滞留蛋白。
2.昆虫细胞表达系统昆虫细胞表达系统包括SF9、Sf21、HighFive等细胞系,常用的表达载体为pIB/V5-His、pFastBac等。
昆虫细胞表达系统通常用于表达大分子蛋白质,如糖蛋白、膜蛋白等。
3.哺乳动物细胞表达系统哺乳动物细胞表达系统是目前表达规模最大、表达产物最接近人体蛋白质的一种表达系统。
其表达载体主要有pCDNA3.1、pCI 等,常用于表达与人体有关的蛋白质,如抗体、生长因子等。
二、蛋白质纯化技术蛋白纯化是重组蛋白质生产的重要环节,其目的是得到高质量的、纯度较高的蛋白质样品。
常见的纯化方法包括亲和层析法、离子交换层析法、凝胶过滤层析法、逆流式层析法等。
1.亲和层析法亲和层析法是指因与载体中固定的亲和剂相互结合而纯化目标蛋白质的一种方法。
亲和剂通常是与目标蛋白质有特异性结合作用的化合物,如亲和标签、酶底物、抗体等。
常见的亲和层析方法有亲和柱层析、亲和膜层析等。
2.离子交换层析法离子交换层析法是根据蛋白质带有正或负电荷的差异性进行分离的一种方法。
离子交换层析的柱填充物常为离子交换树脂,其一般分为阴离子交换树脂和阳离子交换树脂两种。
大肠杆菌在外源性蛋白表达中的研究进展
大肠杆菌在外源性蛋白表达中的研究进展随着生物技术的不断发展和进步,外源性蛋白表达在医药、工业和生物制品等领域中扮演着越来越重要的角色。
然而,对于外源性蛋白表达的技术瓶颈和提高表达效率的研究,已成为了当前生物技术的热点领域之一。
而大肠杆菌作为一种广泛应用于分子生物学领域的微生物,也成为了外源性蛋白表达的研究热点之一。
本文将就大肠杆菌在外源性蛋白表达中的研究进展展开论述。
第一部分:大肠杆菌在外源性蛋白表达中的特点外源性蛋白表达主要分为原核和真核系统两类。
而大肠杆菌则被广泛应用于原核系统中。
大肠杆菌在外源性蛋白表达方面的突出特点是其具有较高的表达效率和易于操作。
其表达的蛋白质具有良好的纯度和活性。
而在表达的技术方面,大肠杆菌可以利用各种载体进行转化。
同时,其遗传背景较为简单,为碱基序列仅为4.6MB的圆形染色体。
这一特点促使大肠杆菌成为了外源性蛋白表达的优选菌株。
第二部分:大肠杆菌在外源性蛋白表达中的常用载体常用载体主要包括pUC、pET和pBAD等。
其中pUC是一种常用的负责编码外源性蛋白质的表达载体,具有高效、快速、经济等特点。
同时,pUC载体可用于亚克隆、磷酸化和DNA序列分析等相关实验。
而外源性蛋白表达的pET系列载体采用T7启动子进行表达,可以具有高效率的表达效果,还可以对靶向蛋白进行不同形式的标记,以便于在纯化时分别使用。
此外,pBAD载体也是一种经典且有效的大肠杆菌表达载体,该载体可以通过调节l-arabinose的浓度来调节目标基因的表达量。
在新型载体的研发中,通过人工合成的方法合成的RNA表达系统在蛋白表达方面也可以取得显著的进展。
第三部分:大肠杆菌在外源性蛋白表达中的最新技术1. 合成生物学的应用:近年来合成生物学在外源性蛋白表达中的应用越来越受到重视。
这项技术通过重新设计和合成生物学的元件,再结合基因表达网络及传递过程等,从而改变微生物代谢的路线,进而提高微生物的表达效率及生产能力。
人胰岛素在大肠杆菌表达基本流程
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大肠杆菌分泌表达
大肠杆菌分泌表达
大肠杆菌分泌表达是指将外源蛋白质分泌到细胞外的一种技术。
在这种技术中,目标蛋白质被克隆到大肠杆菌的表达载体中,并在大肠杆菌中进行表达。
表达蛋白质通过信号肽靶向到分泌途径,在经过膜转运后被分泌到细胞外。
大肠杆菌分泌表达技术通常采用信号肽和融合蛋白的策略。
信号肽通常是由靶向蛋白质本身所携带的,可以将其加入到表达载体的N端,使其与表达蛋白一同进行转录和翻译。
融合蛋白则是将表达蛋白与信号肽以及其他蛋白质进行融合,以此提高表达蛋白的稳定性和可溶性。
大肠杆菌分泌表达技术具有高效、易于操作、成本低等优点。
但是,由于大肠杆菌的分泌途径比较复杂,分泌表达的蛋白质也容易被降解和失去生物活性。
因此,在进行大肠杆菌分泌表达时,需要针对不同的表达蛋白和分泌途径进行优化,以提高表达效率和蛋白质稳定性。
清华大学生物学考研历年真题及参考资料
清华大学生物学考研历年真题及参考资料普生03年一.名词解释(每个4分)1、朊粒2、端粒3、钠钾泵4、操纵子5、内稳态6、生态演替7、孤雌生殖8、共质体途径二.填空(每空1分)1、自然界最小的细胞是【支原体】2、细胞膜的脂类成分包括磷脂、糖脂和【胆固醇】3、神经元胞体中粗面内质网和游离核糖体组成的结构称为【尼氏体】4、细胞呼吸产生的二氧化碳和消耗的氧气的分子比称为【呼吸商】5、植物叶中光合作用的产物运输途径是【(韧皮部)筛管】6、植物细胞停止生长后所形成的细胞壁称为【次生细胞壁】7、植物对光照和黑暗时间长短的反应称为【光周期现象】8、C3途径中固定二氧化碳的受体是【RuBP,即核酮糖-1,5-二磷酸】9、骨骼肌纤维两条Z线之间的一段肌原纤维称为【肌小节/肌节】10、与调节血钙有关的一对拮抗激素分别是降钙素和【甲状旁腺素】11、响尾蛇探测温血动物所处方位的感受器是【红外探测器】12、鸟类体温调节中枢位于中枢神经系统的【下丘脑】13、胚珠中的大孢子母细胞来自【孢原细胞】14、哺乳动物相当于囊胚阶段的胚胎称为【胚泡】15、在生物数量性状表达上,每个基因只有较小的一部分表型效应,这类基因称为【微效基因】16、cDNA的中文表述是【互补DNA】(c:complementary)17、Mullis等科学家发明的PCR其中文表述是【聚合酶链式反应】18、限制性内切酶不能切开细菌本身DNA,是因为细菌DNA.的腺嘌呤和胞嘧啶【甲基化】19、细菌内形成的孢子称为【芽孢/内生孢子】20、生物种群在群落中的生活方式和在时间与空间上占有的地位称为【生态位】三.问答1、比较真核细胞和原核细胞的区别。
【这题能写满一张纸,主要从细胞结构、遗传结构及装置、基因表达这三方面回答,第三项属分子生物学范畴】2、简述两栖动物的循环系统。
【2房1室,心室无分隔,不完全双循环,每循环一次经过两次心脏】3、说明植物在登陆之前需要具备的条件。
【(1)维管组织(起支持和输导作用);(2)表皮有蜡质和角质层保水,有气孔帮助呼吸;(3)出现孢子生殖,生殖完全摆脱了对水的依赖(后发展为种子生殖)。
外源基因在大肠杆菌中高效表达的原理
Ptrp 除去色氨酸
Ptrp
Ptrp
Otrp 或加3-吲哚丙烯酸 (IAA) 高效转录
Otrp 高效转录
Otrp
启动子的可控性
启动子
l噬菌体启动子PlL的可控性:
噬菌体启动子PL受CI阻遏蛋白阻 遏,很难直接诱导控制。在基因
Ptrp
工程中常使用温度敏感型的cI突
变基因cI857控制PL。 cI857阻遏蛋 在42℃时失活脱落,PL便可介导 目的基因的表达。但在大型细菌
目前广泛用于外源基因表达的大肠杆菌表达型质粒上,均含有 与启动子来源相同的核糖体结合位点序列,序列和间隔是最佳的
密码子
生物体对密码子的偏爱性
不同的生物,甚至同种生物不同的蛋白质编码基因,对简并密码 子使用频率并不相同,具有一定的偏爱性,其决定因素是:
生物基因组中的碱基含量 在富含AT的生物(如单链DNA噬菌体 fX174)基因组中,密码子第三位上的U和A出现的频率较高;而在GC 丰富的生物(如链霉菌)基因组中,第三位上含有G或C的简并密码子 占90%以上的绝对优势
子量又较大的外源基因而言,则选择相关tRNA编码基因同步克隆表达 的策略较为有利。例如,在人尿激酶原cDNA的412个密码子中,共含 有22个精氨酸密码子,其中7个AGG、2个AGA,而大肠杆菌受体细胞 中tRNAAGG和tRNAAGA的丰度较低。为了提高人尿激酶原cDNA在大肠 杆菌中的高效表达,将大肠杆菌的这两个tRNA编码基因克隆在另一个 高表达的质粒上。由此构建的大肠杆菌双质粒系统有效地解除了受体 细胞对外源基因高效表达的制约作用
ori
筛选Apr、Tcs的转化子
核糖体结合位点
外源基因在大肠杆菌细胞中的高效表达不仅取决于转录启动的 频率,而且在很大程度上还与mRNA的翻译起始效率密切相关。大 肠杆菌细胞中结构不同的mRNA分子具有不同的翻译效率,它们之 间的差别有时可高达数百倍。mRNA翻译的起始效率主要由其5‘ 端的结构序列所决定,称为核糖体结合位点(RBS)
外源蛋白在大肠杆菌中的表达
外源蛋白在大肠杆菌中的表达一、引言外源蛋白是指不属于宿主生物体自身的蛋白质,通常是由其他生物体合成的蛋白质。
在大肠杆菌中表达外源蛋白已经成为了基因工程和生物技术领域中的一个重要研究方向。
本文将从大肠杆菌表达外源蛋白的原理、方法、策略等方面进行详细阐述。
二、原理1. 大肠杆菌表达系统原理大肠杆菌表达系统是指利用大肠杆菌作为宿主细胞,通过转化外源DNA进入细胞,使其在细胞内得到表达并产生相应的蛋白质。
这个系统包括三个部分:载体、宿主细胞和诱导剂。
2. 质粒载体质粒载体是指一种环状DNA分子,可以携带外源DNA序列并在大肠杆菌中进行复制和表达。
常用的载体有pUC19、pET28a等。
3. 宿主细胞宿主细胞是指被转化了质粒载体的大肠杆菌细胞。
常用的宿主细胞有BL21(DE3)等。
4. 诱导剂诱导剂是指在宿主细胞中引发表达外源蛋白的物质。
常用的诱导剂有IPTG、L-arabinose等。
三、方法1. 克隆外源DNA序列到质粒载体中将外源DNA序列克隆到质粒载体中,形成表达载体。
常用的方法有限制性酶切和连接法、PCR扩增法等。
2. 将表达载体转化到宿主细胞中将表达载体通过热激转化或电转化等方法导入到宿主细胞中,使其在细胞内进行复制和表达。
3. 选择正常表达的克隆通过筛选,选择出正常表达目标蛋白的克隆。
常用的筛选方法有PCR 检测、Western blotting等。
4. 诱导表达目标蛋白在选定的克隆中加入适量的诱导剂,使其开始表达目标蛋白。
通常在温度、时间、浓度等方面进行调节,以得到最佳效果。
四、策略1. 选择合适的载体和宿主细胞根据需要表达的外源蛋白的不同,选择适合的载体和宿主细胞。
例如,如果需要表达带有His标签的蛋白质,可以选择pET28a载体和BL21(DE3)宿主细胞。
2. 优化表达条件通过调节温度、时间、浓度等参数来优化表达条件,以提高目标蛋白的表达量和纯度。
3. 联合表达将多个外源蛋白基因克隆到同一个载体中,使其在同一宿主细胞中进行联合表达。
临床执业医师易错题(2)(100题)
西医临床执业医师易错100题1、初产妇,26岁,宫口开全1小时40分钟,先露+1,枕右后位,宫缩由强转弱50分钟,宫缩间隔由2分钟延长6-8分钟,本例最有可能的原因是A.骨盆出口狭窄B.骨盆入口狭窄C.产妇乏力,肠胀气D.原发性子宫收缩乏力E.中骨盆狭窄【答案】E2、动脉粥样硬化最好发生的部位是__A.主动脉B.冠状动脉C.肾动脉D.脑动脉E.四肢动脉【答案】A3、烧、烫伤的水泡A.以血浆渗出为主的炎症B.以纤维蛋白渗出为主的炎症C.以疏松组织内广泛中性粒细胞的浸润为主的炎症D.以局限性化脓为主的炎症E.以中性粒细胞浸润为主的炎症【答案】A4、结核引起机体的免疫是A.局部免疫B.传染免疫C.体液免疫D.抗毒素免疫E.抗菌免疫【答案】B5、关于慢粒白血病急性变下列哪项不符__A.外周血嗜碱粒细胞大于20%B.外周血出现有核红细胞C.骨髓中原始细胞大于20%D.除Ph染色体外,出现其他染色体异常E.原因不明的血小板进行性减少或增高【答案】B6、下列哪项不是中颅底骨折的表现()。
A.CT示脑室受压.中线结构移位B.脑脊液鼻漏C.脑脊液耳漏D.视神经损伤E.面.听神经损伤【答案】A7、接生过程中错误的处理是A.宫缩时,协助胎头俯屈B.协助胎头俯屈,是变枕下前囟径为枕额径C.应让胎头在宫缩间歇期娩出D.胎肩娩出后,仍应注意保护会阴E.宫缩时,接生者以手掌大鱼际肌向上内方托压会阴体【答案】B8、男婴,5天,出生时正常,不吃、不哭、体温不升1天,嗜睡,查体:反应差,皮肤轻度黄疸并有花纹,呼吸急促。
该婴的可能诊断是()。
A.新生儿黄疸B.新生儿溶血病C.新生儿败血症D.新生儿窒息E.新生儿缺氧缺血性脑病【答案】C9、哪种细菌尿路感染有利于磷酸盐结石形成A.大肠杆菌B.变形杆菌C.产气杆菌D.绿脓杆菌E.金黄色葡萄球菌【答案】B10、男性,34岁,劳累后气急1年,近2月来乏力、纳差伴腹胀就诊。
体检:颈静脉充盈显著,心界轻度增大,心率100次/分,律齐,可闻及舒张早期额外心音。
人组织激肽释放酶基因家族与胃肠道肿瘤检测
通 过 E IA LS s和逆 转 录 P R的 方 ( S ) 分 析 发 现 K K C ET L 6和 K K1 胰 L 0在
要 成分 , 是一 种丝氨 酸蛋 白酶 , 能够使 法研究发 现 。 人组织激肽 释放酶在许 多 腺 癌 中高表 达 , L 6 K K K K 、 L 8和 K KI L O 在 结 肠 癌 呈 平 行 表 达 增 强 _] l。 8 激 肽原释 放 出激 肽 ,它具 有很 高的 生 组织 中均有表达 . 主要在前 列腺 、 乳腺 、 理 学活性 .在人 体组 织 中起 着 十分重 卵巢 以及 睾丸等 产生 类 固醇激 素 的组 KK L 6主要 存 在 中枢 神经 系 统 和
最 要 的生理 作用 。激肽 释放 酶分 为组织 织或类 固醇激素依赖性 的组织 中表达 。 乳 腺 组 织 中 ,主 要 起 肿 瘤 抑 制 作 用 , 人组织激肽释放 酶广泛存在 于肽 释放 酶 同时 . T
细胞周期 和肿瘤 的侵袭能力 明显 降 作用 , 通过蛋 白之间相互作用 或桥接分 力 、 低 这些研究提示 , L 6可能作为 胃肠 KK 道肿瘤的肿瘤 标志物 。 e ka s 2 H n h u 等[] 1 研
K K 基因家族成员 与恶性肿瘤发 究发现 . L 6在结肠癌 中有异常表达 , Ls KK A .( 的 连 的 、 不 干 扰 、 与 其 他 基 因 无 关 的 生 、发展 的机制 目前 尚未完全 阐明 I, 并 且 在 下 调 了 C V 1 小 窝 蛋 白 ) 细 互 且 s ] 激肽释放酶基 因家族组 成 , 人类染色 大量 的研究 [1表明 . 是 93 -] 其家 族成员 主要 胞 中, L 6的表 达和分泌均减少 , 表 KK 这 体 中具有高度保守序列 的 、 编码 丝氨酸 在前 列腺癌 、 卵巢癌 、 腺癌 和睾 丸癌 明 C V 1 响 K K 乳 A 一影 L 6基 因的表 达 , 为进 步揭 示 K K L 6过 度 表 达 的 机 制 和 通 蛋 白酶 的最大 的基因家族 。K K 基 因 等 内分泌相 关肿 瘤 中异 常 ( Ls 过高 或过
大肠杆菌中多种热休克蛋白的表达与功能
大肠杆菌中多种热休克蛋白的表达与功能大肠杆菌作为一种广泛存在于大自然中的微生物,在人类和动物的肠道中常见,并在食品和水中也可以存在。
大肠杆菌以其快速生长和易于获取的特点,成为了许多研究的模型生物。
在适应外界环境及应对各种压力的过程中,大肠杆菌尤其需要各类热休克蛋白的协助。
通过对大肠杆菌中热休克蛋白的表达及其功能的深入研究,可以为细菌学和生物技术学的发展提供一定的启示。
一、热休克蛋白的分类热休克蛋白是一类具有特殊结构和共同生物学功能的蛋白质家族,可以在高温、低温、酸、碱、氧化、重金属离子和非生物物质等压力下进行快速的表达。
热休克蛋白在细胞分裂、DNA合成、氨基酸合成和脂肪酸合成等生命活动中扮演着重要的角色。
根据分子质量和功能多样性,热休克蛋白可以分为18个家族,其中Hsp60、Hsp70、Hsp90和Hsp100为最为广泛研究的四个家族。
这些热休克蛋白既可以自发地表达,也可以在细胞应对各种外部压力时被诱导表达,并通过形成复合物参与许多细胞内运作的过程。
二、大肠杆菌中的Hsp60热休克蛋白家族Hsp60家族蛋白也称为chaperonin蛋白,主要起着折叠、装配、沟通和转运蛋白等作用。
在大肠杆菌细胞内,GroEL,GroES和TFB为三个最为常见的Hsp60家族成员。
GroEL/GroES复合物是其中的主要组成成员,由14个GroEL亚基和7个GroES亚基组成,可以协助未完全折叠的蛋白在GroEL亚基的孔道内正确折叠和成熟。
TFB作为GroEL的结构同源物,也可以通过与GroES的结合作为辅助蛋白为不同蛋白质提供折叠环境。
研究表明,GroEL/GroES复合物在参与细胞调节和应对环境压力、抗耐受性等方面具有重要的作用。
在低温、高温、酸、堆积和毒素等不同压力下,大肠杆菌中通过热休克蛋白家族的诱导表达来抵御外界压力,从而维持细胞的正常生理功能。
三、大肠杆菌中的Hsp70热休克蛋白家族Hsp70家族蛋白是典型的分子伴侣和分子微环境调节蛋白。
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ISSN 1007 7626CN 11 3870 Q中国生物化学与分子生物学报Chinese Journal of Biochemistry and Molecular Biology2003年6月19(3):312~316人组织激肽释放酶成熟蛋白在大肠杆菌中的高效表达李体远, 杜 珙*, 蔡筱彦, 石之磷, 黄瑞芳, 陈德珩, 戴 勇, 肖德明(暨南大学医学院第二附属医院,深圳市人民医院临床医学研究中心,深圳 518020)摘要 将编码人组织激肽释放酶成熟蛋白的基因片段扩增并分别克隆到原核表达载体pE T28(b)及分泌型表达载体pE T20(b)中,使其C 端融合6 His Tag 序列.转化不同受体菌,IPTG 诱导表达后利用SDS PAGE 、免疫印记等方法对重组蛋白进行分析.在6株基因工程菌株中,均表达出分子量约30kD 的激肽释放酶融合蛋白,其中激肽释放酶在pET28载体中的表达水平高于pET20载体.pE T28和pE T20载体表达的重组激肽释放酶蛋白分别占菌体总蛋白约26%和10%.Western 印迹分析表明,目的蛋白可与抗人血清KK 单克隆抗体发生特异性反应.未经纯化的激肽释放酶融合蛋白具有一定的水解苯甲酰精胺酸乙酯(B AEE)的能力.在大肠杆菌中获得了人组织激肽释放酶的高效表达,表达产物具有免疫原性和生物活力,这为研究其生物功能和开发基因工程药物奠定基础.关键词 人组织激肽释放酶,大肠杆菌,高效表达中图分类号 Q78Overexpression of Mature Human Tissue KallikreinFusion Protein in E .coliLI Ti yuan,DU Gong *,C AI Xiao yan,SHI Zhi lin,HUANG Rui fang,C HE N De heng,DAI Yong,XI AO De ming(Me dical Researc h Cente r ,Shenzhe n People s Hospital ,Medic al Colle ge ,Jinan U nive rsity ,Shenzhe n 518020,China )Abstract Human tissue kallikrein gene fragment encoding mature kallikrein was amplified and cloned into pE T 28(b)and pET 20(b)plasmid with C terminal 6 His Tag.The recombinant fusion protein was overe xpressed in B L21(DE3),B L21(DE3)plysS and HMS174(DE3)under the induction of IPTG.SDS PAGE showed tha t the kallikrein fusion protein were produced at a level of approximately 26%and 10%of the total cellular protein in E .coli BL21(DE3)plysS by pET 28(b)and pET 20(b),respectively.The relative molecular weight of the expressed protein was 30kD.Western blot analysis indicated that the expressed kallikrein had the antigenicity to human serum kallikrein.The kallikrein fusion protein in the un purified solution sho wed low activity to hydrolysis B AEE by using potentiometric method.The overe xpressed human tissue mature kallikrein could be used for the development of gene tic engineering products and further study of its biological property.Key words kallikrein,overexpression,E .coli 收稿日期:2002 05 28,接受日期:2002 10 28基金项目:深圳市科技局资助课题(No.199906014),广东省十五攻关课题(No.C11801)李体远,男,1964年1月生,博士,副研究员,现在美国Ohi o 州立大学做博士后研究工作*联系人:Tel:0755 ******** 2599,Fa x:0755 ********E mail:tiyuanl@Supported by Shenzhen Bureau of Science and Technology (No.199906014)and the 10th Fi ve Year Plan Special Research Programs of Guangdong Province (No.C11801)Recei ved:May 28,2002;Accepted:October 28,2002*Corres pondi ng author Tel:0755 ******** 2599,Fax:0755 ********E mail:tiyuanl@高血压为最常见的心血管疾病,同发达国家一样,我国的发病率呈逐年升高趋势.据全国统计资料显示,我国现有高血压患者已达一亿,每年新增300万以上.肾脏等疾患同样威胁着广大人民的健康.研制开发新的抗高血压、改善肾脏功能等药物具有广阔的经济价值及深远的社会效益.激肽释放酶(kallikrein,KK)具有广泛的药用价值,除降血压之外,还可以用于治疗糖尿病肾病、改善肾脏功能,治疗心、脑血管疾病等[1~5].猪源激肽释放酶生化药物已经上市,并在治疗糖尿病肾病等疾病中取得肯定疗效.由于种属差异,人源激肽释放酶在蛋白结构、生物活性、免疫反应以及治疗效果等方面都必将优于猪胰激肽释放酶.我们利用pE T表达系统,在大肠杆菌中高效表达了人组织成熟激肽释放酶融合蛋白,表达产物纯化后不仅可以用于抗体制备,也为进一步大规模生产人源激肽释放酶基因工程药物奠定基础.1 材料与方法1 1 质粒、菌珠质粒pE T28b载体,含T7噬菌体启动子,N端携带His亲和Tag、凝血酶基因、T7Tag以及可选择的C 端His亲和Tag;质粒pET20b载体,含T7噬菌体启动子,N端携带向细胞质分泌定位外源蛋白的信号序列以及可选择的C端His亲和Tag.E.coli B L21和BL21(DE3)、BL21(DE3)plysS、HMS174(DE3)为pE T系统高效表达对照和宿主菌,均为金宁一博士(解放军军需大学研究所,病毒病研究室)惠赠,本室保存.质粒pBluescript!KS(+),大肠杆菌XL1 Blue 分别购于STRATAGE NE(晶美公司).质粒KSKK含人组织激肽释放酶完整基因,由作者克隆和构建.法国VL凝胶分析系统.1 2 工具酶及生化试剂限制性内切酶、大肠杆菌DNA聚合酶∀大片段(Klenow)、T4DNA连接酶、牛小肠碱性磷酸酶(CIP)、RNA酶、DNA酶∀、溶菌酶、高保真pfu Taq 酶、DNA胶回收试剂盒和相关化学试剂等为QIAGE N、Ne w England Biolabs、MBI、Stragene、Inivitrogen产品,分别购自深圳晶美公司、广州gene 公司、上海生物工程公司等.抗人血清激肽释放酶抗体、猪胰腺激肽释放酶标准品购自Sigma公司.1 3 PCR引物设计及合成根据KK氨基酸序列中的蛋白酶切割位点,利用计算机辅助系统(Primer5.0)设计PCR引物,由上海生工公司合成并经聚丙烯凝胶电泳纯化.1 4 重组表达质粒的构建参照#分子克隆∃的方法进行.首先利用高保真pfu Taq酶扩增成熟激肽释放酶基因片段,PCR产物酶切处理后,低熔点琼脂糖或者柱回收成熟KK基因片段.回收产物和经过酶切的载体片段用T4DNA 连接酶连接,将连接产物转化E.coli XL1 blue,提取质粒后筛选克隆、酶切鉴定.1 5 表达载体测序分析将筛选出的重组质粒由上海生物工程公司用Sanger双脱氧法测序分析.1 6 激肽释放酶融合蛋白的表达参照Nova gen公司的操作指南进行.重组质粒分别转化对照菌株E.coli B L21,表达宿主菌B L21(DE3)、B L21(DE3)plysS和HMS174(DE3)感受态细胞,次日挑取单菌落于37%振摇培养过夜后,更换新鲜培养基再培养至A600=0 6~1 0,加IPTG诱导表达.1 7 表达菌体的裂解及包涵体的提取表达菌体,加溶菌酶及Triton X 100,振荡混匀;置冰浴中超声波处理或加DNase∀室温放置至不再粘稠;4%12000r min离心15min,重悬溶菌沉淀,分别取适量溶菌悬液及其溶菌上清进行SDS PAGE.1 8 KK蛋白表达量测定参照#分子克隆∃的方法取溶菌悬液进行SDS PAGE.经考马斯亮蓝R250染色,脱色后,用凝胶图象分析仪分析,计算蛋白的相对含量.1 9 表达产物的SDS PAGE及蛋白印迹(Western blot)分析参照#分子克隆∃的方法进行.蛋白电泳后利用半干转膜系统转膜(20V,20min),牛血清白蛋白封闭过夜.次日用TB ST洗膜后分别与抗人血清激肽释放酶单克隆抗体、碱性磷酸酶标记的二抗作用后显色.1 10 KK活性分析[6]使用高渗、低渗冲击法处理诱导后菌体,采用国际药学联合会(FIP)推荐、中国药品生物制品检定所改进的电位滴定法[6]检测重组人胰激肽释放酶活力.2 结果2 1 重组表达质粒的构建重组表达质粒的构建见Fig. 1.2 2 重组表达质粒的酶切鉴定分别使用Pvu!和Eco R∀、Xho∀进行酶切鉴定,质粒p28b含有3个酶切位点,应产生片段93 bp、999bp、4277bp;质粒p28bmk含有4个酶切位点,应产生片段93bp、999bp、1671bp、3309bp;结果切出片段大小正确(Fig.2A.).质粒p20bmk含有Pvu!2个酶切位点,应产生片断978bp,3441bp; Eco R∀、Xho∀酶切应产生737bp,3682bp的片段.如Fig.2B.2 3 重组表达质粒的测序分析测序结果表明,重组质粒中插入基因片段为成熟激肽释放酶基因片段.313第3期李体远等:人组织激肽释放酶成熟蛋白在大肠杆菌中的高效表达Fig.1 Constructi on of the reco mbinant pl as mid p28bmKp20bmKFig.2 Restric tion analysis of reco mbinant plas mids(A) 1:p28bmK di ges ted with Pvu !;2:p28b diges ted w i th Pvu !;3:100bp marker (B) 1:PCR product;2:100bp marker;3:p20bmk digested with Pv u !;4:plasmid p2Obmk;5:p20bmk di gested with Eco R ∀+Xho ∀2 4 SDS PAGE 分析I PTG 诱导表达后,将不同菌株的菌体分别进行SDS PAGE 分析.与对照菌体相比较,重组质粒在3种表达受体菌中均高效表达了一个分子量约30kD 的蛋白质,与预计的成熟KK 融合蛋白分子量相符,推测为成熟KK 基因表达产物.其中转化pE T28b 载体的受体菌表达量较高,表达的蛋白主要存在于包涵体中.分泌型载体pET20b 表达的目的蛋白可以分泌到细胞浆中,但表达量低于pET28b(Fig.3,Fig.4).2 5 KK 融合蛋白表达量测定凝胶图象分析结果表明,KK 在受体菌B L 21314中国生物化学与分子生物学报19卷Fig.3 SDS PAGE of the expressed produc ts of p20bk in E .coil 1:Protei n marker;2:BL21(DE3)plysS induced with IPTG;3:hms174(DE3)induced with IPTG,4:BL21(DE3)induced wi th IPTG;5:BL21induced withIPTGFig.4 SDS PAGE of the expres sed products of p28bK in E .coli 1:Protei n marker;2,3:BL21(DE3)plys S i nduced with IP TG and not induced with IP TG;4,5:hms174(DE3)i nduced with IP TG and not induced with IPTG;6,7:BL21(DE3)i nduced with IP TG and not i nduced with IP TG;8,9:BL21i nduced with IPTG and not induced with IPTG(DE3)plysS 中表达量最高,pET28b 、pE T20b 载体表达的KK 融合蛋白分别占菌体总蛋白26%和10%.2 6 表达蛋白的免疫印迹分析(Western blot)以抗人血清KK 单克隆抗体为一抗,碱性磷酸酶标记的兔抗人IgG 抗体为二抗进行免疫印记分析.结果表明,诱导表达的菌体蛋白在约30kD 处均呈现强的特异性显色反应.该结果同样表明,pET28b 载体转化的受体菌表达的目的蛋白含量较高(Fig.5,6).Fig.5 Wes tern blot analysis of the expressed products of p20bK i n E .coli1:BL21;2:BL21(DE3);3:BL21(DE3)plysS;4:HMS174(DE3)Fig.6 Wes tern blot analysis of the expressed products of p28bK i n E .coli1:HMS174(DE3);2:BL21(DE3)plysS;3:BL21(DE3);4:BL212 7 KK 活性的初步分析采用猪胰腺激肽释放酶为标准品,FI P 推荐的电位滴定法对表达产物进行了初步分析,结果表明,大肠杆菌表达的激肽释放酶同样具有水解苯甲酰精胺酸乙酯(BAEE)的能力.由于没有进行纯化,并且表达产物为激肽释放酶融合蛋白,产物活性较低(小于0.1I U ml).3 讨论人组织激肽释放酶由238个氨基酸组成.在生物体内,激肽释放酶多以酶原形式存在,与其抑制剂、激肽原等一起共同组成激肽系统.对猪胰激肽释放酶的分析证明,它是由232个氨基酸残基组成的糖蛋白.B ode 等人[4]研究其氨基酸序列与人的同源性为67 4%.人组织激肽释放酶(E C 3 4 21 35)为丝氨酸蛋白酶,可以裂解低分子量的激肽原生成具有血管活性的激肽,后者参与机体一系列的生理及315第3期李体远等:人组织激肽释放酶成熟蛋白在大肠杆菌中的高效表达病理过程.激肽释放酶和激肽系统(KKS)是维持血压平衡中降压系统的一个重要组成部分,它可以调节肾脏功能,扩张毛细血管,增加血管通透性,改善微循环.同时胰激肽释放酶又是一种活化因子,能使纤维酶原激活成纤维酶,使不容性的纤维蛋白酶水解成可溶性的小肽,从而对脑梗塞、动脉粥样硬化等疾病起到治疗作用,并可以治疗血栓、预防血栓再形成.胰激肽释放酶对糖尿病肾病、视网膜静脉阻塞、增加男性生殖等均有较好疗效.到目前为止,国内尚未见其他学者开展人组织激肽释放酶的高效表达研究工作.本实验构建的分泌型及非分泌型载体均高效表达了KK融合蛋白,其中pE T28载体的表达量高于pET20b.在使用的3种宿主细胞中,B L21(DE3)plysS是高效表达菌株,其表达量高于常规表达宿主BL21(DE3),与理论相符.作者曾利用pET 17(b)载体表达了HI V 1Gag及Env 蛋白,但其表达量均低于本实验.其表达量较低的原因,可能是由于(1)外源基因的起始密码子与载体的SD序列相距较大,(2)目的蛋白分子量较大(均大于50kD)所致.目的基因所含大肠杆菌稀有密码子较多则是另一可能原因.本实验中目的蛋白表达量较高,也可能受下述因素影响.第一,目的蛋白分子量大小适中,大约为30kD.许多学者认为[7],分子量处于10kD至35kD之间的表达产物可获较高的表达量,此点与本实验结果一致.第二,pE T 28(b)使用了T7lac启动子,即在T7启动子下游加入了lac操纵子序列,不存在IPTG时,该类载体能够更加严紧地调控T7RNA聚合酶的表达,使宿主免受外源蛋白的毒性的影响,但加入诱导物IPTG后,立即启动对目的蛋白的高效表达.本实验中,pE T 28(b)高效表达的KK融合蛋白主要以包涵体形式存在.SDS PAGE分析表明,目的蛋白相对含量高达26%.上清中目的蛋白的相对含量则较少(结果未显示).包涵体具有抗酸、碱,耐酶解等特点,有利于目的蛋白的稳定存在.利用包涵体密度相对较大的特点,通过离心可以对目的蛋白进行初步纯化.由于目前市场没有抗人组织激肽释放酶抗体,本实验免疫印记使用抗人血清激肽释放酶抗体为一抗,结果满意.对本实验表达的目的蛋白的生物活性进行了初步分析.结果表明,表达产物具有一定的水解苯甲酰精胺酸乙酯(B AEE)的能力.由于检测的产物尚没有进行纯化,并且表达产物为融合蛋白,且主要存在于包含体中,因此活力较低.KK为糖基化蛋白,大肠杆菌没有翻译后修饰功能,这也是其活性较低的原因之一.作者已经开始激肽释放酶的纯化和生物功能研究工作,详细结果另文报告.作者同时构建了激肽释放酶的真核表达载体,并且进入表达阶段.重组人组织激肽释放酶的成功克隆与表达,为进一步研究激肽释放酶的生物学功能奠定基础.激肽释放酶基因工程药物的研制成功必将带来巨大的社会效益和经济效益.参考文献(References)1 Phillips M I.Gene therapy for hypertension:the preclinical data.Hype rte nsion,2001,38:543~8482 Ponder K P.Systemic gene therapy for cardi ovascular disease.TrendsCardiovasc Med,1999,9(6):158~1623 Pachori A S,Huentelman M J,Francis S C,Gelband C H,Katovich MJ,Raizada M K.The future of hypertens ion therapy:sens e,antisense, or nonsense?Hype rte nsion,2001,37:357~3644 Wol f W C,Yos hida H,Agata J,Chao L,Chao J.Human tiss uekalli krein gene delivery attenuates hypertension,renal i njury, andcardi ac remodeling i n chronic renal failure.Kidne y Int,2000,58(2):730~7395 Dellalibera Joviliano R,Reis M L,Donadi E A.Kinin s ys te m i n lupusnephritis.Int Immunopharmacol,2001,1(9 10):1889~18966 杨化新,沈佳,刘金秀.电位滴定法测定胰激肽释放酶活力测试条件探讨.药物分析杂志(Yang Hua xin,Shen Jia,Liu Jin xiu.Study on experi mental condition of pancreatic kallikrei n activity measurement using potentiomtric method.Chin J Pharmace ut Anal), 1994,14(2):10~127 李体远,戴勇,杜珙,文锦丽.中国人胰腺组织激肽释放酶基因的克隆及测序.广东医学(Li Ti yuan,Dai Yong,Du Gong,Wen J in li.Molecular cloning and sequence analysis of the human pancreatic kalli krein gene.Guangdong Me d J),2001,22(4):291~292316中国生物化学与分子生物学报19卷。