人激肽释放酶1(KLK-1)说明书
2021激肽释放酶-激肽系统在组织器官病理中的细胞内作用范文1
2021激肽释放酶-激肽系统在组织器官病理中的细胞内作用范文 0引言 激肽释放酶-激肽系统（ kallikrein-kinin system,KKS）是生物体内重要的炎性调节系统，参与心血管、肾和中枢神经系统等各组织器官的炎症过程并与多种肿瘤的发生相关。
激肽释放酶分为血浆型激肽释放酶（ plasmakallikrein,PK）和组织型激肽释放酶（ tissue kallirein,TK） .PK 特异地在肝细胞表达，而 TK 广泛分布机体各组织中，是一大类的多基因家族。
已发现至少有 15种人组织激肽释放基因（ KLK1 ~ KLK15） ,其中 KLK1 编码的组织激肽释放酶 1 是产生激肽的主要物质。
活化的 TK 催化低分子量激肽原转化为激肽和缓激肽（ bradykinin,BK） ,后者作用于缓激肽 B1受体（ bradyldnin B1re-ceptor,B1R）和 B2R 发挥一系列生物效应，如内皮依赖性血管舒张、非血管平滑肌收缩、炎症反应及疼痛等。
在生理及病理状态下，B2R 激活能够减轻组织损伤，促进血管新生和靶器官功能恢复等。
在应激状况（如缺血缺氧、炎症及外伤等）下，B1R 激活能够促进早期炎性因子的释放，增强炎症反应，加重缺血后组织水肿进而加剧组织损伤。
此外，TK 还可直接激活缓激肽受体发挥作用，也可通过非缓激肽受体如蛋白激活酶受体发挥生物学效应[1].KKS通过多条细胞内通路参与机体的生理及病理过程。
研究显示，即使病理状态相似，不同组织器官KKS发挥作用的细胞内信号通路也不尽相同。
本文就KKS 在糖尿病肾病（ diabetic nephropathy,DN）、神经系统及心血管系统缺血/再灌注（ ischemia/reper-fusion,I / R）损伤、血管重构及动脉粥样硬化性狭窄等病理过程中的细胞内作用机制进行综述。
1KKS 与丝裂原活化蛋白激酶（ mitogen activatedprotein kinase,MAPK）通路 MAPK 是哺乳动物体内广泛存在的一类丝 / 苏氨酸蛋白激酶，可以被一系列细胞外信号或刺激所激活，如物理应激、炎性细胞因子、生长因子、细菌复合物等。
人KLK1和EGFP双顺反子重组腺病毒构建及其在血管平滑肌细胞中的表达
中 国病理生理杂志
Ｃ ｉ ｓ Ｊｕｎｌ ｆ ａ ｏｈｓ ｌ ｙ ０ ８ ２ （ ） ４ １— １ ｈｎ ｅ ｏｒａ ｏ ｔ ｐ ｙｉｏ ２０ ，４ ２ ：１ ４ ６ ｅ Ｐｈ ｏｇ
・
４１ ・ １
［ 文章 编号］ １０ ０ ０—４ １ （０ ８ ０ —０ １ 一ｏ ７ ８ ２０ ） ２ ４ １ ６
过双酶切质粒 ｐ ｌｅｃｉＩ Ｓ—ｈ Ｌ １ 将 ｈ Ｌ １ 因定 向克 隆至带有 ＩＥ ＢｕｓｒｌＫ ｔ ＫＫ ， ＫＫ 基 Ｒ Ｓ—Ｅ Ｆ Ｇ Ｐ的腺病 毒穿梭质粒 ｐ Ｃ １ Ｄ ３ ６中， 构建成重 组穿梭质 粒 ， 将其 与腺病 毒骨架 质粒 ｐ Ｈ ｌ Ｅ ，Ｃ ｅ 转染 ２ ３ Ｂ Ｇｏ １３ ｒ共 ｘ ９ Ａ细胞 ， 经包 装并获得重 组腺病毒 ， 用 Ｐ Ｒ、 Ｃ 酶切及 测序方法对其 进行 鉴定 ， 测定病 毒滴度 ； 用重 组腺病 毒感染 Ｖ ＭＣ ， Ｓ ｓ用荧 光显微镜 下观 察到 的绿色荧 光来测定感染率 ， Ｒ Ｐ Ｒ和 Ｗｅｔｒ ｌｔｎ 法测定 ｈ Ｌ 基 因在 Ｖ Ｍ ｓ 用 Ｔ— Ｃ ｓ ｎｂｏ ｉｇ ｅ ｔ Ｋ Ｋ１ Ｓ Ｃ 中的表达。结果 ： Ｃ 酶切 和测 序 Ｐ Ｒ、 表 明携 Ｅ Ｆ Ｇ Ｐ的重组穿梭 质粒 ｐ Ｃ １ ｈ Ｌ 一ＩＥ Ｄ ３６一 Ｋ Ｋ１ Ｒ Ｓ—Ｅ Ｆ Ｇ Ｐ构建正确 ， 并与骨架质粒在 ２ ３ ９ Ａ细胞 中成功包装 出 重组腺病毒 Ａ ｄ—ｈ Ｌ １ Ｒ Ｓ—Ｅ Ｆ ， Ｋ Ｋ 一ＩＥ Ｇ Ｐ 其滴 度为 ４ ５×１ “ 。重组 腺病毒 感染 Ｖ Ｍ ｓ ， 荧光显微 镜下观察 ． ０几 ＳＣ 后 在 到 明亮绿色荧光蛋 白表达 。 感染率高达 ９ ％ 以上 ， Ｏ 可检测到 ｈ Ｌ １基 因的 ｍＲ Ａ及蛋 白表达 。 ＫＫ Ｎ 并与 感染时 间（ １ｄ
人缓激肽(BK)酶联免疫吸附测定试剂盒说明书
人缓激肽（BK）酶联免疫吸附测定试剂盒使用说明书本试剂盒仅供体外研究使用、不用于临床诊断!预期应用ELISA法定量测定人血清、血浆或其它相关生物液体中缓激肽（BK）含量。
实验原理用纯化的BK抗体包被微孔板，制成固相载体，往微孔中依次加入标本或标准品、生物素化的BK抗体、HRP 标记的亲和素，经过彻底洗涤后用底物（TMB）显色。
TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。
颜色的深浅和样品中的BK呈正相关。
用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（值），计算样品浓度。
试剂盒组成及试剂配制1、酶标板：一块（96孔）2、标准品（冻干品）：2瓶，请临用前15分钟内配制。
每瓶以样品稀释液稀释至1ml，盖好后室温静置大约10分钟，同时反复颠倒/搓动以助溶解，其浓度为6,000pg/ml，然后做系列倍比稀释（注：不要直接在板中进行倍比稀释），分别配制成6,000pg/ml，3,000pg/ml，1,500pg/ml，750pg/ml，375pg/ml，188pg/ml，94 pg/ml，样品稀释液直接作为空白孔0pg/ml。
如配制3,000pg/ml标准品：取0.5ml（不要少于0.5ml）6,000 pg/ml的上述标准品加入含有0.5ml样品稀释液的Eppendorf管中，混匀即可，其余浓度以此类推。
3、样品稀释液：1×20ml。
4、检测稀释液A：1×10ml。
5、检测稀释液B：1×10ml。
6、检测溶液A：1×120/瓶（1:100）。
临用前以检测稀释液A1:100稀释（如：10检测溶液A/990检测稀释液A），充分混匀，稀释前根据预先计算好的每次实验所需的总量配制（100/孔），实际配制时应多配制0.1-0.2ml。
7、检测溶液B：1×120/瓶（1:100）。
临用前以检测稀释液B1:100稀释。
稀释方法同检测溶液A。
8、底物溶液：1×10ml/瓶。
激肽释放酶—激肽系统与脑缺血
Ｂ 受 体及激 肽组 成 。 激肽 原 是 一种 单 链 糖 蛋 白， 主要 由肝 细胞 及 少
量血管 内皮 细 胞 产 生 。根 据 转 录后 剪 切 方 式 差 异 ，
合物相结合 ， 释放缓激肽。活性激肽与受体结合后 激 活一 氧 化 氮 （Ｎ ｔｃｘ ｅ Ｎ ｉｉ ｉ ， Ｏ）一ｃ ＭＰ和 前 列 腺 ｒｏ ｄ Ｇ 素 （ ｐｏｔ ｌｎ ｉ， Ｇ）一ｃ ＭＰ途 径 ， 而 通过 调 节 Ｐ ｒｓ ｇ ｄｎ Ｐ ａａ Ａ 进 Ｎ Ｏ和 Ｐ 等生 物 活 性 物 质 的释 放 参 与 多种 器 官 功 Ｇ 能 的调控 和 多 种 病 理 生 理 学 过 程 ， 抑 制 凋 亡 、 如 炎 症 、 大 、 维 化 ， 进 心 、肾 和 脑 内 新 血 管 形 肥 纤 促
—
ｋ ｉ ｙｔ ｉｃ ） 泛 存在 于 动 物体 内 的多 个 系 的赖氨 酰缓 激 肽 ， 胰 激 肽 。缓 激 肽 和胰 激 肽 统 称 ｉｎｓｓ ｍ，ｉ 广 ｎ ｅ ￣ｓ 即
统 内 。近 年来 ， 多基 础实 验 和临床 研究表 明 ， 脑 为 激肽 。 许 在 目前认 为循 环 中前 激 肽 释 放 酶 与 Ｈ ＭＷＫ以 复 缺 血后 激 肽 释放 酶一 激 肽 系 统被 激 活 ， 性 激 肽 生 活
高血糖素样肽-1说明书
高血糖素样肽-1说明书
高血糖素样肽-1（GLP-1）是一种肽类激素，由肠道内分泌细胞产生，可以调节血糖水平和食欲。
作用机制：
GLP-1通过以下方式发挥作用：
1. 促进胰岛素分泌：GLP-1能够刺激胰岛β细胞释放胰岛素，从而降低血糖水平。
2. 抑制胰高血糖素分泌：GLP-1可以抑制胰高血糖素的分泌，胰高血糖素是一种能够提高血糖水平的激素。
3. 延缓胃排空：GLP-1可以延缓胃内容物的排空速度，从而使食物更慢地通过胃肠道，减缓血糖上升速度。
4. 抑制食欲：GLP-1能够通过作用于大脑的食欲中枢，降低食欲，减少食物摄入。
临床应用：
GLP-1类药物已经用于治疗2型糖尿病。
这些药物可以通过模拟GLP-1的作用来降低血糖水平，提高胰岛素的分泌，并减少食欲。
GLP-1类药物有以下几种剂型：注射剂、口服剂、腺病毒载体等，可以根据医生的建议选择合适的剂型。
注意事项：
GLP-1类药物的使用可能会引起一些副作用，如恶心、呕吐、腹泻等，但大多数患者能够耐受。
此外，由于GLP-1的降血糖作用，导致低血糖的风险增加，在使用这类药物时需要密切监测血糖水平。
总结：
高血糖素样肽-1是一种能够调节血糖水平和食欲的激素，通
过促进胰岛素分泌、抑制胰高血糖素分泌、延缓胃排空和抑制食欲来起作用。
GLP-1类药物已被用于2型糖尿病治疗，能有效控制血糖，但在使用过程中需要注意副作用和低血糖的风险。
注射用胰激肽原酶详细说明书与重点
注射用胰激肽原酶
【成分】本品主要成份为胰激肽原酶，辅料为乳糖、甘露醇。
【性状】本品为白色或类白色冻干块状物。
【适应症】血管扩张药。
有改善微循环作用。
主要用于微循环障碍性疾病，如糖尿病引起的肾病，周围神经病，视网膜病，眼底病及缺血性脑血管病，也可用于高血压病的辅助治疗。
【规格】10 单位、40 单位
【用法用量】临用前，加灭菌注射用水1.5 ml 溶解。
肌内注射，一日10～40 单位，一日1 次或隔日1 次。
【不良反应】偶有皮疹，皮肤瘙痒等过敏现象及胃部不适和倦怠等感觉，停药后消失。
【禁忌】脑出血及其他出血性疾病的急性期禁用。
对本品过敏患者禁止注射给药。
【注意事项】尚不明确。
【孕妇及哺乳期妇女用药】尚不明确。
【儿童用药】未进行该项实验且无可靠参考文献。
【老年用药】未进行该项实验且无可靠参考文献。
【药物相互作用】本品与蛋白酶抑制剂不能同时使用。
本品与血管紧张素转化酶抑制剂(ACEI)有协同作用。
【药物过量】未进行该项实验且无可靠参考文献。
【药理毒理】有扩张血管改善微循环作用。
【药代动力学】未进行该项实验且无可靠参考文献。
【贮藏】密闭，在阴凉（不超过20 ℃ ）干燥处保存。
精液液化延迟患者精浆KLK2、KLK3、KLK5的变化
精液液化延迟患者精浆KLK2、KLK3、KLK5的变化目的：研究精浆KLK2、KLK3、KLK5在精液液化过程中所起的作用与意义。
方法：选取液化延迟患者43例为液化延迟组，液化正常患者38例为对照组。
测定精浆KLK2、KLK3、KLK5水平，两组对比。
结果：液化延迟组精浆KLK2、KLK3明显低于对照组，P＜0.05。
KLK5略低于对照组，P=0.067。
结论：KLK2、KLK3、KLK5的浓度变化与精液液化时间具有密切相关性，在精液液化过程中起重要生理作用。
标签：精液液化；激肽释放酶；不育人激肽释放酶（Human kallikrein—related peptidases，KLKs）是一组丝氨酸蛋白酶。
精浆KLK2、KLK3、KLK5由前列腺分泌，具有蛋白水解作用，在精液液化过程中起重要作用。
本文通过对比精液液化延迟患者与正常患者精浆KLK2、KLK3、KLK5浓度的变化，来研究其在精液液化过程中所起的作用与意义。
1、对象与方法1.1 病例资料按WHO规定，新采集的精液标本在室温（25℃）60 min内发生液化，若超过60 min仍未液化，则称为精液液化延迟。
在2010年至2012年我院门诊行精液分析的患者中，选取液化延迟患者82例为病例组（液化延迟组），年龄25～37岁，平均（29±7）岁；选取液化正常者64例为对照组，年龄24～35岁，平均（28±5）岁。
1.2 方法禁欲3～5天，手淫取精，记录液化时间。
如精液1.5小时不液化，加入糜蛋白酶促液化。
精液液化后按试剂盒步骤，ELISA法检测精浆KI.JL2、KLK3、KLK5，试剂盒购白上海蓝基生物科技有限公司。
1.3 数据分析采用SPSS19.0统计软件，数据采用均数±标准差（X±s）表示，两均数比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。
2、结果两组精浆KLK2、KLK3、KLK5检测结果见表1。
组织激肽释放酶相关肽酶的作用和治疗潜力的研究进展
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生理科学进展 ２０１８年第 ４９卷第 ５期
ＫＬＫ７（又称为角质层胰凝乳蛋白酶，ｓｔｒａｔｕｍ ｃｏｒｎｅｕｍ ｃｈｙｍｏｔｒｙｐｔｉｃｅｎｚｙｍｅ，ＳＣＣＥ）最初是从角质层组织中 提取出来的。正常人体皮肤中的总丝氨酸蛋白酶活 性主要来源于 ＫＬＫ５、ＫＬＫ７、ＫＬＫ８和 ＫＬＫ１４［３］。这 些 ＫＬＫｓ通过角质细胞中的板层颗粒进行运输，并 分泌到角质层裂隙中。此后由 ＫＬＫ５启动角质层裂 隙中 ＫＬＫｓ的蛋白水解激活级联反应：自身激活的 ＫＬＫ５可 以 水 解 切 割 ＰｒｏＫＬＫ７、ｐｒｏＫＬＫ８和 ｐｒｏ ＫＬＫ１４蛋白 Ｎ末端精氨酸或酪氨酸残基之后的前 肽，从而使其成为成熟活化的 ＫＬＫｓ，活化的 ＫＬＫ１４ 又可激活 ＫＬＫ５，从而形成正反馈级联反应［４］。
在生理情况下，皮肤组织中 ＫＬＫｓ激活后主要 通过以下三方面的作用来维持正常皮肤的屏障功 能［４］：（１）通过促进皮肤脱屑和 ／或角质细胞增殖作 用调节皮肤 细 胞 更 新 和 屏 障 厚 度；（２）通 过 调 节 脂 质处理酶和 ／或激活角质细胞表达的蛋白酶活化受 体 ２（ｐｒｏｔｅａｓｅａｃｔｉｖａｔｅｄｒｅｃｅｐｔｏｒ２，ＰＡＲ２），调节富含 脂质的皮肤 屏 障 的 通 透 性；（３）通 过 处 理 抗 微 生 物 肽和细胞因子前体，诱导抗微生物和天然免疫应答 反应。
ＫＬＫｓ在皮肤脱屑过程中的关键作用已被学者 们所公认。每隔 ２～４周，在皮肤角质层最上部分的 角质细胞就会脱离（脱屑过程），以确保健康的皮肤 细胞更新。这个脱屑过程需要 ＫＬＫｓ利用其蛋白酶 活性降解连接角质细胞的黏附蛋白，包括桥粒芯蛋 白 １（ｄｅｓｍｏｇｌｅｉｎ１，ＤＳＧ１）、桥粒胶蛋白 １（ｄｅｓｍｏｃｏｌ ｌｉｎ１，ＤＳＣ１）和角膜锁链蛋白（ｃｏｒｎｅｏｄｅｓｍｏｓｉｎ，ＣＤ ＳＮ）［３］。除皮肤 相 关 的 蛋 白 酶 抑 制 剂 （如 ｌｙｍｐｈｏ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌＫａｚａｌｔｙｐｅｒｅｌａｔｅｄｉｎｈｉｂｉｔｏｒ，ＬＥＫＴＩ）外，几 种表 皮 因 子，如 转 录 因 子 ＳＰ１（ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙｐｒｏｔｅｉｎ １）［５］等均可调节内源性 ＫＬＫｓ的表达和活性。由此 可在生理水平维持 ＫＬＫｓ介导的脱屑反应并保持皮 肤屏障的完整性。
人组织激肽释放酶基因家族与胃肠道肿瘤检测
通 过 Ｅ ＩＡ ＬＳ ｓ和逆 转 录 Ｐ Ｒ的 方 （ Ｓ ） 分 析 发 现 Ｋ Ｋ Ｃ ＥＴ Ｌ ６和 Ｋ Ｋ１ 胰 Ｌ ０在
要 成分 ， 是一 种丝氨 酸蛋 白酶 ， 能够使 法研究发 现 。 人组织激肽 释放酶在许 多 腺 癌 中高表 达 ， Ｌ ６ Ｋ Ｋ Ｋ Ｋ 、 Ｌ ８和 Ｋ ＫＩ Ｌ Ｏ 在 结 肠 癌 呈 平 行 表 达 增 强 ＿］ ｌ。 ８ 激 肽原释 放 出激 肽 ，它具 有很 高的 生 组织 中均有表达 ． 主要在前 列腺 、 乳腺 、 理 学活性 ．在人 体组 织 中起 着 十分重 卵巢 以及 睾丸等 产生 类 固醇激 素 的组 ＫＫ Ｌ ６主要 存 在 中枢 神经 系 统 和
最 要 的生理 作用 。激肽 释放 酶分 为组织 织或类 固醇激素依赖性 的组织 中表达 。 乳 腺 组 织 中 ，主 要 起 肿 瘤 抑 制 作 用 ， 人组织激肽释放 酶广泛存在 于肽 释放 酶 同时 ． Ｔ
细胞周期 和肿瘤 的侵袭能力 明显 降 作用 ， 通过蛋 白之间相互作用 或桥接分 力 、 低 这些研究提示 ， Ｌ ６可能作为 胃肠 ＫＫ 道肿瘤的肿瘤 标志物 。 ｅ ｋａ ｓ ２ Ｈ ｎ ｈ ｕ 等［］ １ 研
Ｋ Ｋ 基因家族成员 与恶性肿瘤发 究发现 ． Ｌ ６在结肠癌 中有异常表达 ， Ｌｓ ＫＫ Ａ ．（ 的 连 的 、 不 干 扰 、 与 其 他 基 因 无 关 的 生 、发展 的机制 目前 尚未完全 阐明 Ｉ， 并 且 在 下 调 了 Ｃ Ｖ １ 小 窝 蛋 白 ） 细 互 且 ｓ ］ 激肽释放酶基 因家族组 成 ， 人类染色 大量 的研究 ［１表明 ． 是 ９３ －］ 其家 族成员 主要 胞 中， Ｌ ６的表 达和分泌均减少 ， 表 ＫＫ 这 体 中具有高度保守序列 的 、 编码 丝氨酸 在前 列腺癌 、 卵巢癌 、 腺癌 和睾 丸癌 明 Ｃ Ｖ １ 响 Ｋ Ｋ 乳 Ａ 一影 Ｌ ６基 因的表 达 ， 为进 步揭 示 Ｋ Ｋ Ｌ ６过 度 表 达 的 机 制 和 通 蛋 白酶 的最大 的基因家族 。Ｋ Ｋ 基 因 等 内分泌相 关肿 瘤 中异 常 （ Ｌｓ 过高 或过
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人激肽释放酶1(KLK-1)酶联免疫分析（ELISA）试剂盒使用说明书本试剂仅供研究使用目的：本试剂盒用于测定人血清，血浆及相关液体样本中激肽释放酶1(KLK-1)的含量。
实验原理：本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中人激肽释放酶1(KLK-1)水平。
用纯化的人激肽释放酶1(KLK-1)抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入激肽释放酶1(KLK-1)，再与HRP标记的激肽释放酶1(KLK-1)抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。
TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。
颜色的深浅和样品中的激肽释放酶1(KLK-1)呈正相关。
用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中人激肽释放酶1(KLK-1)浓度。
试剂盒组成：试剂盒组成48孔配置96孔配置保存说明书1份1份封板膜2片（48）2片（96）密封袋1个1个酶标包被板1×481×962-8℃保存标准品：27ng/ml0.5ml×1瓶0.5ml×1瓶2-8℃保存标准品稀释液 1.5ml×1瓶 1.5ml×1瓶2-8℃保存酶标试剂3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存样品稀释液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存显色剂A液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存显色剂B液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存终止液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存20倍浓缩洗涤液20ml×1瓶30ml×1瓶2-8℃保存样本处理及要求：1.血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。
2.血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。
3.尿液：用无菌管收集，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。
胸腹水、脑脊液参照实行。
4.细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。
离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清。
检测细胞内的成份时，用PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右。
通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。
离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清。
保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。
5.组织标本：切割标本后，称取重量。
加入一定量的PBS，PH7.4。
用液氮迅速冷冻保存备用。
标本融化后仍然保持2-8℃的温度。
加入一定量的PBS（PH7.4），用手工或匀浆器将标本匀浆充分。
离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清。
分装后一份待检测，其余冷冻备用。
6.标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。
若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融.7.不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。
操作步骤1.标准品的稀释与加样：在酶标包被板上设标准品孔10孔，在第一、第二孔中分别加标准品100µl，然后在第一、第二孔中加标准品稀释液50µl，混匀；然后从第一孔、第二孔中各取100µl分别加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分别加标准品稀释液50µl，混匀；然后在第三孔和第四孔中先各取50µl弃掉，再各取50µl分别加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分别加标准品稀释液50ul，混匀；混匀后从第五、第六孔中各取50µl分别加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分别加标准品稀释液50µl，混匀后从第七、第八孔中分别取50µl加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分别加标准品稀释液50µl，混匀后从第九第十孔中各取50µl弃掉。
（稀释后各孔加样量都为50µl，浓度分别为18ng/ml，12ng/ml，6ng/ml，3ng/ml， 1.5ng/ml）。
2.加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、待测样品孔。
在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40µl，然后再加待测样品10µl（样品最终稀释度为5倍）。
加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。
3.温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。
4.配液：将20倍浓缩洗涤液用蒸馏水20倍稀释后备用。
5.洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。
6.加酶：每孔加入酶标试剂50µl，空白孔除外。
7.温育：操作同3。
8.洗涤：操作同5。
9.显色：每孔先加入显色剂A50µl，再加入显色剂B50µl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟.10.终止：每孔加终止液50µl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。
11.测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。
测定应在加终止液后15分钟以内进行。
注意事项：1．试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡15-30分钟后方可使用，酶标包被板开封后如未用完，板条应装入密封袋中保存。
2．浓洗涤液可能会有结晶析出，稀释时可在水浴中加温助溶，洗涤时不影响结果。
3．各步加样均应使用加样器，并经常校对其准确性，以避免试验误差。
一次加样时间最好控制在5分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。
4．请每次测定的同时做标准曲线，最好做复孔。
如标本中待测物质含量过高（样本OD值大于标准品孔第一孔的OD值），请先用样品稀释液稀释一定倍数（n倍）后再测定，计算时请最后乘以总稀释倍数（×n×5）。
5．封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。
6．底物请避光保存。
7．严格按照说明书的操作进行，试验结果判定必须以酶标仪读数为准.8．所有样品，洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理。
9．本试剂不同批号组分不得混用。
10.如与英文说明书有异，以英文说明书为准。
计算：以标准物的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。
（此图仅供参考）试剂盒性能：1.样品线性回归与预期浓度相关系数R值为0.990以上。
2.批内与批见应分别小于9%和11%检测范围：0.8ng/ml–20ng/ml保存条件及有效期：1.试剂盒保存：；2-8℃。
2．有效期：6个月Human Kallikrein1(KLK1)FOR RESEARCH USE ONLYDrug NamesGeneric Name：Human Kallikrein1(KLK1)ELISA Kit.PurposeThis kit allows for the determination of KLK-1concentrations in Human serum,blood plasma,and other biological fluids.Principle of the assayT he kit assay Human KLK-1level in the sample，use Purified Human KLK-1antibody to coat microtiter plate wells,make solid-phase antibody,then add KLK-1to wells,Combined KLK-1antibody which With HRP labeled, become antibody-antigen-enzyme-antibody complex,after washing Completely,Add TMB substrate solution,TMB substrate becomes blue color At HRP enzyme-catalyzed,reaction is terminated by the addition of a sulphuric acid solution and the color change is measured spectrophotometrically at a wavelength of450nm.The concentration of KLK-1in the samples is then determined by comparing the O.D.of the samples to the standard curve.Materials provided with the kitMaterials provided with the kit 48determinations96determinationsStorageUser manual11Closure platemembrane22Sealed bags11Microelisa stripplate112-8℃Standard：27ng/ml0.5ml×1bottle0.5ml×1bottle2-8℃Standard diluent 1.5ml×1bottle 1.5ml×1bottle2-8℃HRP-Conjugatereagent3ml×1bottle6ml×1bottle2-8℃Sample diluent3ml×1bottle6ml×1bottle2-8℃Chromogen SolutionA3ml×1bottle6ml×1bottle2-8℃Chromogen SolutionB3ml×1bottle6ml×1bottle2-8℃Stop Solution3ml×1bottle6ml×1bottle2-8℃wash solution20ml×1bottle30ml×1bottle2-8℃Specimen requirements1.serum-coagulation at room temperature10-20mins，centrifugation20-minat the speed of2000-3000r.p.m.remove supernatant,If precipitation appeared,Centrifugal again.2.plasma-use suited EDTA or citrate plasma as an anticoagulant,mix10-20mins,centrifugation20-min at the speed of2000-3000r.p.m.remove supernatant,If precipitation appeared,Centrifugal again.3.Urine-collect sue a sterile container,centrifugation20-min at the speed of2000-3000r.p.m.remove supernatant,If precipitation appeared, Centrifugal again.The Operation of Hydrothorax and cerebrospinal fluid Reference to it.4.cell culture supernatant-detect secretory components,collect sue asterile container,centrifugation20-min at the speed of2000-3000r.p.m.remove supernatant,detect the composition of cells,Dilut cell suspension with PBS（PH7.2-7.4）,Cell concentration reached1million/ml,repeated freeze-thaw cycles,damage cells and release of intracellular components, centrifugation20-min at the speed of2000-3000r.p.m.remove supernatant, If precipitation appeared,Centrifugal again.5.Tissue samples-After cutting samples,check the weight,add PBS（PH7.2-7.4）,Rapidly frozen with liquid nitrogen,maintain samples at 2-8℃after melting,add PBS（PH7.4）,Homogenized by hand or Grinders, centrifugation20-min at the speed of2000-3000r.p.m.remove supernatant.6.extract as soon as possible after Specimen collection,and according to therelevant literature,and should be experiment as soon as possible after the extraction.If it can’t,specimen can be kept in-20℃to preserve,Avoid repeated freeze-thaw cycles.7.Can’t detect the sample which contain NaN3,because NaN3inhibits HRPactive.Assay procedure1.Dilute and add sample to Standard:set10Standard wells on the ELISA plates coated,add Standard100µl to the first and the second well,then add Standard dilution50µl to the first and the second well,mix;take out100µl form the first and the second well then add it to the third and the forth well separately.then add Standard dilution50µl to the third and the forth well,mix;then take out50µl from the third and the forth well discard,add 50µl to the fifth and the sixth well,then add Standard dilution50µl to the fifth and the sixth well,mix;take out50µl from the fifth and the sixth well and add to the seventh and the eighth well,then add Standard dilution50µl to the seventh and the eighth well,mix;take out50µl from the seventh and the eighth well and add to the ninth and the tenth well,add Standard dilution50µlto the ninth and the tenth well,mix,take out50µl from the ninth and the tenth well discard(add Sample50µl to each well after Diluting,(density: 18ng/ml,12ng/ml,6ng/ml,3ng/ml,1.5ng/ml)2.add sample：Set blank wells separately(blank comparison wells don’t add sample and HRP-Conjugate reagent,other each step operation is same). testing sample well.add Sample dilution40µl to testing sample well,then add testing sample10µl(sample final dilution is5-fold),add sample to wells, don’t touch the well wall as far as possible,and Gently mix.3.Incubate:After closing plate with Closure plate membrane,incubate for30 min at37℃.4.Configurate liquid:wash solution diluted20-fold with distilled water and reserve.5.washing：Uncover Closure plate membrane,discard Liquid,dry by swing, add washing buffer to every well,still for30s then drain,repeat5times,dry by pat.6.add enzyme：Add HRP-Conjugate reagent50µl to each well,except blank well.7.incubate：Operation with3.8.washing：Operation with5.9.color：Add Chromogen Solution A50ul and Chromogen Solution B to each well,evade the light preservation for15min at37℃10.Stop the reaction：Add Stop Solution50µl to each well,Stop the reaction(the blue color change to yellow color).11.assay：take blank well as zero,Read absorbance at450nm after Adding Stop Solution and within15min.Important notes1.The kit takes out from the refrigeration environment should be balanced15-30minutes in the room temperature,ELISA plates coated if has not useup after opened,the plate should be stored in Sealed bag.2.washing buffer will Crystallization separation,it can be heated the waterhelps dissolve when dilute.Washing does not affect the result.3.add Sample with sampler Each step,And proofread its accuracy frequently,avoids the experimental error.add sample within5mins,if the number of sample is much,recommend to use Volley.4.if the testing material content is excessively higher(The sample OD isbigger than the first standard well),please dilute Sample(n-fold),Please diluente and multiplied by the dilution factor.（×n×5）.5.Closure plate membrane only limits the disposable use,to avoidcross-contamination.6.The substrate evade the light preservation.7.Please according to use instruction strictly,The test result determinationmust take the microtiter plate reader as a standard.8.All samples,washing buffer and each kind of reject should according toinfective material process.9.Do not mix reagents with those from other lots.CalculateTake the standard density as the horizontal,the OD value for the vertical,draw the standardcurve on graph paper,Find out the correspondingdensity according to the sample OD value by theSample curve,multiplied by the dilution multiple,or calculate the straight line regression equationof the standard curve with the standard densityand the OD value,with the sample OD value inthe equation,calculate the sample density,Assay range0.8ng/ml–20ng/mlStorage and validity 1．Storage：2-8℃. 2．validity：six months.。