胰激肽原酶生产尾料中胰蛋白酶的制备工艺研究_王晓桐

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Tab 3 pH value 5. 5 5. 0 4. 5 3. 1. 4 Concentrated liquid Total activity / U 20042812 2180196 677530 重复试验结果分析
， 采 用 BCA 法 测 定 蛋 白 质 含 量。 依 据
BCA100 蛋白质检测试剂盒中说明进行具体操作 。 实验操作 原料酶活测定 根据 2. 1 胰蛋白酶活性测定方法，
检测胰激肽原酶生产原料粗胰酶和生产尾料中胰蛋白酶 （ Trypsin） 的活性。 2. 5. 2 层析柱纯化 将胰激肽原酶生产尾料调 pH 3. 5 ， 4 ħ 静置过夜， 30 min， 15 ħ ） 去除沉淀 离心（ 8 000 r / min， 上清液用纯化水稀释超滤至电导 率 低 于 10 ms / cm 杂质， （ 超滤膜 10 ku） 。将浓缩液调 pH 3. 5 ， 上样层析柱， 用洗脱 液洗脱收集活性峰。 2. 5. 3 2. 5. 3. 1 层析条件优化单因素试验 层析填料的影响 分别选取离子交换层析填料
王晓桐， 等： 胰激肽原酶生产尾料中胰蛋白酶的制备工艺研究 紫外检测波长： 280 nm； 流动相： A 液为含 1ɢTFA 纯化水溶 液； B 液为含 1ɢTFA 乙腈溶液； 梯度洗脱程序： B 液的百分 比随时间变化曲线见下图； 在此条件下保留时间： t = 12 min。 2. 4 蛋白含量测定方法 参照药 典 2. 5 2. 5. 1
纯化倍数为 11. 7 倍。经过该法纯化提取， 可以获得高纯度和符合国家药品标准的产品， 使有限的资源发挥最大 的利用价值。 关键词 胰蛋白酶； 离子交换色谱； 提取纯化； 单因素试验 TQ460. 6 文献标志码 A 文章编号 1005-8915 （ 2015 ） 04-0312-04 Waters 公司） ； 超滤膜（ Millipore 公司， 10 k） 。 2 2. 1 方法 胰蛋白酶活性测定方法 2］ ， L参照文献［ 以 N苯甲酰基精氨酸乙酯 （ BAEE ） 为底物， 用紫外吸收法进行测定 。 称取 BAEE85. 7 mg， 加纯化水溶解并稀释至 100 mL。取 10 mL， 加 0. 067 mol / L 磷酸盐缓冲液（ pH7. 6 ） 90 mL， 作为底 物溶 液。 供 试 品 溶 于 0. 001 mol / L 盐 酸 溶 液， 使 成 50 60 U / mL 溶液。取底物溶液 3 mL， 加入 200 μL 0. 001 mol / L 盐酸溶液作为空白对照。另取 3 mL 底物溶液加入到另一只 比色皿中， 加入 200 μL 供试品溶液， 迅速摇匀， 在 253 nm 处 测定， 每隔 5 s 读数 1 次， 共计 5 min。测定时， 比色皿温度保 持在（ 25 ʃ 0. 5） ħ 。用下式计算胰蛋白酶活力。 P= A1 － A2 0． 003 ˑ 5 ˑ W 中图分类号
分别采用 BCA 法、 紫外吸收法等对所得产品进行蛋白含量和酶活力检 白含量和酶活力作为指标检验纯化效果， 测。结果发现胰蛋白酶纯化的最佳条件为： SP 强阳离子交换树脂， 醋酸盐洗脱液体系， 洗脱液 pH 值为 5. 5 。 在此
6 4 条件下， 蛋白含量为 3. 42 mg / mL； 胰蛋白酶总活力为 2. 18 ˑ 10 U、 比活力为 6. 91 ˑ 10 U / mg； 回收率为 96. 7% ，
Concentrated liquid Total activity / U 819900 2191750 2180196
分别采用磷酸盐洗脱液 、 碳酸
其活性回收率高达 67% ， 胰蛋白酶比活力也比其它洗 时， 脱液高出数倍。
盐洗脱液和醋酸盐洗脱液纯化所得样品的胰蛋白酶活性如 表 2 所示。从表 2 可知， 采用醋酸盐洗脱液进行纯化洗脱 Tab 2 Buffer Carbonate Phosphate Acetate Concentrated liquid Total activity / U 72150 881000 2180196
胰脏中主要含有胰蛋白酶 、 糜蛋白酶、 胰淀粉酶、 胰脂 羧基 肽 酶、 核 糖 核 酸 酶、 弹性蛋白酶和胰激肽原酶 肪酶、 等
［1 ］
。但是由于这些胰脏提取酶类的用途过于广泛， 导致
近年来胰脏资源日趋紧张 。 此外， 国内外的许多生产厂家 普遍只从中提取其中某一种单一的酶类， 而很多有效成分 则被废弃， 造成了资源的极大浪费 。 为了实现资源的合理 本次研究将胰激肽原酶生产尾料做为原料， 根据 综合利用， 胰蛋白酶的理化性质， 从中分离纯化胰蛋白酶， 实现对资源 的综合合理利用。 1 1. 1 材料与仪器 材料与试剂 胰激肽原酶生产尾料取自常州千红生化制药股份有限 100 蛋白质 公司； 胰蛋白酶标准品为 Sigma 公司产品； BCA定量测定试剂盒为上海博彩生物科技有限公司产品； 强阳 离子交换树脂（ SP Sepharose Fast Flow ） 和弱阳离子交换树 脂（ CM Sepharose Fast Flow ） 为 GE Healthcare 公司产品； 反 Gel C18 ， 50 μm 300 ） 为 TOSHO 公司产 相交换树脂（ TSK品； 三氟乙酸（ TFA， 色谱纯） 为美国 Tedia 公司产品； 其余均 为国产分析纯产品。 1. 2 仪器与设备 AKTApurifier100 蛋白纯化系统（ GE Healthcare 公司） ； 高速冷冻离心机（ 长沙湘仪离心机仪器有限公司） ； 紫外分 光光度计（ 北京普析通用仪器有限责任公司） ； 电泳仪（ 美 RAD 公司） ； Waters e2695 型高效液相色谱仪（ 美国 国 BIO-
阳离子交换树脂和反相层析填料纯化所得样品的胰蛋白酶 活性如表 1 所示。从表 1 可知， 强阳离子交换层析柱和反 收集液的胰蛋白酶比活力均 相制备柱的 纯 化 效 果 较 好， 较高。 虽然采用反相制备所得样品的胰蛋白酶比活力最高， 但其活性回收率仅为 15% ， 并且由于胰蛋白酶在有机溶剂 存在、 温度高于室温和疏水键合相等综合条件的影响下发 生变性， 这些化合物可能以两种或两种以上独立或动态平 衡的形式存在， 它们通过色谱柱的保留速度不同， 导致谱峰 展宽、 变形、 甚至出现单一蛋白有多个峰的现象， 部分变性 也易使蛋白在柱上聚集， 造成被洗脱蛋白的回收率低和鬼 不适用于胰蛋白酶的纯化 。 峰，
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Influence of different buffers on trypsin purification Collected liquid Specific activity / （ U / mL） 272 3299 7598 Total activity / U 28288 528600 1448816 Activity recovery / % 39 60 67
Influence of different chromatographic packings on trypsin purification Collected liquid Specific activity / （ U / mL） 17 7598 18332 Total activity / U 85 1458816 330000 Activity recovery / % ≈0 67 15
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Pharmaceutical Biotechnology 2015 ， 22 （ 4 ） ： 312
药
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物
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胰激肽原酶生产尾料中胰蛋白酶的制备工艺研究
2 2 * 1* 1 王晓桐， 于 泉， 戴小敏 ， 韦利军 ， 李 谦 ， 欧 瑜
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（ 1. 中国药科大学 生命科学与技术学院， 江苏 南京 210009 ； 2. 常州千红生化制药股份有限公司， 江苏 常州 213022 ） 摘 要 利用胰激肽原酶生产尾料作为原料提取胰蛋白酶， 采用单因素试验优化纯化工艺， 并以胰蛋白酶蛋
性回收率为 67% ， 进一步使用 pH 为 6. 5 洗脱液洗脱后， 出现一个活性高达 19 205 U / mL 的活性峰， 这说明 pH 5. 0 的洗脱液并不能洗脱完全 。 采用 pH 5. 5 洗脱时， 活性回 收率虽仅为 50% ， 但其比活性高达 97 333 U / mL， 因此综 合考虑选用洗脱液较为合适的 pH 值为 5. 5 。
3. 1. 3 洗脱液 pH 值得影响 分别采用 pH 值为 5. 5 ， 5. 0 和 4. 5 的醋酸盐洗脱液纯化所得样品的胰蛋白酶活性如 表 3 所示 。 从表 3 可知， 采用 pH 4. 5 进行纯化时， 其活性 回收率虽高达 92% ， 但从层析图谱上看， 只出现一个洗脱 峰， 没有达到去除杂蛋白的效果 。 采用 pH 5. 0 洗脱时， 活
P： 1 mL 供试品中胰蛋白酶活性； A1 / A2 ： 反应 5 min 时 光吸收值 / 反应 0 min 时光吸收值； W： 反应液中所含供试品 量（ mL） 。 2. 2 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 3］ 参照文献［ 操作， 选用 15% 的分离胶和 4. 5% 的浓缩
［4 ］ 胶， 上样量 10 μL， 考马斯亮蓝染色 。
［5 ］
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Na2 HPO4 、 50 mmol / L NaCl ） 、 碳 酸 盐 洗 脱 液 （ 50 mmol / L 50 mmol / L NaCl ） 和 醋 酸 盐 洗 脱 液 （ 50 mmol / L Na2 CO3 、 NaAc、 50 mmol / L NaCl ） 进行洗脱， 缓冲液 pH 均调为 5. 0 ， 收集活性峰， 测定收集液的胰蛋白酶活性 。 2. 5. 3. 3 洗脱液 pH 值的影响 选用强阳离子交换树脂和 50 mmol / L NaCl ） ， 醋酸盐洗脱液（ 50 mmol / L NaAc、 分别调 5. 0 和 4. 5 ， 按 2. 5. 2 的方法操作， 收集 洗脱液 pH 值为 5. 5 ， 活性峰， 测定收集液的胰蛋白酶活性 。 3 3. 1 3. 1. 1 结果分析 层析条件优化单因素试验结果分析 层析填料的影响 分别采用弱阳离子交换树脂 、 强
2. 3
反相高效液相色谱 BioC4 柱， 250 mm ˑ 色谱检测条件： 色谱柱： 赛分 Sepax-
4. 6 mm； 体积流量： 1 mL / min； 柱温： 25 ħ ； 进样量： 20 μL。
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12-03 24 收稿日期： 2014修回日期： 2015-04）， 作者简介： 王晓桐（ 1989女， 山东济南人， 硕士研究生， 中国药科大学生命科学与技术学院， 药学硕士。 mail： ouyu2008@ 126. com； 李谦， 通讯作者： 欧瑜， 副教授， 硕导， 中国药科大学生命科学与技术学院； E副教授， 硕导， 中国药科大学生命 mail： leqean@ 163. com； 韦利军， mail： wljcpu@ 科学与技术学院； E博士， 高级工程师， 常州千红生化制药股份有限公司； E163. com
（ 弱阳离子交换树脂 （ CM Sepharose Fast Flow， GE Healthcare） 、 GE 强 阳 离 子 交 换 树 脂 （ SP Sepharose Fast Flow， Healthcare） ） 和反相层析填料（ TSKGel C18 ， 50 μm 300 ， TOSHO） ， 按 2. 5. 2 的方法操作， 收集活性峰， 测定收集液的 胰蛋白酶活性。 2. 5. 3. 2 洗脱液体系的影响 选用强阳离子交换树脂， 按 2. 5. 2 的方 法 操 作， 分 别 选 用 磷 酸 盐 洗 脱 液 （ 50 mmol / L Tab 1 Chromatographic packing CM Sepharose FF SP Sepharose FF TSKGel C18 3. 1. 2 洗脱液体系的影响