分泌型表达载体——基因工程技术与应用

分泌型表达载体 pTA1529
大肠杆菌phoA（碱性磷酸酶）启动子和信号肽序列。 （碱性磷酸酶）启动子和信号肽序列。 大肠杆菌 外源基因插入到信号肽序列后的酶切位点。 外源基因插入到信号肽序列后的酶切位点。 在磷酸盐饥饿时，外源蛋白表达。 在磷酸盐饥饿时，外源蛋白表达。 由周质信号肽酶切下信号肽。 由周质信号肽酶切下信号肽。
北京理工大学生命学院
分泌型表达载体
信号肽 ATG 信号序列 插入位点 终止子
源自文库
分泌型表达载体——原核 原核 分泌型表达载体
原核常用的信号肽： 原核常用的信号肽： 碱性磷酸酶的信号肽和蛋白质A的信号肽 碱性磷酸酶的信号肽和蛋白质 的信号肽
pTA1529 ----phoA (碱性磷酸酶) pINⅢ系统---- ompa（外膜蛋白 Ⅲ系统---（外膜蛋白) PEZZ18----蛋白A PEZZ18----蛋白 ----蛋白
② 在MF α中间插入 中间插入EEAAEAEPK共10个氨基酸的新信号肽序列可使胰岛素在毕 中间插入 共 个氨基酸的新信号肽序列可使胰岛素在毕 赤酵母中的分泌效率提高。 赤酵母中的分泌效率提高。
基因产物有时候会产生信号肽切割不完全， ③ KEX和STEl3基因产物有时候会产生信号肽切割不完全，使一些分泌的蛋白 和 基因产物有时候会产生信号肽切割不完全 使一些分泌的蛋白N 端带有(Glu-Ala)l-2融合序列。通过设计引物去掉 融合序列。通过设计引物去掉(Glu-Ala)1-2两个重复单位。 两个重复单位。 端带有 利用分泌增强子增强外源蛋白的分泌。利用人白介素-1β(hIL-1β)作为分泌增 ④ 利用分泌增强子增强外源蛋白的分泌。利用人白介素 作为分泌增 强子。 强子。
毕赤酵母表达载体pGAPHα的构建 的构建 毕赤酵母表达载体
里氏木霉木聚糖酶基因xyn2 里氏木霉木聚糖酶基因 为报告基因
a—Factor信号肽 信号肽
克鲁维酵母菊粉酶基因 信号肽INU 信号肽
毕赤酵母表达载体pGAPHI-xyn2的构建 的构建 毕赤酵母表达载体
改造分泌信号
借助计算机设计，人工合成信号肽序列：按毕赤酵母的偏爱密码合成了酿酒酵母的α因 ① 借助计算机设计，人工合成信号肽序列：按毕赤酵母的偏爱密码合成了酿酒酵母的 因 子信号肽序列MF4I，随后在MF4I信号肽序列的 端分别引入 ～10个毕赤酵母 ，随后在 信号肽序列的N端分别引入 个毕赤酵母Aox1蛋 子信号肽序列 信号肽序列的 端分别引入1～ 个毕赤酵母 蛋 白质的N端氨基酸，构成 种不同的分泌信号肽序列 种不同的分泌信号肽序列。 白质的 端氨基酸，构成10种不同的分泌信号肽序列。 端氨基酸
信号肽序列： 因子 酸性磷酸酶（ 因子、 酵母常用 信号肽序列：α因子、酸性磷酸酶（PHO5)、蔗糖酶 、 （SUC2）等的信号肽。 ）等的信号肽。 α因子信号肽包含 个氨基酸的前导肽及后面的一段由 因子信号肽包含83个氨基酸的前导肽及后面的一段由 因子信号肽包含 个氨基酸的前导肽及后面的一段由Lys-Arg (Glu-Ala)l-2或Lys-Arg-Glu-Ala-Asp-Ala氨基酸序列组成的问隔肽。 氨基酸序列组成的问隔肽。 氨基酸序列组成的问隔肽 膜结合蛋白酶KEX2基因产物识别 膜结合蛋白酶 基因产物识别Lys-Arg C端，STEl3基因产物 端 基因产物 基因产物识别 则识别(Glu-Ala)l一2或Asp-Ala外侧。 外侧。 则识别 外侧 一 常用的分泌表达载体有： 常用的分泌表达载体有： pPIC9K、pPICZα、pGAPZα系列 、 系列——α因子 、 系列 因子
分泌型表达载体
分泌型表达载体——真核 真核 分泌型表达载体
MCS
S
Zeocin:博莱霉素 博莱霉素
分泌型表达载体——真核 真核 分泌型表达载体
MCS
S
PGAP甘油醛三磷酸脱氢酶 启动子： 启动子：组成型表达启动子
pPIC9上的甲醇 上的甲醇 诱导型启动子AOX 诱导型启动子
组成型启动子 GAP启动子 启动子
pINIII系统 系统
D下游，编码信号肽， 下游，编码信号肽， 下游 可引导蛋白跨膜 pINIII-A1：plasmid ds-DNA 7400 ： 2、优点：分泌表达，避免降解。 BP 、优点：分泌表达，避免降解。 pINIII-A2：plasmid ds-DNA 8900 BP ： pINIII-A3：plasmid ds-DNA 7400 BP ： Ipp（脂蛋白基因）启动子 （脂蛋白基因） Tac启动子 ：IPTG诱导转录。 启动子 诱导转录。 诱导转录 信号肽序列： 信号肽序列：大肠杆菌中分泌蛋白外膜蛋 白(ompa) ； EcoRⅠ、HindⅢ、BamHⅠ Ⅰ Ⅲ Ⅰ lac阻遏子的基因（lacI） 阻遏子的基因（ 阻遏子的基因 ）
pEZZ18
Plac：Lac启动子 ： 启动子 Pspa：金黄色葡萄球菌蛋白A启动子 ：金黄色葡萄球菌蛋白 启动子 S：蛋白A的信号肽序列 ：蛋白 的信号肽序列 两个合成的Z功能域 两个合成的 功能域 琼脂糖层析柱） （结合lgG ，琼脂糖层析柱）2 结合
分泌型表达载体——真核 真核 分泌型表达载体