大鼠体外受精技术研究进展

大鼠体外受精技术研究进展

张春燕1, 2，刘丽均2，徐平2，芮荣1*

1南京农业大学动物医学院，南京210095；

2中国科学院上海实验动物中心，上海201615

摘要：目前，体外受精技术在多种哺乳动物已取得成功并获得广泛应用。大鼠由于其本身的特殊性，体外受精及随后的胚胎培养一直比较困难，国内关于大鼠体外受精方面的研究更是少有报道。文章主要从卵母细胞体外培养、精子获能、受精、受精卵体外培养及胚胎移植等方面着手，对国外大鼠体外受精的研究现状作一简要综述。

关键词：大鼠；体外受精；胚胎培养；胚胎移植

体外受精（IVF）是指在体外环境完成精卵结合的过程。体外受精研究的深入开展，不仅加深了人们对受精机制的认识，也为动物繁育、治疗人类不孕症提供了有力的手段。目前，该项技术在小鼠、兔、山羊、猪和牛等动物及人类已日趋成熟，并得到广泛应用；但在国内少有大鼠体外受精的报道。现将该领域的研究现状作一综述，以供参考。

1. 大鼠体外受精研究简史

事实上，大鼠是较早用于体外受精研究的实验动物之一。早在1968年，Toyoda 和Chang 就开始了大鼠体外受精技术的研究，但只能使去除透明带的卵子和精子在体外受精[1]。1973年，Miyamoto和Chang利用从交配雌鼠子宫内收集的精子进行体外受精时发现，子宫内收集的精子可以使透明带完整的卵子受精[2]。从而用实验证明，以前的体外受精之所以不成功，关键是精子在体外培养时没有获能，不具备穿过透明带使卵子受精的能力。1974年，Toyoda 等研制出适合于大鼠精子体外获能的培养液，由此逐步建立起大鼠体外受精技术[3]。

近年来，研究者在精子获能液、胚胎培养液及提高体外受精胚胎质量方面做了大量研究，目的是尽量模拟体内受精和胚胎发育环境，探索大鼠体外受精的最适条件，以提高其胚胎体外生产效率。

2. 研究方法及进展

完整的体外受精技术包括：卵母细胞的体外成熟（IVM）；精子获能；体外受精；早期胚胎培养和移植。而胚胎移植结果仍是鉴定体外受精胚胎质量的最有效证据。

2.1 卵母细胞的来源与体外成熟

2.1.1收集卵巢未成熟卵母细胞

哺乳动物的卵巢上有大量未成熟、处于不同发育阶段的卵母细胞，这部分卵母细胞需经IVM培养后，方可用于体外受精。获得卵巢卵母细胞的方法主要有两种：（1）机械分离法－利用穿刺针将卵巢表面的卵泡刺破，释放出卵母细胞；或是采用切割法，将整个卵巢切碎后收集卵母细胞。穿刺法采卵数量少，切割法获卵数较多，但切割法会产生更多裸卵或造成卵丘细胞损伤。（2）胶原酶消化法－该方法主要用于腔前卵泡卵母细胞的分离。

大鼠大卵泡（直径>350um）卵母细胞的体外培养，通常使用含15％灭活血清的MEM (Eagle’s Minimum Essential Medium)作为培养液，培养12 h后检查成熟发育情况，以生发泡破裂或第一极体排出作为成熟的判断标准。

*通讯作者，Email：rrui@。

在进行腔前卵泡卵母细胞分离培养时，通常取10或11日龄大鼠卵巢，洗净后放入3ml 含4mg/mL胶原酶与10ug/mL脱氧核糖核酸酶的MEM培养液中，置于37℃ CO2培养箱内孵育30-45 min，再用吸管反复吹打，驱散卵巢组织，收集腔前卵泡。基础培养液为添加有1 mM 丙酮酸钠、0.25 M尿苷、3 mg/mL牛血清白蛋白（BSA）、50 ug/mL庆大霉素、5 ug/mL胰岛素、5 ug/mL转铁蛋白、5 ng/mL硒和2 mM次黄嘌呤的MEM培养液，其渗透压约为300，pH 值为7.3。隔天换液一次，培养20 d后观察卵母细胞生长和成熟分裂情况。

在卵子成熟过程中，卵质、核和膜的同期化“成熟”对于正常受精和发育至关重要。研究表明，卵母细胞的体外培养和发育与其后的受精率和囊胚发育率相关性很大。卵泡液有促进卵质成熟的作用，而卵丘细胞的存在不仅对核成熟有利，并且对体外受精与其后的胚胎发育有利，而且这种作用还可通过向培养液中添加血清或卵泡液得到加强[4]。尽管促卵泡素（FSH）和卵巢类固醇激素对卵母细胞核成熟没有明显的作用，但对卵母细胞成熟后的正常体外受精起着十分重要的作用[5]。胎牛血清（FCS）可以阻止卵母细胞体外培养时的透明带硬化，有利于精子穿透；并可缩短透明带被胰蛋白酶溶解的时间，但对卵母细胞核和胞质影响不大[6]。

2.1.2 体内成熟卵母细胞

即从经超数排卵处理的雌鼠输卵管内采集体内成熟的卵母细胞。超排技术在许多哺乳动物上均有应用，但由于遗传背景的不同和发情周期的差别等原因，对性成熟大鼠的超数排卵收效甚微。Armstrong 和Opavsky（1988）采用连续几天注射FSH的方法，结果获得大量有发育能力的附植前胚胎[7]。近年的研究发现，对65g左右的未成熟大鼠，可间隔48 h腹腔分别注射10 IU孕马血清促性腺激素（PMSG）和人绒毛膜促性腺激素（hCG），可获得大量有受精能力的成熟卵母细胞。

2.2 精子获能

一般认为，哺乳动物的精子必须在雌性动物生殖道内停留一段时间后，才具备使卵子受精的能力，称之为精子获能。获能是哺乳动物精子受精时独具的特征，一般有两个显著的变化，一是脱去精子表面的某些大分子物质和去能因子，这是一个可逆的生理学变化；二是诱发顶体反应，出现顶体结构的变化。

精子获能的方法有体内获能和体外获能两种。体内获能是早期进行体外受精研究时常用的方法，即从交配后一定时间的雌鼠子宫内获取精子，再用于体外受精。体外获能指在体外培养条件下使精子完成获能的方法，精子获能是体外受精中一个关键性技术环节，是影响体外受精结果的重要因素之一。

影响大鼠精子获能的因素很多，常见的因素包括（1）钙离子（Ca2＋）－Ca2＋在诱发精子顶体反应中起重要的作用，钙离子载体能与Ca2＋形成复合物，携带Ca2＋进入精子，从而诱发顶体反应并激活顶体酶。（2）BSA－BSA对于仓鼠、小鼠和牛的IVF都不是必需的，但对大鼠IVF必不可少[8]。BSA可能改变精子的胆固醇含量，调整精子的脂肪水平，从而改变精子膜的稳定性。精子一旦获能，BSA可促进其迅速穿过卵子。（3）渗透压－当渗透压为310时，有利于大鼠精子获能，低于290时则获能不好[8，9]。需要说明的是，这种渗透压是通过增加NaCl浓度，而不是通过增加山梨醇来实现的。由此可见，精子穿透力的提高可能不仅仅是渗透压的作用，还与高浓度的NaCl有关。（4）pH值－大鼠精子获能的最适pH为7.2－7.4。pH值偏高可致快速获能，但不利于精子生存；而偏低则获能时间会大大延长，不利于体外受精的进行。

长久以来，用于大鼠的体外受精液仅仅局限于mKRB液。2004年， Jiang等首次尝试以IVF20作为受精液对SD和Wistar两品系大鼠进行体外受精。结果发现，Wistar 受精率