药品微生物限度检查控制菌检查要点
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• 试验时间过长容易导致假阴性
15
6 凝固酶试验的结果判定
• 阴性对照管血浆流动自如，阳性对照管液 呈凝固状，试验管液呈凝固者为阳性反应； 不凝固为阴性反应。阳性对照管和阴性对 照管任何一管不符合要求时，应另制备血 浆，重新试验
• 目前商品化的凝固酶试剂多家微生物相关 制剂公司有售，试剂具有较好的稳定性、 准确性
• 了解常用的培养方法和常用培养基上各控制菌菌 落特征，知道如何进行菌种分纯，以便于进行下 面的试验
3
3
• 3.1 操作步骤 • 3.1.1 制片-过火固定，避免水冲，破坏细
胞结构使染料易透过 • 3.1.2 结晶紫染色-1分 • 3.1.3 碘液媒染-1分 • 3.1.4 乙醇脱色-30秒 • 3.1.5 沙黄复染-30秒
12
6 血浆凝固酶试验简介
• 主要用于金黄色葡萄球菌的鉴定 • 分为两大类，结合凝固酶和游离凝固酶 • 检测以试管法为参考方法
13
6 凝固酶试验操作方法
• 无菌试管(10×100mm)3支，加入血浆和 0.9%无菌氯化钠溶液(1：1) 各0.5ml，1支 加入被检菌的营养肉汤培养液或菌悬液 0.5ml，作为检品管；其余2支作对照管：1 支加入金黄色葡萄球菌［CMCC(B)26003］ 营养肉汤培养液或菌悬液0.5ml作为阳性对 照；另一支加入营养肉汤或0.9%无菌氯化 钠溶液0.5ml作阴性对照
19
生化鉴定
20
一、大肠杆菌检查法
21
1
• 大肠杆菌即大肠埃希菌（Escherichia coli），为肠杆 菌科埃希菌属的模式种。埃希菌属除大肠埃希菌外，还有 蟑螂埃希菌等四个种
• 大肠埃希菌是人和温血动物肠道内的栖居菌，随粪便排出 体外。在药品中检出大肠杆菌，表明该样品受到人和温血 动物的粪便污染，即可能污染肠道病原体。为保证人体健 康，口服药品必须检查大肠杆菌
8
9
5 氧化酶试验
• 5.1 试验方法：滤纸，无菌玻璃棒，1滴新 配制的1%二盐酸二甲基对苯二胺试液
• 5.2 结果判定：30s，培养物出现粉红色逐 渐变为紫红色，即为氧化酶试验阳性反应。 若培养物不变色或仅显粉色为阴性反应
10
试验阳性图示
11
5.3
• 5.3.1 试验菌落(苔)必须新鲜，陈旧培养物反应 不可靠
阴性菌以内毒素为主
7
4 触酶试验
• 触酶试验不应当在含血的碟子上（用上面 的菌落试验应小心）进行因为红细胞中含 有触酶可能导致假阳性出现
• 用于检测细菌是否生成过氧化氢酶，是否 利于在有氧环境中生长
• 细菌在有环境中代谢可以生成超氧离子和过氧化氢， 具有杀菌作用，能生成触酶的菌种容易耐氧。但厌 氧菌有产生触酶者，某些非厌氧菌触酶也不产生 （链球菌，此试验可用于菌种鉴别）
4
3.2 染色结果
• 革兰阳性菌呈蓝紫色；革兰阴性菌呈红色。 可以分别用金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌 作质控株
5
3.3 革兰染色注意事项
• 3.2.1 玻片必须洁净 • 3.2.2 涂片菌量宜少，菌不可浓 • 3.2.3 新鲜培养物 • 3.2.4 脱色是关键
6
3.3 革兰染色意义
• 3.3.1 初步识别细菌，利于进一步鉴定 • 3.3.2 初步选择治疗用药物 • 3.3.3 与致病性相关，阳性以外毒素为主，
16
7 生化试验
• 细菌鉴定的传统方法，参考方法 • 因为针对不同菌种，选择有针对性的
生化试验进行，菌种不同所作的试验 不同，药品检验中常用的种类不再一 一介绍，所以在以后各菌种鉴定内容 当中单独讨论 • 所有试验都需要已知阳性和阴性的菌 株作为质控菌株，定期对试剂、培养 基（包括培养基的灵敏度试验）以及 试验操作过程进行质控试验，保证结 果解释的准确性
17
8 自动化仪器
• 优点：
– 包含的菌种的生物学特性测试试验种类更多， 可以提高菌种鉴定的准确率
– 缩短菌种鉴定所需要的时间，为检品的快速检 验提供保证
– 细菌鉴定的酶学技术以及近红外技术等其他鉴 定方法应用的研究将为药品微生物鉴定提供更 多的选择和便利
18
• B-D公司的phenix系统、生物梅里埃公司的 VITEK系统等
药品微生物限度检查— 控制菌检查要点
1
菌种分离鉴定Fra Baidu bibliotek程
• 增菌 • 分纯 • 初步鉴别试验
– 革兰染色 – 生化试验 – 酶类试验 – 抗生素敏感性试验（用于菌种鉴
定）
• 全面鉴定
– 血清分型 – 毒素分析 – 基因分型 – 蛋白组分析 – 自动化仪器分析（生化，酶学，
基因序列等）
2
2
• 参看药典微生物限度检查法
• 5.3.2 试验避免与铁、镍等金属接触，否则易出 现假阳性。宜用玻璃棒或木棒
• 5.3.3 试剂宜新鲜配制，放置过久，二盐酸二甲 基对苯二胺氧化变色不可用
• 5.3.4 反应需在有氧条件下进行，勿滴加试剂过 多，以免浸泡培养物使之与空气隔绝，造成假阴 性反应
• 5.3.5 含糖培养基上的菌落不适于做氧化酶试验， 因为糖分解产酸抑制氧化酶活性
• 三管同时置36±1℃水浴或恒温培养箱，3h 后开始检查，以后每隔适当时间观察一次， 直至24h
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6 凝固酶试验的注意事项
• 血浆凝固酶试验应用新鲜培养物及新 鲜血浆。如用陈旧培养物及血浆(纤维 蛋白常已析出)易导致假阴性反应
• 用试管法检查时，轻轻将试管倾斜， (动作勿大，防止江凝块摇碎)仔细观 察
• 大肠埃希菌除普通大肠杆菌外尚有致病性大肠杆菌、产毒 性大肠杆菌、溶血性大肠杆菌、侵袭性大肠杆菌等，可引 起婴幼儿、成人爆发性腹泻、结膜炎等病症
22
2
• 菌种为大肠杆菌［ＣＭＣＣ（Ｂ）44102］ • 对照菌液加入量含菌50～100cfu（一般用
量为0.1ml）
– 制作方法：营养琼脂斜面培养物少许，接种至 5ml营养肉汤培养基内，36±1℃培养18～24h后， 用0.9％无菌氯化钠溶液稀释至1：106
– 有抑菌活性的检品应进行预处理
• 稀释法 • 离心沉淀集菌法 3000r/min离心30min，有不溶性沉渣先
500r/min离心5min • 薄膜过滤法 0.45um± 0.02 100ml • 中和法 磺胺类100ml中1~5ml1%对氨基苯甲酸；砷汞，硫乙醇
酸盐；洗必泰，聚山梨醇酯80 • 自然沉降法 难溶于水的抗菌制剂 • 同时做阳性和阴性对照
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6 凝固酶试验的结果判定
• 阴性对照管血浆流动自如，阳性对照管液 呈凝固状，试验管液呈凝固者为阳性反应； 不凝固为阴性反应。阳性对照管和阴性对 照管任何一管不符合要求时，应另制备血 浆，重新试验
• 目前商品化的凝固酶试剂多家微生物相关 制剂公司有售，试剂具有较好的稳定性、 准确性
• 了解常用的培养方法和常用培养基上各控制菌菌 落特征，知道如何进行菌种分纯，以便于进行下 面的试验
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• 3.1 操作步骤 • 3.1.1 制片-过火固定，避免水冲，破坏细
胞结构使染料易透过 • 3.1.2 结晶紫染色-1分 • 3.1.3 碘液媒染-1分 • 3.1.4 乙醇脱色-30秒 • 3.1.5 沙黄复染-30秒
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6 血浆凝固酶试验简介
• 主要用于金黄色葡萄球菌的鉴定 • 分为两大类，结合凝固酶和游离凝固酶 • 检测以试管法为参考方法
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6 凝固酶试验操作方法
• 无菌试管(10×100mm)3支，加入血浆和 0.9%无菌氯化钠溶液(1：1) 各0.5ml，1支 加入被检菌的营养肉汤培养液或菌悬液 0.5ml，作为检品管；其余2支作对照管：1 支加入金黄色葡萄球菌［CMCC(B)26003］ 营养肉汤培养液或菌悬液0.5ml作为阳性对 照；另一支加入营养肉汤或0.9%无菌氯化 钠溶液0.5ml作阴性对照
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生化鉴定
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一、大肠杆菌检查法
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• 大肠杆菌即大肠埃希菌（Escherichia coli），为肠杆 菌科埃希菌属的模式种。埃希菌属除大肠埃希菌外，还有 蟑螂埃希菌等四个种
• 大肠埃希菌是人和温血动物肠道内的栖居菌，随粪便排出 体外。在药品中检出大肠杆菌，表明该样品受到人和温血 动物的粪便污染，即可能污染肠道病原体。为保证人体健 康，口服药品必须检查大肠杆菌
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5 氧化酶试验
• 5.1 试验方法：滤纸，无菌玻璃棒，1滴新 配制的1%二盐酸二甲基对苯二胺试液
• 5.2 结果判定：30s，培养物出现粉红色逐 渐变为紫红色，即为氧化酶试验阳性反应。 若培养物不变色或仅显粉色为阴性反应
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试验阳性图示
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5.3
• 5.3.1 试验菌落(苔)必须新鲜，陈旧培养物反应 不可靠
阴性菌以内毒素为主
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4 触酶试验
• 触酶试验不应当在含血的碟子上（用上面 的菌落试验应小心）进行因为红细胞中含 有触酶可能导致假阳性出现
• 用于检测细菌是否生成过氧化氢酶，是否 利于在有氧环境中生长
• 细菌在有环境中代谢可以生成超氧离子和过氧化氢， 具有杀菌作用，能生成触酶的菌种容易耐氧。但厌 氧菌有产生触酶者，某些非厌氧菌触酶也不产生 （链球菌，此试验可用于菌种鉴别）
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3.2 染色结果
• 革兰阳性菌呈蓝紫色；革兰阴性菌呈红色。 可以分别用金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌 作质控株
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3.3 革兰染色注意事项
• 3.2.1 玻片必须洁净 • 3.2.2 涂片菌量宜少，菌不可浓 • 3.2.3 新鲜培养物 • 3.2.4 脱色是关键
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3.3 革兰染色意义
• 3.3.1 初步识别细菌，利于进一步鉴定 • 3.3.2 初步选择治疗用药物 • 3.3.3 与致病性相关，阳性以外毒素为主，
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7 生化试验
• 细菌鉴定的传统方法，参考方法 • 因为针对不同菌种，选择有针对性的
生化试验进行，菌种不同所作的试验 不同，药品检验中常用的种类不再一 一介绍，所以在以后各菌种鉴定内容 当中单独讨论 • 所有试验都需要已知阳性和阴性的菌 株作为质控菌株，定期对试剂、培养 基（包括培养基的灵敏度试验）以及 试验操作过程进行质控试验，保证结 果解释的准确性
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8 自动化仪器
• 优点：
– 包含的菌种的生物学特性测试试验种类更多， 可以提高菌种鉴定的准确率
– 缩短菌种鉴定所需要的时间，为检品的快速检 验提供保证
– 细菌鉴定的酶学技术以及近红外技术等其他鉴 定方法应用的研究将为药品微生物鉴定提供更 多的选择和便利
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• B-D公司的phenix系统、生物梅里埃公司的 VITEK系统等
药品微生物限度检查— 控制菌检查要点
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菌种分离鉴定Fra Baidu bibliotek程
• 增菌 • 分纯 • 初步鉴别试验
– 革兰染色 – 生化试验 – 酶类试验 – 抗生素敏感性试验（用于菌种鉴
定）
• 全面鉴定
– 血清分型 – 毒素分析 – 基因分型 – 蛋白组分析 – 自动化仪器分析（生化，酶学，
基因序列等）
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• 参看药典微生物限度检查法
• 5.3.2 试验避免与铁、镍等金属接触，否则易出 现假阳性。宜用玻璃棒或木棒
• 5.3.3 试剂宜新鲜配制，放置过久，二盐酸二甲 基对苯二胺氧化变色不可用
• 5.3.4 反应需在有氧条件下进行，勿滴加试剂过 多，以免浸泡培养物使之与空气隔绝，造成假阴 性反应
• 5.3.5 含糖培养基上的菌落不适于做氧化酶试验， 因为糖分解产酸抑制氧化酶活性
• 三管同时置36±1℃水浴或恒温培养箱，3h 后开始检查，以后每隔适当时间观察一次， 直至24h
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6 凝固酶试验的注意事项
• 血浆凝固酶试验应用新鲜培养物及新 鲜血浆。如用陈旧培养物及血浆(纤维 蛋白常已析出)易导致假阴性反应
• 用试管法检查时，轻轻将试管倾斜， (动作勿大，防止江凝块摇碎)仔细观 察
• 大肠埃希菌除普通大肠杆菌外尚有致病性大肠杆菌、产毒 性大肠杆菌、溶血性大肠杆菌、侵袭性大肠杆菌等，可引 起婴幼儿、成人爆发性腹泻、结膜炎等病症
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• 菌种为大肠杆菌［ＣＭＣＣ（Ｂ）44102］ • 对照菌液加入量含菌50～100cfu（一般用
量为0.1ml）
– 制作方法：营养琼脂斜面培养物少许，接种至 5ml营养肉汤培养基内，36±1℃培养18～24h后， 用0.9％无菌氯化钠溶液稀释至1：106
– 有抑菌活性的检品应进行预处理
• 稀释法 • 离心沉淀集菌法 3000r/min离心30min，有不溶性沉渣先
500r/min离心5min • 薄膜过滤法 0.45um± 0.02 100ml • 中和法 磺胺类100ml中1~5ml1%对氨基苯甲酸；砷汞，硫乙醇
酸盐；洗必泰，聚山梨醇酯80 • 自然沉降法 难溶于水的抗菌制剂 • 同时做阳性和阴性对照