水解条件对纤维素酶解速度的影响

水解条件对纤维素酶解速度的影响

夏　安Ξ　何泽超　四川大学　成都　610065

陈党生　内江师范学院　内江　641112

摘要　纤维素酶水解速度与水解温度、pH值、水解时间等因素有关。超声波可加速纤维素的酶水解速度,用N2保护能延缓纤维素酶的失活。

关键词　纤维素　纤维素酶　水解

目前,以石油、煤和天然气作为最基本的有机化工原料和燃料。这些有限的资源正在不断地被开采,最终将枯竭。纤维素是一种廉价的可再生资源,是高等植物细胞壁的主要成分,其含量达植物干重的35%～55%,广泛存在于自然界。地球上每年光合作用可生成415×1010吨左右的纤维素。但纤维素材料只有一小部分被用于纺织、造纸、建筑、饲料、农肥、燃料等方面,不仅造成资源浪费而且污染环境,带来公害。将纤维素水解成葡萄糖,再通过发酵可生产乙醇、丙酮、丁醇等有机化工原料和燃料,也可以生产饲料、食物和药物等。纤维素材料是解决人类面临的粮食问题、能源问题和环境问题的最有前景的资源。研究、开发纤维素资源有着深远的意义。

纤维素分子是由许多吡喃型的β-D-葡萄糖分子以β-1,4-糖苷键连接形成的长链,100～200条长链通过氢键形成纤维素束,纤维素束的外围又被木质素层和半纤维素所包围,纤维素的这种结构使得纤维素的化学性质比较稳定,一般极难溶于溶剂,只有水解成单糖才能被微生物利用。纤维素水解成葡萄糖的方法有酸水解和酶水解。酸水解对设备的腐蚀作用大、条件苛刻并产生大量的酸废水,因而限制了发展和应用,现已基本被淘汰。酶水解反应条件温和、易于控制、产物单纯等,因而被广泛应用,但是水解速度较慢并受多种因素影响。研究各种因素的影响规律、提高酶水解速率及转化率成了研究的重点。影响纤维素酶水解的因素主要有水解温度、pH值、底物种类、酶来源及浓度、水解时间、失活剂和激活剂等。经研究发现,在一定强度和频率范围的超声波场中,纤维素的酶解速率有较大提高;同时在纤维素酶解反应器中用N

2置换空气后,具有延缓纤维素酶失活的作用。这些结果对纤维素酶水解工艺设计有一定的参考价值。

1　材料与方法

111　实验药品

滤纸:定量滤纸,杭州新华纸业有限公司生产。

纤维素酶(3.2.1.4):来源于绿色木霉,分子量～52000,上海丽珠生物技术有限公司生产。

3,5-二硝基水杨酸:化学纯,浙江湖州生物化学厂生产。

无水葡萄糖:分析纯,重庆化学试剂总厂生产。

112　设备

电热恒温水浴锅:QS501型,重庆试验设备厂生产。

超声波清洗器:C Q250型,频率(33±2)kH z,中船七院七二六所生产。

分光光度计:752型,上海第三分析仪器厂生产。

113　溶液

0105m olΠl pH4.8柠檬酸缓冲液

012%纤维素酶溶液

110gΠl葡萄糖标准溶液

1%3,5-二硝基水杨酸试剂(DNS试剂)[1] 114　DNS比色法葡萄糖标准曲线

先在1～7号比色管中分别加入010～013ml

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CHE MIC A L E NGI NEERI NG DESIG N 化工设计2002,12(1)Ξ夏　安:1994年毕业于四川大学化工系,现为四川大学化学工程专业硕士研究生。联系电话:(028)5405210。

1%标准葡萄糖溶液,再用水补足到015ml ,然后加

入1ml pH4.8柠檬酸盐缓冲液,最后加入3ml DNS 试剂。摇匀后在沸水浴中准确放置5min ,用水迅速冷却。用蒸馏水定容至25ml 后,再充分摇匀,静置20min 。然后在波长540nm 处,以空白(1号)作参照比色测定吸光度,结果见图1

。

图1　DNS 比色法的标准曲线

由图1可见葡萄糖浓度0～2mg Πml 内,与吸光度有很好的直线关系。115　实验方法准确称取细滤纸条50mg ,放入具塞磨口比色管底部,加入缓冲液1ml ,纤维素酶溶液015ml 。将比色管口塞上橡胶塞,悬挂在超声波恒温水浴中,或置于普通的超级恒温水浴中,在一定温度下水解。水解一定时间后,马上加入3ml DNS 溶液

以终止水解反应的进行。用DNS 比色法[1]

进行还原糖测定,并以相同时间产生的还原糖量作为水解的相对速度。此方法的实验工作量比较大,但水解结果的平行较好,可靠性较高。每个实验都同时作两个平行样,一般取平均值。由于纤维

素酶的稳定性较差[2]

,在做单因素实验时,为了消除各种其它因素引起的系统误差,同一组数据一般取自同时进行的实验。

2　

实验结果与分析

211　温度

反应条件为:015ml 酶液+1ml 缓冲液+50mg

滤纸条,pH =4.8,反应时间均为30min 。分别在超声波水浴中震荡和电热恒温水浴锅中做平行实验,达到反应时间后,立即取出中止反应,用DNS 比色法测定还原糖含量。实验结果见图2。

从图2可以看出,在超声波水浴和在普通水浴中温度的影响相似,25～60℃温度范围内,随着温度的升高,葡萄糖生成的量也相应增加,即反应

图2　温度对纤维素酶水解反应的影响

速度加快,但渐趋平缓。和文献

[3]

报道的纤维素酶最优温度50～60℃相吻合。考虑到纤维素酶

在高温下易失活,在水解时间长的情况下,最优温度将降低,因而在以后的实验中都采用40℃的水解温度。212　pH 值

反应条件为:015m l 酶液+1m l 缓冲液+50m g 滤纸条,40℃,反应时间均为30m in 。实验结果见图3。

图3　pH 值对纤维素酶水解的影响

从图3可以看出,纤维素的酶水解过程对pH

值的变化比较敏感。相同水解时间里,在较低的pH 值下还原糖量随pH 值的上升而增大,在pH =510左右达到极大值后,随pH 值升高而减少。这和文献报道值pH =4.8相吻合。在极大值附近,超声波水浴中的纤维素酶解速率比普通恒温水浴锅中的速率约大35%。213　反应时间

反应温度为40℃,pH =4.8,其余条件同上,分别在超声波水浴和普通水浴中进行纤维素酶水解,改变反应时间,结果如图4所示。

实验表明:在短时间内,纤维素酶解速率比较快;随着反应时间的延长,产物增加,酶解速率减缓,这是因为产物对酶有抑制作用。在一定时间范围内(至少8小时),超声波场中的纤维素转化率大于电热恒温水浴锅中转化率,随后二者的纤维素转化率逐渐接近,最后普通水浴中的葡萄糖浓度反而比超声波水浴中高,所以超声波在一定时间范围内对纤维素酶水解起加速作用。

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12002,12(1) 夏　安等　水解条件对纤维素酶解速度的影响