高效液相色谱仪的原理及应用知识
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2016/1/14
四、正相高效液相色谱
是由极性固定相和非极性（或弱极性）流动 相所组成的HPLC体系。其代表性的固定相是
改性硅胶、氰基柱等，代表性的流动相是正
己烷。吸附色谱也属正相HPLC。
溶剂洗脱强度近似地随溶剂的介电常数增加
而增大，洗脱能力越弱，溶质在柱上保留时
间越长。
2016/1/14
第二节 高效液相色谱仪的组成
梯度洗脱
95% MeOH 30%
优点：可提高分离度、缩短分离时间、 降低最小检测量和提高分离精度。
2016/1/14
2、进样系统
流路中为高压力工作状态， 通常使用耐高压的六通阀进样装置：
2016/1/14
3、分离系统
高效分离柱
直型不锈钢管，内径1～8 mm，柱长5～40 cm。
2016/1/14
一、高效液相色谱法的定义和分类
液相色谱：平板色谱和柱色谱。 液相色谱：分配色谱、液固色谱、离子交换 色谱、尺寸排阻色谱。 气相色谱：挥发性物质，不能用于热不稳定 物质分析。 液相色谱：可分析各种物质，热不稳定物质 ，但流动相有毒，运行操作比 GC 难。能用 GC就用GC。
2016/1/14
二、液相色谱中常用术语和参数
2016/1/14
（3）化学键合固定相
化学键合固定相: 目前应用最广、性能最佳的固定相； a. 硅氧碳键型： ≡Si—O—C b. 硅氧硅碳键型：≡Si—O—Si — C 稳定，耐水、耐光、耐有机溶剂，应用最广； c. 硅碳键型： ≡Si—C d. 硅氮键型： ≡Si—N
2016/1/14
2. 流动相
只针对HPLC特有的，其余术语与第三章同 。 粒间体积（V0）：色谱柱填充剂颗粒间隙中 流动相所占有的体积。
孔体积 （ Vp ） ：色谱柱中多孔填充剂的所
有孔洞中流动相所占有的体积。
2016/1/14
二、液相色谱中常用术语和参数
柱外体积（ Vext ）：从进样系统到检测器之 间色谱柱以外的液路部分中流动相所占有的 体积。 液体总体积（Vtot） ：粒间体积、孔体积和 柱外体积之和。 淋洗体积（V） ：从进样开始计算的通过色 谱柱的实际淋洗体积。
2016/1/14
(1) 贮液装置
分析用高效液相色谱的流动相贮罐，常
用1L的锥形瓶加一个电磁搅拌器，在连接 到泵入口处的管线上要加一个过滤器。
2016/1/14
(2) 脱气装置
用于脱去流动相中的溶解气体，流动相先经过脱 气装置再输送到色谱柱。 脱气机、超声脱气、真空脱气等。
2016/1/14
(3) 高压输液泵
色谱柱ຫໍສະໝຸດ Baidu
C18色谱柱
填料
十八烷基硅基化学键合 到多孔硅胶或陶瓷微粒 多孔硅胶微粒 辛基硅烷化学键合到 多孔硅胶微粒上
SIL ZORBAX Eclipse XDB-C8
2016/1/14
柱的保养：
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 柱子在任何情况下不能碰撞、弯曲或强烈震动； 当柱子和色谱仪联结时，阀件或管路一定要清洗干净； 要注意流动相的脱气； 避免使用高粘度的溶剂作为流动相； 进样样品要预先提纯； 严格控制进样量； 每天分析工作结束后，要清洗进样阀中残留的样品； 每天分析测定结束后，都要用适当的溶剂来清洗柱； 若分析柱长期不使用，应用适当有机溶剂保存并封闭；
按流动相组成分：单组分和多组分；
按极性分：极性、弱极性、非极性；
按使用方式分：固定组成淋洗和梯度淋洗。 常用溶剂： 己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯 、乙醇、乙腈、水。 采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵活 调节流动相的极性或增加选择性，以改进分离或调 整出峰时间。
2016/1/14
流动相选择
在选择溶剂时，溶剂的极性是选择的重要依据。
芍药苷
白芍药材
2016/1/14
血竭素
血竭药材
2016/1/14
作业
• P73 2
2016/1/14
xiexie
2016/1/14
2016/1/14
等度洗脱
输液泵
进样器 柱温箱 检测器
色谱柱
单一或混合溶剂
2016/1/14
等度洗脱
MeOH / H2O = 6 / 4
分析时间长
分离度差
MeOH / H2O = 8 / 2
怎样解决呢？
2016/1/14
梯度洗脱
A 进样器
色谱柱
柱温箱
检测器
A 泵
B 浓度 B B泵
时间
2016/1/14
仪器：
(1)液相色谱仪： 色谱柱：ODS柱，柱长250mm，Φ4mm； 柱温：30℃； 流动相：75％甲醇； 流速：2mL／min。
(2)检测器：荧光检测器，激发波长369nm，荧光波长405nm。
2016/1/14
操作步骤：
(1) 定性测定 用微量注射器吸取一定量的苯并芘标准溶液和 样液，注入色谱仪内，根据苯并芘的出峰保留时间和样品中加 标准样产生重叠的情况进行定性。 (2) 标准曲线的绘制 用微量注射器准确吸取每1mL含1μg的 以获得相应的色谱图。然后，分别测量各个色谱的峰面积。以 峰面积为纵坐标，标准苯并芘量为横坐标，绘制标准曲线。
2016/1/14
三、反相高效液相色谱
由非极性固定相和极性流动相所组成的液相 色谱体系。其代表性的固定相是十八烷基键合 硅胶 ( ODS 柱），代表性的流动相是甲醇和乙 腈。是当今液相色谱的最主要分离模式。 溶质在填料表面的烃类和流动相之间进行分配。 溶质在吸附于填料表面烃类上的“改良固定相” 和流动相之间进行分配 溶质被吸附于填料表面烃类分子上，类似吸附 色谱。
2016/1/14
第三节 HPLC的应用
1、环境中有机氯农药残留量分析
固定相：薄壳型硅胶(37 ～50m) 流动相：正己烷 流 速：1.5 mL/min 色谱柱：50cm2.5mm(内径) 检测器：折光示差检测器
可对水果、蔬菜中的农药 残留量进行分析。
2016/1/14
2、稠环芳烃的分析
稠环芳烃多为致癌物质。
2016/1/14
c. 荧光检测器
高灵敏度、高选择性； 对多环芳烃、维生素 B、 黄曲霉素、卟啉类化合物、 农药、药物、氨基酸、甾类 化合物等有响应。
2016/1/14
d. 质谱检测器：
2016/1/14
二、高效液相液相色谱固定相和流动相
1. 固定相
（1）全多孔型担体 由氧化硅、氧化铝、硅藻土等制成的多孔球体；早期采 用100μm的大颗粒，表面涂渍固定液，性能不佳已不多见； 现采用10μm以下的小颗粒，化学键合制备柱填料； （2）表面多孔型担体 （薄壳型微珠担体） 30 ～ 40 μ m 的玻璃微球， 表面附着一层厚度为1 ～ 2μm的多孔硅胶。 表面积小，柱容量底；
固定相：十八烷基硅烷化键合相
流动相：20%甲醇-水 ～100%甲醇 线性梯度淋洗，2%/min 流 柱 速：1mL/min 温：50 º C
柱
压：70 104 Pa
检测器：紫外检测器
2016/1/14
例：液相色谱法测定食品中苯并(a)芘
原理：
样品经过提取、皂化以及柱层析净化，除去脂肪类物质、色 素等杂质后，再通过液相色谱仪中的色谱柱，将苯并芘从多环 芳烃物质中分离出来。求出样品中苯并芘的含量。
采用正相液-液分配分离时：首先选择中等极 性溶剂，若组分的保留时间太短，降低溶剂极性， 反之增加。 也可在低极性溶剂中，逐渐增加其中的极性溶 剂，使保留时间缩短。 常用溶剂的极性顺序： 水(最大) > 甲酰胺> 乙腈> 甲醇> 乙醇> 丙醇> 丙酮> 二氧六环> 四氢呋喃> 甲乙酮> 正丁醇> 乙 酸乙酯> 乙醚> 异丙醚> 二氯甲烷>氯仿>溴乙烷> 苯>四氯化碳>二硫化碳>环己烷>己烷>煤油(最小)
主要部件之一，压力：150～350×105 Pa。
为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相（<10μm），液 体的流动相高速通过时，将产生很高的压力，因此高压、高
速是高效液相色谱的特点之一。μL/min~几千mL/min
应具有压力平稳、流量稳定可调、耐腐蚀等特性
2016/1/14
(4) 梯度淋洗装置
Waters 717自动进样器，
Waters 2487双波长紫外检测器，
联想数据处理机，
Waters 3. 9 X 150 mm C18不锈钢柱 流动相：甲醉、水体积比30：70 和15：85两种， 超声波除气泡
2016/1/14
喹乙醇标准品
无喹乙醇的鲤肌肉
含喹乙醇的鲤肌肉
2016/1/14
4、中药质量检测
Agilent 1100
2016/1/14
一 高效液相色谱仪系统
1.输液系 统 2.进样系 统 3.分离系 统 4.检测系 统 5.数据处 理 系统 流动相溶剂
2016/1/14
进样口
高压泵
色谱柱
检测器
废液
1、输液系统
贮液装置
脱气装置
高压输液泵 梯度淋洗系统 输液系统的功能: 1.提供足够的驱动力使流动相通过填充柱 2.使流动相流量精确和稳定 3.使流动相组成精确
苯并芘标准溶液1、2、3、4、5uL按照上述实验条件进行操作，
(3) 样品的测定： 在上述实验条件下，吸取一定量经过柱净
化的样品提取液，注入液相色谱仪中进行分离、分析，测得峰 面积，然后从标准曲线上查出相应于此面积的苯并芘含量。
2016/1/14
3、鱼组织中喹乙醇残留量的检测
Waters 515高效液相色谱泵，
2016/1/14
ODS柱的使用注意点：
1）柱压低于150kg/cm2（15cm色谱柱） 2）柱温在40℃左右，最高使用温度为50℃ 3）流动相pH使用范围为2～7.5
2016/1/14
4、检测系统
目前最常用的检测器主要有： 紫外-可见检测器 荧光检测器 电化学检测器 折光示差检测器 蒸发光散射检测器
质谱检测器
2016/1/14
a. 紫外检测器
应用最广，对大部分有机化合物有响应。
I0 log A abc I
UV 灯
截止棱镜
氧化钬滤光片
狭缝 采样二极 管 光栅 流通池 镜2 参考二极管
镜1
2016/1/14
b. 光电二极管阵列检测器
紫外检测器的重要进展； 光电二极管阵列检测器：1024个二极管阵列，各检测特 定波长，计算机快速处理，三维立体谱图。
高效液相色谱仪的原理 及应用
2016/1/14
第一节 高效液相色谱法原理
一、高效液相色谱法的定义和分类
流动相是液体的色谱称为液相色谱（ LC）。 在液相色谱中，采用颗粒十分细的高效 固定相，并采用高压泵输送流动相，全 部工作通过仪器完成，这种色谱称为高 效液相色谱（HPLC） 。
2016/1/14
四、正相高效液相色谱
是由极性固定相和非极性（或弱极性）流动 相所组成的HPLC体系。其代表性的固定相是
改性硅胶、氰基柱等，代表性的流动相是正
己烷。吸附色谱也属正相HPLC。
溶剂洗脱强度近似地随溶剂的介电常数增加
而增大，洗脱能力越弱，溶质在柱上保留时
间越长。
2016/1/14
第二节 高效液相色谱仪的组成
梯度洗脱
95% MeOH 30%
优点：可提高分离度、缩短分离时间、 降低最小检测量和提高分离精度。
2016/1/14
2、进样系统
流路中为高压力工作状态， 通常使用耐高压的六通阀进样装置：
2016/1/14
3、分离系统
高效分离柱
直型不锈钢管，内径1～8 mm，柱长5～40 cm。
2016/1/14
一、高效液相色谱法的定义和分类
液相色谱：平板色谱和柱色谱。 液相色谱：分配色谱、液固色谱、离子交换 色谱、尺寸排阻色谱。 气相色谱：挥发性物质，不能用于热不稳定 物质分析。 液相色谱：可分析各种物质，热不稳定物质 ，但流动相有毒，运行操作比 GC 难。能用 GC就用GC。
2016/1/14
二、液相色谱中常用术语和参数
2016/1/14
（3）化学键合固定相
化学键合固定相: 目前应用最广、性能最佳的固定相； a. 硅氧碳键型： ≡Si—O—C b. 硅氧硅碳键型：≡Si—O—Si — C 稳定，耐水、耐光、耐有机溶剂，应用最广； c. 硅碳键型： ≡Si—C d. 硅氮键型： ≡Si—N
2016/1/14
2. 流动相
只针对HPLC特有的，其余术语与第三章同 。 粒间体积（V0）：色谱柱填充剂颗粒间隙中 流动相所占有的体积。
孔体积 （ Vp ） ：色谱柱中多孔填充剂的所
有孔洞中流动相所占有的体积。
2016/1/14
二、液相色谱中常用术语和参数
柱外体积（ Vext ）：从进样系统到检测器之 间色谱柱以外的液路部分中流动相所占有的 体积。 液体总体积（Vtot） ：粒间体积、孔体积和 柱外体积之和。 淋洗体积（V） ：从进样开始计算的通过色 谱柱的实际淋洗体积。
2016/1/14
(1) 贮液装置
分析用高效液相色谱的流动相贮罐，常
用1L的锥形瓶加一个电磁搅拌器，在连接 到泵入口处的管线上要加一个过滤器。
2016/1/14
(2) 脱气装置
用于脱去流动相中的溶解气体，流动相先经过脱 气装置再输送到色谱柱。 脱气机、超声脱气、真空脱气等。
2016/1/14
(3) 高压输液泵
色谱柱ຫໍສະໝຸດ Baidu
C18色谱柱
填料
十八烷基硅基化学键合 到多孔硅胶或陶瓷微粒 多孔硅胶微粒 辛基硅烷化学键合到 多孔硅胶微粒上
SIL ZORBAX Eclipse XDB-C8
2016/1/14
柱的保养：
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 柱子在任何情况下不能碰撞、弯曲或强烈震动； 当柱子和色谱仪联结时，阀件或管路一定要清洗干净； 要注意流动相的脱气； 避免使用高粘度的溶剂作为流动相； 进样样品要预先提纯； 严格控制进样量； 每天分析工作结束后，要清洗进样阀中残留的样品； 每天分析测定结束后，都要用适当的溶剂来清洗柱； 若分析柱长期不使用，应用适当有机溶剂保存并封闭；
按流动相组成分：单组分和多组分；
按极性分：极性、弱极性、非极性；
按使用方式分：固定组成淋洗和梯度淋洗。 常用溶剂： 己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯 、乙醇、乙腈、水。 采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵活 调节流动相的极性或增加选择性，以改进分离或调 整出峰时间。
2016/1/14
流动相选择
在选择溶剂时，溶剂的极性是选择的重要依据。
芍药苷
白芍药材
2016/1/14
血竭素
血竭药材
2016/1/14
作业
• P73 2
2016/1/14
xiexie
2016/1/14
2016/1/14
等度洗脱
输液泵
进样器 柱温箱 检测器
色谱柱
单一或混合溶剂
2016/1/14
等度洗脱
MeOH / H2O = 6 / 4
分析时间长
分离度差
MeOH / H2O = 8 / 2
怎样解决呢？
2016/1/14
梯度洗脱
A 进样器
色谱柱
柱温箱
检测器
A 泵
B 浓度 B B泵
时间
2016/1/14
仪器：
(1)液相色谱仪： 色谱柱：ODS柱，柱长250mm，Φ4mm； 柱温：30℃； 流动相：75％甲醇； 流速：2mL／min。
(2)检测器：荧光检测器，激发波长369nm，荧光波长405nm。
2016/1/14
操作步骤：
(1) 定性测定 用微量注射器吸取一定量的苯并芘标准溶液和 样液，注入色谱仪内，根据苯并芘的出峰保留时间和样品中加 标准样产生重叠的情况进行定性。 (2) 标准曲线的绘制 用微量注射器准确吸取每1mL含1μg的 以获得相应的色谱图。然后，分别测量各个色谱的峰面积。以 峰面积为纵坐标，标准苯并芘量为横坐标，绘制标准曲线。
2016/1/14
三、反相高效液相色谱
由非极性固定相和极性流动相所组成的液相 色谱体系。其代表性的固定相是十八烷基键合 硅胶 ( ODS 柱），代表性的流动相是甲醇和乙 腈。是当今液相色谱的最主要分离模式。 溶质在填料表面的烃类和流动相之间进行分配。 溶质在吸附于填料表面烃类上的“改良固定相” 和流动相之间进行分配 溶质被吸附于填料表面烃类分子上，类似吸附 色谱。
2016/1/14
第三节 HPLC的应用
1、环境中有机氯农药残留量分析
固定相：薄壳型硅胶(37 ～50m) 流动相：正己烷 流 速：1.5 mL/min 色谱柱：50cm2.5mm(内径) 检测器：折光示差检测器
可对水果、蔬菜中的农药 残留量进行分析。
2016/1/14
2、稠环芳烃的分析
稠环芳烃多为致癌物质。
2016/1/14
c. 荧光检测器
高灵敏度、高选择性； 对多环芳烃、维生素 B、 黄曲霉素、卟啉类化合物、 农药、药物、氨基酸、甾类 化合物等有响应。
2016/1/14
d. 质谱检测器：
2016/1/14
二、高效液相液相色谱固定相和流动相
1. 固定相
（1）全多孔型担体 由氧化硅、氧化铝、硅藻土等制成的多孔球体；早期采 用100μm的大颗粒，表面涂渍固定液，性能不佳已不多见； 现采用10μm以下的小颗粒，化学键合制备柱填料； （2）表面多孔型担体 （薄壳型微珠担体） 30 ～ 40 μ m 的玻璃微球， 表面附着一层厚度为1 ～ 2μm的多孔硅胶。 表面积小，柱容量底；
固定相：十八烷基硅烷化键合相
流动相：20%甲醇-水 ～100%甲醇 线性梯度淋洗，2%/min 流 柱 速：1mL/min 温：50 º C
柱
压：70 104 Pa
检测器：紫外检测器
2016/1/14
例：液相色谱法测定食品中苯并(a)芘
原理：
样品经过提取、皂化以及柱层析净化，除去脂肪类物质、色 素等杂质后，再通过液相色谱仪中的色谱柱，将苯并芘从多环 芳烃物质中分离出来。求出样品中苯并芘的含量。
采用正相液-液分配分离时：首先选择中等极 性溶剂，若组分的保留时间太短，降低溶剂极性， 反之增加。 也可在低极性溶剂中，逐渐增加其中的极性溶 剂，使保留时间缩短。 常用溶剂的极性顺序： 水(最大) > 甲酰胺> 乙腈> 甲醇> 乙醇> 丙醇> 丙酮> 二氧六环> 四氢呋喃> 甲乙酮> 正丁醇> 乙 酸乙酯> 乙醚> 异丙醚> 二氯甲烷>氯仿>溴乙烷> 苯>四氯化碳>二硫化碳>环己烷>己烷>煤油(最小)
主要部件之一，压力：150～350×105 Pa。
为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相（<10μm），液 体的流动相高速通过时，将产生很高的压力，因此高压、高
速是高效液相色谱的特点之一。μL/min~几千mL/min
应具有压力平稳、流量稳定可调、耐腐蚀等特性
2016/1/14
(4) 梯度淋洗装置
Waters 717自动进样器，
Waters 2487双波长紫外检测器，
联想数据处理机，
Waters 3. 9 X 150 mm C18不锈钢柱 流动相：甲醉、水体积比30：70 和15：85两种， 超声波除气泡
2016/1/14
喹乙醇标准品
无喹乙醇的鲤肌肉
含喹乙醇的鲤肌肉
2016/1/14
4、中药质量检测
Agilent 1100
2016/1/14
一 高效液相色谱仪系统
1.输液系 统 2.进样系 统 3.分离系 统 4.检测系 统 5.数据处 理 系统 流动相溶剂
2016/1/14
进样口
高压泵
色谱柱
检测器
废液
1、输液系统
贮液装置
脱气装置
高压输液泵 梯度淋洗系统 输液系统的功能: 1.提供足够的驱动力使流动相通过填充柱 2.使流动相流量精确和稳定 3.使流动相组成精确
苯并芘标准溶液1、2、3、4、5uL按照上述实验条件进行操作，
(3) 样品的测定： 在上述实验条件下，吸取一定量经过柱净
化的样品提取液，注入液相色谱仪中进行分离、分析，测得峰 面积，然后从标准曲线上查出相应于此面积的苯并芘含量。
2016/1/14
3、鱼组织中喹乙醇残留量的检测
Waters 515高效液相色谱泵，
2016/1/14
ODS柱的使用注意点：
1）柱压低于150kg/cm2（15cm色谱柱） 2）柱温在40℃左右，最高使用温度为50℃ 3）流动相pH使用范围为2～7.5
2016/1/14
4、检测系统
目前最常用的检测器主要有： 紫外-可见检测器 荧光检测器 电化学检测器 折光示差检测器 蒸发光散射检测器
质谱检测器
2016/1/14
a. 紫外检测器
应用最广，对大部分有机化合物有响应。
I0 log A abc I
UV 灯
截止棱镜
氧化钬滤光片
狭缝 采样二极 管 光栅 流通池 镜2 参考二极管
镜1
2016/1/14
b. 光电二极管阵列检测器
紫外检测器的重要进展； 光电二极管阵列检测器：1024个二极管阵列，各检测特 定波长，计算机快速处理，三维立体谱图。
高效液相色谱仪的原理 及应用
2016/1/14
第一节 高效液相色谱法原理
一、高效液相色谱法的定义和分类
流动相是液体的色谱称为液相色谱（ LC）。 在液相色谱中，采用颗粒十分细的高效 固定相，并采用高压泵输送流动相，全 部工作通过仪器完成，这种色谱称为高 效液相色谱（HPLC） 。
2016/1/14