第三章 细胞培养与其在中医药中应用

三 其它类似体内的环境
温度与湿度 气体 渗透压 氢离子浓度(pH)
四 合理的计划，维持细胞性状
尽早冻存原代细胞，复苏后状态恢复的细 胞以及转染后稳定存在的细胞 需要做实验的细胞要选对数生长期 防止细胞污染，如遇污染，及时处理
1 细菌污染
细菌污染是实验室细胞培养中常见的污染，即使在细 胞培养液中加入了抗菌素(一般为预防剂量)，也可能 因为操作不慎而引起污染。最常见的有革兰氏阳性菌。 培养细胞受细菌污染后，会出现培养液变混浊，pH改 变。也有的培养液肉眼观察无多少改变，只能在镜下 发现菌体才知污染。所以，每天应仔细观察。污染后 细胞发生病理改变，胞内颗粒增多、增粗，最后变圆 脱落死亡，造成试验失败和细胞株(系)丢失。
1 无菌无毒害的环境 2 支持生长增殖的营养 3 其它类似体内的环境 4 维持细胞性状
一 细胞培养需无菌无毒环境
• 实验室设计合理 • 常用设施及设备 • 培养器皿：
透明度好、无毒、利于细胞贴附和生长的材料， 常用一次性聚苯乙烯材料制品或中性硬度玻璃制 品。
细胞培养无菌操作基本技术
• 工作环境及表面的处理（如高锰酸钾甲醛熏蒸消 毒）
细胞在体内、外的贴附方式：存在差异 体内：贴附是全方位,外形具有复杂的立体特征 体外：多数情况，细胞只有一个附着平面，外 形一般与体内时明显不同 贴附的固相表面：玻璃、聚苯乙烯塑料 按照培养细胞的主要形态，可分为几大类型
1 成纤维细胞型：
名称：凡在培养中形态与成纤维细胞类似的 来源：由中胚层间充质组织起源的组织如：
第三章 细胞培养及其在中医药研究中 的应用
第一节 动物细胞的分型
培养细胞的形态特征
Hepatocytes
体外培养细胞的分型
一 贴附型
成纤维细胞型 上皮型细胞 游走细胞型 多形型细胞 二 悬浮型 三 半贴壁型（如小鼠肥大细胞瘤细胞P815 ）
Leabharlann Baidu
一 贴附型：
大多数培养细胞贴附生长，属于贴壁依赖性细胞 贴附:是大多数有机体细胞在体内生存和生长发育的基本 存在方式 结果: 基于贴附特性，使细胞与细胞之间相互结合形成组 织，有机体的绝大多数细胞必须贴附于一固相表面才能生 存和生长。 培养时：这些细胞被放到体外环境中以后,同样需要贴附 于某一固相表面才能生存和生长，因而属于贴附型细胞 贴附(锚定或锚着)依赖型(性)细胞：唯有贴附于固相表面 才能生存的细胞
胞质常突起，呈活跃游走或变形运 动，方向不规则。此型细胞不稳定， 有时难以和其他细胞相区别。 4 多型细胞型：
有一些细胞，如神经细胞难以 确定其规律和稳定的形态，可统归 于此类。
二 悬浮型：
见于少数特殊的细胞，如某些类型的癌细胞及白血病细胞。 胞体圆形，不贴于支持物上，呈悬浮生长。这类细胞容易 大量繁殖。
3 支原体污染
支原体是介于细菌与病毒之间能独立生活的最小微 生物，最小直径0.2μm，一般过滤除菌无法去除 它，光镜下难以看清它的形态结构。开始不易发 现，能在偏碱条件(pH7.6～8.0)下生存，对青霉素 有抗药性。多吸附于细胞表面或散在于细胞之间。 电镜下可见其有三层结构，无细胞壁，中央有电子 密度大的密集颗粒或丝状的中心囊。
2 真菌污染
真菌污染是细胞培养过程中最常见的一种，尤其在霉雨季节 进行细胞培养更易污染。最常见的真菌有烟曲霉、黑曲菌、孔 子霉、毛霉菌、白色念珠菌和酵母菌。
培养细胞受真菌污染后，可见培养液中漂浮着白色或浅黄色的 小点，有的散在生长，培养液一般不发生混浊；倒置显微镜下 可见丝状、管状或树枝状的菌丝纵横交错在细胞之间或培养基 中，有的呈链状排列。念珠菌和酵母菌呈卵圆形散在细胞周边 和细胞之间。个体细小，有增多趋势。镜下看时，要将培养瓶 用酒精棉球擦干净，以防止与瓶外尤其瓶底外面生长的菌丝相 混淆。真菌污染后，细胞生长变慢，但最后由于营养耗尽及毒 性作用而使细胞脱落死亡。
• 其它成分（条件培养基）
合成培养基的主要成分
• 氨基酸 • 碳水化合物 • 无机盐 • 维生素 • 其它辅助物质
培养基种类
• RPMI-1640（标准型） • DMEM-高糖（标准型） • DMEM-低糖（标准型） • McCoys 5A • M199 • F12
血清
牛血清、马血清、人血清
（1）储存于-20℃ ～-70℃ 低温冰箱中
（2）一般厂商提供的血清为无菌 （3）热灭活是指55℃, 30 分钟加热已完全解冻的
血清，目的是使血清中的补体成分（complement） 灭活，并除去支原体 （4）血清中的沉淀物絮状物，可用离心3000rpm, 5 分钟去除，也可不用处理。
其它常用液体试剂
• Hank’s • D-Hank’s • PBS • NaHCO3（ 7.5% ） • 胰酶溶液（0.25%）
名称：仅形态上似体内，实际上不完全相同
来源：来源于外胚层、内胚层细胞, 如：皮肤及其衍 生物,消化道，乳腺，肺泡, 上皮性肿瘤
形态：类似体内的上皮细胞，扁平，不规则多角形， 中有圆形核
生长特点：易相连成片，相靠-紧密相连,成薄层-铺 石状生长时呈膜状移动，很少脱离细胞群而单个活 动
3 游走细胞型： 呈散在生长，一般不连成片，
真正的成纤维细胞：心肌，平滑肌，成骨细胞， 血管内皮 形态：似体内成纤维细胞的形态，胞体梭形或不规则 三角形，胞质向外伸出2—3个长短不等的突起， 中有卵圆形核 生长特点：排列成放射状，漩涡状，并不紧靠连成片， 细胞-细胞接触易断开而单独行动，游离的单独 的成纤维样细胞，常有几个伸长的细胞突起
2 上皮型细胞：
概念：培养时不贴壁而呈悬浮状态生长 或以机械方法使保持悬浮状态下生长
来源：自血，脾或骨髓，血中白细胞，有些癌肿细胞 特点：在悬浮中生长良好，细胞圆形，单个或小细胞团 优点：生存空间大，提供数量大，传代方便(不需消化)，
易于收获，可获得稳定状态 缺点：纯化不方便，不能通过离心将死、活细胞分离
第二节 细胞培养总原则
• 细胞培养所用玻璃及塑料制品的处理 • 培养液与培养细胞的处理
二 细胞的营养
• 培养基：合适的细胞培养基是体外细胞生长增 殖的最重要的条件之一，培养基不仅提供细胞 营养，而且是促使细胞生长增殖的基础物质并 提供细胞生长和繁殖的生存环境。
• 血清：血清是细胞培养液中最重要的成分之一， 含有细胞生长所需的多种生长因子及其它营养 成分 。