植物组织培养第五章 花药和花粉培养

殖，它的花粉给不育系授粉，能使不育系当代结实
并在F1代恢复育性正常的品系。是杂交种子的父本。
不育系（母本）×同型保持系（父本） ↓ 不育系（母本）×恢复系（父本） ↓
F1代种子—生产上杂交种子
1、克服后代分离、缩短育种年限 常规育种中，杂交F2代起会出现性状分离，到 F6代才开始选择，育成一个品种需8-10年。单倍 体育种将F1或F2代花药进行培养，对所获得的单 倍体植株进行加倍处理，获得稳定的纯合二倍体， 下一代植株性状基本稳定，育种只需3-5年。
（二）花粉培养
1．取材时期的确定 四分体—单核早期—单核晚期—双核早期—双核晚期—三核期 小孢子 花粉培养 花粉粒 花药培养
2、花粉预处理
低温处理花蕾，或单核后期离心预处理。
3、花粉分离
适合的花蕾-消毒-取出花药-烧杯壁中挤压花 药-尼龙网过滤-花粉液离心-花粉粒沉淀-培养基 稀释-纯净花粉群体。
C途径：在获得的花粉植株群体中，除单倍 体外，常有相当比例的二倍体、三倍体、四倍 体、非整倍体等非单倍体植株，即小孢子培养 过程中自发加倍现象。此途径中，生殖核与营 养核共同参与了花粉植株的形成。`Fra bibliotek2、B途径
小孢子第一次有丝分裂为均等分裂，形成两个 大小相近的细胞（或游离核）。以后，由这两个细 胞连续分裂产生单一类细胞组成的多细胞花粉或多 核花粉。 （二）雄核发育的启动机理（不讲）
（一）花药培养方法 1、材料的选取
大多数园艺植物的花药培养，成功率最高的是
单核期或单核中晚期。
花粉的发育时期：
四分体 — 小孢子 — 单核花粉 — 双核花粉
最适期
2、材料与处理与灭菌
3-5℃低温处理3-10天-（大花蕾将萼片剥掉） -酒精几秒-0.1%升汞10min-无菌水冲洗。 3、接种培养 镊子剥去花瓣-花药均匀接种于培养基上，常 用培养基MS、N6和马铃薯培养基。 蔗糖5-10%，20-30℃，光照12h。
蔗糖改为9%蔗糖+2%麦芽糖。
⑥前期产生的愈伤组织分化能力较强，后期产生
的愈伤组织分化能力降低，白苗率相对较高，
所以出愈后应提早进行转分化培养。
五、影响雄核发育和花粉花药培养的因素
(一)基因型
植物基因型是影响离体诱导单倍体成功的最重要 因素之一。
（三）白化苗的控制
措施：
①采穗时主要取主茎和大分蘖穗，取花粉发育时 期处于单核中晚期的幼穗。镊取花药接种时，幼 穗穗轴中部分花药全取，下部多取，上部少取。 ②幼穗4℃低温离体预处理24h。
③脱分化培养一般栽暗室进行，温度30-32 ℃时， 出愈率较高，但白苗多。在29 ℃条件下培养， 较为理想。
④脱分化培养基一般情况下用2.0mg/l的2，4-D愈 0.5mgl的KT或6-BA配合使用。 ⑤诱导愈伤组织分化阶段，把培养基的碳源由11%
②研磨过滤收集法。与上法相似，区别是把消毒过 的花蕾置与无菌的研钵中研磨，挤出小孢子。
3)机械游离法 ①磁搅拌法 将花药接种盛有培 养液或渗透压稳定剂的三角瓶→放一根磁棒→ 置磁力搅拌器低速旋转至花药透明。 ②小型搅拌（超速旋切）法 4)小孢子分离和纯化 小孢子匀浆→ 过筛→离心收集
花粉培养方式
一、活体小孢子发育途径
花粉发育时期对诱导雄核发育是极其重要的。 花粉母细胞经减数分裂形成四分体，有多种模式， 以四面体和等二面体最普遍。 体细胞组织分泌出胼胝质到四分体表面，花粉 四分体的胼胝质壁溶解并释放出四个小孢子。此时， 小孢子细胞质浓厚，中央有一细胞核。 当液泡发生时，小孢子体积迅速增加，细胞核 被挤向一边。在第一次有丝分裂时，小孢子核产生 大而疏松的营养核和一个小而致密的生殖核，形成 两个精子，它们处在花粉或花粉管中。小孢子从里 到外被绒毡层、中层、药室内壁和表皮包围着。
1、A途径
小孢子的第一次有丝分裂按配子体方式进行， 为不均等分裂，形成营养细胞和生殖细胞（或营养 核和生殖核），这种途径又可细分为以下几种途径： A-V途径：多细胞花粉（多核花粉）由营养细胞 重复分裂衍生而成，生殖细胞以游离核的形式存在 一个周期后退化，或分裂一至数次后存在于多核花 粉的一侧，有的甚至到球形胚形成时仍存在。因此， 生殖核并不参与花粉孢子体的形成，在花粉中往往 可以观察到生殖细胞的存在。
第五章
花药和花粉培养
目的与要求
掌握花药培养和花粉培养技术，掌握花药和花 粉培养在单倍体育种中的重要应用，了解我国单 倍体育种成就。 具有进行花药培养和花粉培养的基本能力，具 有单倍体育种认知，初步具备查阅资料收集信息 基础能力。
第一节 花药培养和花粉培养的概念和应用
一、概念
花药培养是将一定发育期的花药进行离体培养 的技术，就培养方法和技术来讲，属于器官培养的 范畴。
（二）白化苗产生的影响因素及机理 ① 内部因素和外部因素在一定程度上影响 花粉植株的白苗率。 内部因素：供体植株的基因型、花药和花粉 本身的状态 外部因素：低温预处理、培养基成分、生长 激素水平和种类、培养条件和方法、愈伤组织转 分化时间等。
②质体DNA的缺失可能是出现白化苗的直接原因。
③核基因是控制花药培养力（包括绿苗率）的 关键因素。小麦花粉白苗发生是由核基因控制的， 或是由核DNA变异引起的。 ④一些研究者认为，离体培养中高频发生的体 细胞无性系变异是花粉白苗大量出现的原因之一。
草莓花药再生植株
2、植株的分化再生 （1）愈伤组织-植株，降低生长素与蔗糖浓度， 提高细胞分裂素。
（2）胚状体-植株，降低无机盐浓度，蔗糖浓 度。高的是单核期或单核中晚期。
草莓花药植株
二、花粉培养
花粉培养比花药培养优越：从较少的花药得到大 量的花粉植株;便于生理生化研究。
（一）花药预培养 适合的花蕾—浸有滤纸的培养皿中—5℃几天— 灭菌—取出花药—接种于培养基中数天—将花粉分 离—悬浮培养。
（一）单倍体植物在育种中的作用 现代农业用杂种优势的有效途径是杂交制种， 目前应用最广泛地为“三系配套”，对小麦、水 稻等自花授粉的植物显得尤为重要。
雄性不育系—指自身雄蕊不正常，不能产生正 常的花粉或花粉败育，雌蕊正常，接受外来花粉能
正常结实的品系。一般作杂交母本。
雄性不育同型保持系—自身雌雄蕊正常，能自 交繁殖，用它的花粉给不育系授粉，使不育系结实， 并保持雄性不育系的后代仍是不育的品系。 雄性不育恢复系—自身雌雄蕊正常，能自交繁
秋水仙素浸苗、处理愈伤组织、涂抹田间单倍 体植株的顶芽、腋芽。 3、从愈伤组织再生：
单倍体植株作外植体培养愈伤组织，反复继代 培养可得较多二倍体植株，也叫组织创伤法。
第二节 花粉小孢子发育途径
离体培养条件下，花粉是产生花粉植株的原始 细胞，其第一次有丝分裂，在本质上与合子的第一 次孢子体分裂相似，把花粉形成植株的途径称为 “花粉孢子体发育途径”。 目前，习惯把小孢子或花粉沿孢子体途径发育 成花粉植株的过程称为“雄核发育”。
第三节 花药和花粉培养方法 一、花药培养
首先报道通过花药培养获得单倍体植株成功 的是印度学者Guha和Maheshwari(1964, 1966)。 已有250多种植物花药培养成功。目前，花药培养 获得单倍体的技术途径已在禾本科作物、茄科作 物、十字花科作物的育种中广泛应用。 花药培养可诱导花粉发育形成单倍体，快速 获得纯系；缩短育种周期，利于隐性突变体筛选、 提高选择效率；与二倍体融合成体-配杂种。
4、培养方法 培养基：我国朱至清N6适于禾谷类作物、庄 家骏马铃薯2号、王培C17、欧阳文俊W14等。 高浓度的铵离子抑制花粉愈伤组织形成，活 性炭、铁盐促进花粉分裂。生长素促愈伤组织 形成，2,4-D抑制愈伤组织分化成胚状体。 蔗糖浓度不同植物有不同。天然有机附加物 可提高花粉愈伤组织和胚状体诱导率，促进生 长。
花粉分离
花粉分离
将小孢子从花药里游离出来的主要方法有： 1)自然散落法 合适的花蕾消毒后→无菌条件 下取出花药→接种在预处理液或培养基→花粉 囊自动裂开→小孢子散落到培养基中→收集小 孢子→用新鲜培养基培养。
2)挤压法
①挤压法 消毒处理过的花药→置与无菌培养皿或 烧杯中→加少量提取液→用注射器内管或一端压扁 的玻璃棒轻压花药→花粉挤到提取液中→级联过筛 →除去组织碎片→低速离心→沉淀→清洗几次→制 成小孢子悬浮液用于培养。
1、A途径
A-G途径：生殖细胞进行多次分裂形成胚状体， 营养细胞不分裂或者仅分裂数次形成胚柄结构。由生 殖细胞形成的细胞群其核致密，染色后着色较深，容 易同营养细胞衍生而来的细胞群区分开来。
A-VG途径：花粉内的营养细胞和生殖细胞独立分 裂，形成两类细胞群，各群的子细胞都类似其母细胞 `
1、A途径
二、离体小孢子发育途径
（一）雄核发育途径 离体培养时，尽管雄核发育可在四分体时期和 双核花粉期被诱导，但最适宜诱导的时期是第一次 有丝分裂或之前。小孢子在培养过程中呈现不同的 发育模式。 目前，一般根据小孢子第一次有丝分裂情况将 雄核发育分为A途径（不均等分裂）和B途径（均等 分裂），其中A途径又根据第二次分裂及其以后的情 况细分为A-V途径、A-G途径、A-VG途径（E途径）及 C途径。
花粉培养：将处于一定发育阶段的花粉从花药 中分离出来，再加以离体培养。有时花粉培养也称 为小孢子培养。从培养方法和技术方面来讲，它属 于细胞培养的范畴。
二、 花药和花粉培养的应用
花药和花粉培养所得单倍体植株，不能开花 结实，本身无利用价值。应用于植物品种改良和 新品种选育，形成了单倍体育种，有重要作用。
三、花粉植株形态发生方式
如果不考虑小孢子核的早期分裂行为，花 粉植株的形态发生有两种途径，即胚状体发 育途径（直接发生途径）和愈伤组织发育途 径（间接发生途径）。
三、花粉植株形态发生方式
（一）胚状体发育途径 小孢子的行为与合子的一样，经历了如同 活体条件下诱导胚发生的各个阶段。 （二）愈伤组织发育途径 与胚状体发育途径相比，小孢子没有经历 胚发生阶段，而是分裂数次形成愈伤组织， 从花药壁上冒出来。
三、移栽驯化
花粉植株非常娇嫩，很难移植。需采取逐步过 渡的方式，使其适应从异养到自养。移栽的关键是 保持高空气湿度（80%-90%，1-2周）和低土壤湿度。 试管植株的移栽驯化方法参见第九章。
四、白化苗现象
大部分禾谷类作物的花粉白化苗比例很高（有 的可高达80%以上。
四、白化苗现象
（一）白化花粉植株的亚微结构特征 小麦花粉绿苗和花粉白化苗虽在形态、营养生长和 染色体倍性上无明显差异，但白苗的生殖生长和雌蕊 发育均不正常，在离体培养条件下，它不能完成有性 世代和产生种子。 在花粉白化苗的细胞中，常发现有微核存在，叶肉 细胞的细胞质中，存在着原质体，质体早期发育正常， 但发育到一定阶段即停止发育，在质体中缺乏核糖核 蛋白体。 某些胚性花粉粒和白苗的茎段分生细胞中出现染色 体断片和微核。
可固体培养或液体培养。
草莓花药愈伤组织
（二）花药培养下花粉的发育与植株再生
1、花粉离体培养的发育
A途径 花粉进行不对称分裂，形成一个大的营养 细胞和小的生殖细胞，接着分裂形成胚或愈伤组 织。
B途径 花粉进行对称分裂，细胞相似于营养细胞， 发育成胚状体或愈伤组织。
C途径 生殖细胞与营养细胞同时发育，核融合形 成胚状体。
2、选择效率高
为常规育种的2n倍。
3、有利于隐性基因控制性状的选择
杂交育种中等位基因的隐性基因被显性基因掩盖， 不宜显现出来，单倍体育种中隐性基因都被加倍而 纯合，利于选择。
4、快速获得自交系的超雄株 利于异花授粉植物杂种优势的利用。
5、其他
提纯复壮、远缘杂交。
（二）单倍体植株的染色体加倍 1、自然加倍 2、人工加倍：
1）平板培养 花粉置琼脂固化培养基上培养，诱 导产生胚状体，进而分化成植株。 2）液体培养 花粉悬浮在液体培养基中进行培养。 3）双层培养 花粉置固体-液体双层培养基上培养。
4）看护培养 配制好花粉粒悬浮液和琼脂固体 培养基后，将完整的花药或花药的愈伤组织放 在琼脂培养基上，将圆片滤纸放在花药或愈伤 组织上，然后将花粉置与滤纸的上方。 5）微室培养 将花粉培养在很少的培养基中。 做法：①琼脂培养基②液体培养基 6）条件培养基培养 在预先培养过花药的液体 培养基中或在加入失活的花药提取物的合成培 养基中，接入花粉进行培养。