03动植物细胞培养生物反应器 生物工程设备

应器结构较简单，氧传递效率高，剪切力低，对细胞的损伤小， 容易实现长期无菌培养，较适用于植物细胞培养。 气升式反应器用于多种植物细胞悬浮培养或固定化细胞培养， 但其操作弹性较小，低气速时，尤其 H/D 大，高密度培养时， 混合性能欠佳。 过量供气， 过高的氧浓度反而会影响细胞的生长 和次生代谢产物的合成。 将气升式发酵罐与慢速搅拌结合使用可 弥补低气速时混合性差的弱点， 采用分段的气升管， 也有利于氧 的利用与混合。 转鼓式反应器用于烟草细胞悬浮培养的研究发现， 与有一个通 风管的气升式反应器相比， 相同条件下转鼓式反应器中生长速率 高， 其氧的传递及剪切力对细胞的伤害水平方面均优于气升式反
⑾笼式通气搅拌反应器、⑿双层笼式通气搅拌反应器； ⒀空气提升式反应器等。
二、动物细胞培养方法
1 贴壁培养 贴壁培养（attachment culture）是指细胞贴附在一定的固相表 面进行的培养。 a.生长特性：贴壁依赖型细胞在培养时要贴附于细胞培养器皿 壁上，细胞一经贴壁就迅速铺展，然后开始有丝分裂，数天后就 铺满培养表面，并形成致密的细胞单层。 b.贴壁培养的优点：容易更换培养液；高细胞密度；不需过滤
甲型肝炎疫苗、乙型肝炎疫苗、红细胞生成素、单克隆抗体等产 品。 2 动物细胞生长特性： （1）细胞生长缓慢，易污染，培养需用抗生素 （2）细胞大，无细胞壁，机械强度低，环境适应性差 （3）需氧少，不耐受强力通风与搅拌 （4）群体生长效应，贴壁生长（锚地依赖性） （5）培养过程产品分布细胞内外，成本高 （6）原代培养细胞一般繁殖 50 代即退化死亡 3 动物细胞培养的环境 动物细胞的生长、 繁殖和代谢等生理性质在很大程度上受到各
系统；培养液/细胞的比例；适用于所有类型细胞。 c.贴壁培养的缺点： 扩大培养比较困难， 投资大； 占地面积大； 不能有效监测细胞的生长。 d.细胞贴壁的表面：要求 TC 技术处理后具有净阳电荷和高度 表面活性。 对微载体而言还要求具一定电荷密度； 若为有机物表 面，必须具有亲水性，并带阳电荷。 e.贴壁培养系统：主要有转瓶、中空纤维、玻璃珠、微载体系 统等。 2 悬浮培养 悬浮培养（suspension culture） ：是指细胞在反应器中自由悬浮 生长的过程。 主要用于非贴壁依赖型细胞培养， 如杂交瘤细胞等；
根据不同植物细胞生长和代谢产物积累的特点， 目前已研究设计 出多种类型的反应器用于植物细胞培养。 机械式搅拌生 悬浮培养反应 非机械搅拌反 植物细胞反应 固定化细胞培 填充床生物反 流化床生物反 膜式生物反应
一、悬浮培养生物反应器
１机械搅拌生物反应器 尽管机械搅拌反应器已成功地应用于大规模细胞生产中， 反应 器内的温度、pH、溶氧及营养物质浓度较其他反应器更易控制 等优点， 但主要问题是机械搅拌造成的剪切力以对植物细胞造成 较大的损伤， 特别对次级代谢产物的合成影响极大， 同时会带来 染菌和机械上的问题， 因此需对反应器结构进行改造， 包括改变 搅拌形式、叶轮结构与类型、空气分布器等，力求减少产生的剪 切力，同时满足供氧与混合的要求。 图示目前规模最大的植物细胞培养反应器装置
实验证明采用带有 1 个双螺旋带状叶轮和 3 个表面挡板的搅拌 罐， 证明适于剪切力敏感的高密度细胞培养， 在反应器中得到与 摇瓶相同的高浓度生物量； 带微孔金属丝网作为空气分布器的三 叶螺旋桨反应器(MRP)能提供较小的剪切力和良好的供氧及混 合状态， 优于六平叶涡轮桨反应器， 并认为在高浓度细胞培养时， MRP型反应器将显示更大的优越性。另有方框型桨式搅拌、蝶 型涡轮搅拌等不同形式的机械搅拌罐用于植物细胞培养的生产 和研究， 结果证明不同叶轮产生剪切力大小顺序为涡轮状叶轮＞ 平叶轮＞螺旋状叶轮。
动植物、微生物细胞培养的比较 项目 大小（um） 悬浮生长 营养要求 生长速率 细胞分化 环境敏感 剪切力敏感 产物存在 细胞或产物浓度% 产物种类 机化合物、酶等 长因子、免疫调节剂等 有机化合物等 微生物 1~10 可以 简单 快，倍增时间 0.5~5hr 无 不敏感 低 胞内或胞外 较高 动物细胞 10~100 可以，多采用贴壁 非常复杂 植物细胞 10~100 可以，但细胞易聚集 较复杂
慢，倍增时间 15~100hr 慢，倍增时间 24~74hr 有 非常敏感 非常高 胞内或胞外 低 高 能忍受广泛范围 高 胞内 低
发酵食品、抗生素、有 疫苗、激素、抗体、生 酶、 生物碱、 天然色素、
由于它们所用的培养基不同， 培养时所要求的条件不同所以在 批量生产目的产物时就要选择相应的生物反应器。 选择时要注意 到生物反应器在反应过程中的剪切力、传质问题，如气-液质量 传递和液-固质量传递。生物反应器的结构、操作方式和操作条 件对生物技术产品的质量、转化率和能耗有着密切关系。 在选择相应的生物反应器之前要了解该种细胞培养的特点及 其注意事项来选择相应的反应器。 各大生物制品研究所及生化制 药和生物工程公司的制药企业， 根据生产需要而采用了切实可行 的不同方法和技术设备。
（2）非贴壁依赖型细胞：无需附着于固相表面即可生长，包括 血液、淋巴组织细胞、许多肿瘤细胞及某些转化细胞。这类细胞 可以采用与微生物培养类似的方法进行悬浮培养。 5 生物反应器 根据生物反应器的不同用途，有：悬浮培养生物反应器、贴壁 培养生物反应器、包埋培养生物反应器。种类上大致有： ⑴塑料袋增殖器、⑵填充床增殖器、⑶多层板增殖器、⑷螺旋 膜增殖器； ⑸桨式搅拌反应器、 ⑹棒式搅拌反应器、 ⑺船舶推进桨搅拌反 应器、⑻倾斜桨叶搅拌反应器、⑼船帆形搅拌反应器； ⑽往复振动锥孔筛板搅拌反应器；
第三章
பைடு நூலகம்
动植物细胞培养生物反应器
动植物细胞培养：动、植物细胞在离体条件下使细胞增殖来 获得大量细胞群体的方法。 微生物、动物、植物细胞培养的异同点如下： ◆不同点： 1 在培养基上。 微生物是固体、 半固体培养基， 成分主要是水、 无机盐、生长因子、碳源、氮源等；动物用天然培养基，一般是 液体，成分主要是水、葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素、动物 血清；植物用合成培养基，一般是固体，成分主要是矿质元素、 蔗糖、纤维素、植物激素、有机添加剂。
2 各自培养的原理上的不同，微生物细胞培养的原理是微生物 细胞的增殖， 动物细胞培养的原理是细胞的增殖， 植物细胞培养 原理是细胞的全能性。 3微生物细胞培养主要是获得其代谢产物或次级代谢产物或得 到细胞本身； 植物细胞培养是获得新个体或细胞产品， 应用是快 速繁殖试管苗、细胞产品、人工种子、转基因植物的培育等。动 物细胞培养是获得大量新生细胞或细胞产品， 应用是获得细胞的 产物或细胞等。 ◆相同点：三者都需要培养基、都需要无菌操作，防止染菌、培 养时候都需要适当的温度等条件。
细胞
营养物入口 营养物出口 营养物出口
细胞 营养物质 营养物入口
a-中空纤维反应器
b-螺线式卷绕反应器
三 植物细胞反应器的选择和设计 植物细胞反应器的选择和设计需注意： 1 氧的供给 对于间歇培养， 体积溶氧系数 klα需要 10-15h-1; 2 剪切力 反应器的剪切力尽可能小； 3 细胞的黏附 细胞培养过程容易黏附在反应器壁上， 并产生 大量的泡沫， 导致细胞量和代谢产物减少， 严重时培养过程被迫 中止； 4 细胞高密度 培养时， 混合情况变差， 培养基中营养物质和 氧的供给不足，细胞收率下降； 5 温度、pH、营养物质的浓度须控制在合适的范围内。 6 罐体 不锈钢，装液系数 70%，工艺结构先进，操作简单。
除培养液中的二氧化碳和乙烯， 对细胞生长有阻碍作用； 过高的 溶氧对植物细胞合成次级代谢产物不利。
二 固定化细胞生物反应器
1 填充床生物反应器 在填充床生物反应器中，细胞可以位于 支撑物表面，也可以包埋于支撑物之中， 培养液可以流经支撑物颗粒，不断被细胞 所利用。填充床生物反应器已被用于植物 细胞的培养。 优点：单位体积固定细胞量大。 缺点：混合效果低，对必要的氧传递、pH、 温度控制和气体产物的排除造成困难，影
种环境因素的影响。 为了使动物细胞的培养处于最佳状态， 了解 环境因素对其影响无疑是很重要的， 影响动物细胞生长、 繁殖的 环境因素很多，主要有温度、PH 值、营养成分、溶氧、气体环 境、渗透压以及其他因素。 培养温度：不同细胞的最适生长温度是不尽相同的； pH 值：一般在 7.2-7.4； 4 动物细胞培养类型方法 依据在体外培养时对生长基质依赖性，动物细胞可分为两类： （1）贴壁依赖型细胞：需要附着于带适量电荷的固体或半固体 表面才能生长， 大多数动物细胞， 包括非淋巴组织细胞和许多异 倍体细胞均属于这一类。
第二节 动物细胞大规模培养反应器
一、动物细胞培养概述
1 动物细胞培养 将动物组织或细胞从机体取出，分散成单个细胞，给予必要 的生长条件，模拟体内生长环境，使其在体外继续生长和繁殖。 动物细胞大规模培养技术是指在人工条件下（设定 ph、温度、 溶氧等） ，在细胞生物反应器（bioreactor）中高密度大量培养动 物细胞用于生产生物制品的技术。 目前可大规模培养的动物细胞有鸡胚、猪肾、猴肾、地鼠肾等 多种原代细胞及人二倍体细胞等， 以及狂犬病疫苗、 口蹄疫疫苗、
响细胞的培养。同时大颗粒的低效率传质、 填充体成分供应和排除的困难，限制了填充 床反应器应用于不要求细胞活性的生物转 化。 2 流化床生物反应器 典型的流化床生物反应器是利用流体的能 量来悬浮颗粒的。 如图是流化床细胞反应器。 由于使颗粒呈流化状态所需的能量与颗粒大 小成正比，因此，通常采用小固定化颗粒， 这些小颗粒良好的传质特性是流化床反应器
2 非机械搅拌式反应器
鼓泡塔式生物反应器 非机械搅拌式反应器 气升式生物反应器 外循环
内循环
相对于传统搅拌式反应器， 非搅拌式反应器所产生的剪切力较 小，结构简单，因此被认为适合植物细胞培养，其主要类型有鼓 泡式反应器、 气升式反应器和转鼓式反应器等。 其中常用的是气 体搅拌生物反应器。气体搅拌生物反应器没有活动的搅拌装置， 在很大程度上减少了剪切力， 并能在长期操作中保持无菌。 气体 搅拌生物反应器包括鼓泡塔和气升式反应器等。 气体搅拌生物反
的主要优点。 流化床生物反应器的最大缺点是剪切和颗粒碰撞会 损坏固定化细胞。 优点：良好的传质特性； 缺点：剪切力和颗粒碰撞会损坏固定化细胞。
3 膜生物反应器 在植物细胞培养过程中， 主要采用的是中空纤维和螺线式卷绕 反应器。如图所示。膜反应器的优点是可以重复使用，因此，尽 管投资较大，仍较经济。另外，由于植物细胞代谢不像微生物那 样旺盛，因而可以采用更厚的细胞层。 采用具有一定孔径和选择透性的膜固定植物细胞。 营养物质通 过膜渗透到细胞中， 细胞产生的次级代谢产物通过膜释放到培养 液中。 优点：可以重复使用。
应器。 一种升流式生物反应器利用罐中心一根连有多孔板的杆上下 移动达到搅拌的目的， 可用于培养剪切力敏感细胞。 离心式叶轮 反应器与细胞升式反应器相比具有较高升液能力，较低剪切力， 较短混合时间， 在高浓度下具有高得多的溶解氧系数， 表明有用 于剪切力敏感的生物系统的巨大潜力。 优点：气体搅拌生物反应器结构较简单，氧传递效率高，剪切 力低，对细胞的损伤小，容易实现长期无菌培养，较适用于植物 细胞培养。 缺点： 操作弹性小， 低气速时尤其在培养后期细胞密度较高时， 混合效果较差；如果提高通气量，又会产生大量泡沫，也易于驱
第一节
植物细胞培养反应器
植物细胞培养反应器最初大多采用微生物反应器。 由于植物细 胞与微生物细胞形态结构不同， 因此微生物反应器并不完全适合 于植物细胞生长与生产。 植物细胞培养具有周期长、细胞抗剪切能力弱、易团聚、对氧 的要求相对要低得多等特点。 同时， 植物细胞规模培养的目的是 生产天然产物，而这些天然产物均为细胞此生代谢物。所以，植 物细胞培养反应器的设计， 不仅要考虑有利于细胞生长， 同时还 要考虑有利于产物的积累和分离。 总体上讲， 适合植物细胞的反 应器应该具有适宜的氧传递、良好的流动性和较低的剪切力。