报告正文

报告正文

一、研究计划要点

1、探讨Arc 与颞叶癫痫发生，Arc 与颞叶所致认知功能损害之间的关系，并对可能的信号机制进行了探讨。为进一步阐明颞叶癫痫发生基础、癫痫对认

知功能损害的机制，为进一步明确Arc 在认知功能中的作用提供新的线索和

依据。

2、应用反义寡核苷酸技术研究Arc 对癫痫形成、癫痫所致认知功能损害

的影响，为癫痫病的临床早期防治提供新的信息。

3、目前有关BDNF 在颞叶癫痫中的作用及其机制已经有大量研究报道，

但有许多问题存在很大争议。本项目通过对BDNF、TrkB 与Arc 之间相互关

系的研究，为Arc 生物学功能，也为BDNF 生物学功能研究提供参考。

4、明确岛叶的致痫性能、致痫机制及岛叶与颞叶癫痫之间的相互关系，

为建立全面、系统的岛叶癫痫概念提供理论依据。

二、执行完成情况

课题完成了Arc 在颞叶癫痫发生及认知功能损害中的作用研究。在建立了稳定的自由活动大鼠杏仁核电刺激点燃模型，较系统地研究了以杏仁核电点燃模型为主的颞叶癫痫的特征、可能的致痫机制、以及Arc在颞叶癫痫发生及认知功能损害中的作用。立足于本课题，课题组完成了癫痫研究科研平台的软硬件建设。在此过程中，培养研究生3名，目前仍有2名在读研究生正在继续此方向的研究工作。

已发表论文3篇（均标注本项目资助），均为中华系列杂志，待发表2篇，其中1篇正在退休中，英文1篇，正在审核中。较好地完成了课题任务目标。

三、研究工作的主要进展、取得的主要研究成果

（一）活性调节细胞骨架蛋白与岛叶点燃大鼠学习记忆的关系

研究目的：检测活性调节细胞骨架蛋白(Arc)在模型大鼠海马组织中的表达，探讨Arc与岛叶点燃大鼠学习记忆的关系。

研究方法：成年SD大鼠随机分为模型组、假手术组和空白对照组。应用避暗试验检测各组大鼠学习记忆功能。采用免疫组化、Western blot检测不同时间点Arc蛋白在海马组织中表达水平，运用RT-PCR检测其基因表达水平。

研究结果：慢性电点燃成功后第1天(即点燃0周)，点燃组、假手术组及空白对照组学习记忆能力差异无统计学意义(P>0.05)。点燃2周：潜伏期(LT)(48.87±3.42)s，穿梭次数(EN)(2.75±0.99)次。点燃3周：LT为(48.71±2.77)s，EN为(2.754-1.15)次。点燃2周、3周与0周相比学习记忆功能增强(P<0.05)。点燃4周与0周组比学习记忆功能明显下降(P<0.05)。Arc在各组内蛋白及基因的表达均在1h开始增加，6 h达到高峰，12 h恢复到基线水平。组间对比，2-3周内峰值最高，上升幅度明显(P<0.01)，4周峰值及幅度明显下降(P<0.05)，假手术组、空白对照组差异无统计学意义(P>0.05)。

a．正常大鼠脑电图，两通道出现平稳的a波；b．癫痫发作大鼠脑电图，出现明显的癫痈波，波幅增高增宽；c．后放阈脑电图，持续出现3 s左右高而尖的波即后发放电。

免疫组化：Arc表达（×400）。a.空白对照组；b.点燃0周组6h；c.点燃1周组6h；d.点燃2周组6h；e.点燃3周组6h；f.点燃4周组6h

ArcmRNA电泳。M：标准参照物；各组ArcmRNA的表达1：空白对照组；2：假手术组；3：点燃1h；4:点燃3h；5:点燃6h；6：点燃12h。

免疫印记。β-actin(肌动蛋白分子量：42KD，1：空白组；2：假手术组；3：点燃1h；4：点燃3h；5：点燃6h；6：点燃12h。

研究证实：岛叶电点燃大鼠学习记忆功能及Arc在海马中表达变化趋势一致。Arc与岛叶点燃大鼠学习记忆功能密切相关。

（二）k252a抑制BDNF-TrkB信号通路对电刺激大鼠Arc及癫痫发生影响研究目的：探讨BDNF - TrkB信号传导通路与杏仁核电刺激点燃大鼠Arc 表达及癫痫发生的关系。

研究方法：雄性SD大鼠随机分为空白组、假手术组、杏仁核点燃组(单纯点燃组、k252a注射组、DMSO对照组)。应用Alpha - Lab 4通道信号采集及处理系统记录大鼠脑电活动。运用免疫组化检测其Arc蛋白的表达水平，采用RT - PCR、原位杂交检测Arc mRNA在海马中表达水平。

研究结果：k252a注射组大鼠V级发作持续时间(33.00±1.41)8显著低于单纯点燃组(60.50±2.07)s、DMSO对照组(60.00±1.79)s大鼠V级发作持续时间(P＜0.01)。k252a注射组3h、6hArc阳性细胞百分率显著低于单纯点燃组、DMSO对照组3h、6hArc阳性细胞百分率(P＜0.01)，12 h时5组间Arc阳性细胞百分率相比表达差异无统计学意义(F =0.684,P＞0.05)。RT - PCR、原位杂交结果显示:k252a 注射组1h、3 h Arc mRNA表达量显著低于单纯点燃组、DMSO对照组1h、3 h Arc mRNA表达量(P＜0.01)。6h时5组间Arc mRNA相比表达差异无统计学意义(P ＞0.05)。

M：标准参照物；1：Arc mRNA；2：β肌动蛋白mRNA；A：空白组；B：单纯点燃组1h；C：单纯点燃组3h；D：单纯点燃组6h；E：k252a注射组1h；F：k252a注射组3h；G：k252a注射组6h；H：DMSO对照组1h；I：DMSO对照组3h；J：DMSO对照组6h；K：假手术组。

研究证实：k252a能够抑制BDNF - TrkB 信号传导通路对Arc表达的诱导作用，从而使癫痫发作的持续时间缩短。

（三）Arc siRNA高表达干扰载体的构建以及对靶基因的沉默评价研究目的：构建Arc siRNA高表达干扰载体并检测其干扰目的基因的效率。

研究内容：根据Arc基因序列（基因ID：54323）设计并合成4对siRNA 寡聚单链DNA序列并构建干扰载体，进行Arc全基因合成及高表达载体的构建，干扰载体和高表达载体共转染HEK293细胞，瞬时转染48小时后收集样品qPCR 检测目的基因的表达情况，通过qPCR方法检测干扰载体对靶基因的干扰效果。

研究结果：

①针对靶基因构建的四个干扰质粒分别为：

经过比对，重组克隆中插入片段序列与设计的oligo序列完全一致。

②重组克隆名称：241F-1 抗性：Amp ；质粒DNA体积：20 ul；含质粒的甘油菌液体积：300 ul；储存条件：-20°C（保存半年）。所合成的基因序列经测序验证符合要求。

③qPCR方法检测干扰载体对于靶基因的沉默效果

内参扩增曲线和熔解曲线