第7章 荧光和磷光光谱法

荧光的产生
e e
S1最低
辐荧 射光
e
S0各振动能级
e
2.1.1 产生
7.1.1 荧光的产生
7.1 荧光
7.1.2 荧光效率 7.1.4 定量关系 7.1.6 荧光仪器
7.1.3 荧光的影响因素 7.1.5 发射与激发光谱 7.1.7 实验技术与应用
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7.1.2 荧光效率
辐射跃迁概率的大小： φf＝发荧光的分子数/激发态分子总数
环境因素-- 温度：
影响非常大。磷光影响更大。 辐射跃迁与T几乎无关，非辐射随T显著增大。
荧光素钠在-80℃：φf=100% 每↑10 ℃ → φf↓3% 发光仪配有低温装置
环境因素-- pH：
对有机弱酸碱物质影响大，不同型体情况不同
有
无
无
有
环境因素-- 其他： 表面活性剂：φf ↑
第7章 荧光和磷光分析
7.1 荧光Fluorescence 7.2 磷光Phosphorescence
7.1 荧光
7.1.1 荧光的产生 7.1.3 荧光的影响因素 多重度M 7.1.5 发射与激发光谱 Mg的光谱项 7.1.7 实验技术与应用
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7.1.2 荧光效率 7.1.4 定量关系 单线态与三线态 7.1.6 荧光仪器 去活化6方式
f
kf k f ki
提高kf，降低ki 都可增强荧光
分析应用价值φf>0.1；荧光素的φf～1
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2.1.1 产生
7.1.1 荧光的产生
7.1 荧光
7.1.2 荧光效率 7.1.4 定量关系 7.1.6 荧光仪器
7.1.3 荧光的影响因素 7.1.5 发射与激发光谱 7.1.7 实验技术与应用
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7.1.3 影响因素
分子结构 （1）首要条件有吸收，含共轭双键，通常>1个
苯环增大共轭
萘φf=0.29，λf=310nm
蒽φf=0.46，λf=400nm
（2）刚性平面结构 减少振动和碰撞去活鳌合物荧光的原理
3+ pH ～ 5 ，与 Al 芴 φf＝1.0
红色荧光 联二苯 φf＝0.2
磷光镜:一种机械切光装置. 转筒式和转盘式 时间分辨技术, 去荧光
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7.2.4 仪器
快光 速源 衰散 减射 的光 荧、 光 分磷 离光
磷光仪中的2种机械切光器
7.2.4 应用
与荧光法互补 用于药物/临床/环境分析 低温法: 多环芳烃, VK, VB6, VE 固表法: 一种机械切光装置.
F
0 250 350 450 550 650
λex=257nm
⑤ 仪器实物 www.PerkinElmer.com
本系仪器简介
LS45 LS55
7.2 磷光Phosphorescence
7.2.1 产生与光强
T1－>S0 禁阻跃迁，速率小，寿命长
非辐射概率增大，导致Ip小

I p Kc
磷光：波长更长/寿命更长
7.1 荧光Fluorescence
7.1.1 产生
激发态
分子的电子能态：基态→激发态 则: 能量增加，分子的多重性可能改变
多重度M=2S+1
泡利不相容原理
S为自旋量子数的代数和 S= 1 2 1 2 0 含偶数电子的分子, 电子成对，
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单重态singlet state: 在磁场中无能级分裂
跃迁: 10-15s <分子振动周期 10-14-10-12s内，振动失活到激发态最低振动能级
(2) 荧光发射
S1→ S0 : 10-9-10-7s，发射一个光量子 能量小于吸收，驰豫损失部分
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去活化
不论开始处于哪个激发S态 最后到达S1最低振动能级
(3) 内部转换 internal conversion
检测器
与分光光度计的主要差别
① 垂直测量方式, 消除透射光影响 ② 两个单色器，激发和发射，常用光栅
光源：高发射强度。常用氙灯。
高灵敏度原因：测量I非A， 确定量子效率
提高激发光强度，现代技术测弱光信号
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试样室：
四面光石英池 固体试样架
四 面 光 比 色 皿
色散系统：光栅
滂铬 BBR
（3）给/吸电子基增/减荧光
典型给电子基团： -NH2、 -OH
n-π共轭, 但成盐荧光大减
苯：
10
苯酚： 18
苯甲酸
相对荧光强度 3
酚离子：10
苯胺： 20
苯胺离子：0
硝基苯
0
典型吸电子基团： >C=O 、-NO2
增系间窜跃，磷光会增强
（4）卤素重原子效应荧光大减
物质 相对I
苯 10
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7.1.4 定量关系
A lg( I 0 I )
即
I I 0 10
2 3
A
泰勒级数展开 x e x 1 x x x ... 1 x
x 1 e
吸收的强度
2!
3!
I f f I a f (I0 I ) f I 0 (110 )
相同多重态间的无辐射跃迁(S1与S2振动能级有重叠时) 10-13-10-11s
(4) 体系间跨越 intersystem corssing
不同多重态间的无辐射跃迁: S1→ T1 10-2-10-6s，自旋反转
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去活化 (5) 磷光发射
T1最低振动能级→ S0时产生磷光辐射 10-2-10s，寿命长多了！能量更低！
Mg的基态与第一激发态

3p 3s
1 2
1 2
1 2

1 2
1 2
1 2
基态
1st激发态
改 变 自 旋 禁 阻 磷 光
/ /
2S+1=1
2S+1=1
2S+1=3
3 S0
1
3 P1
2 S 1
1
3 P2 3 P1 3 P0
LJ
3
3
3
光 谱 项 n
去活化6种方式 (1) 振动驰豫 vibrational relaxation
7.1.2 荧光效率 7.1.4 定量关系 7.1.6 荧光仪器
7.1.3 荧光的影响因素 7.1.5 发射与激发光谱 7.1.7 实验技术与应用
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7.1.5 激发光谱与发射光谱
本质：吸收光谱 变入射光波长，荧光最强处测 If 本质：荧光发射光谱 固定激发光，测 If～t 关系
4 mg/L 2 mg/L
F
50
1000 800 600 400 200
4 mg/L 2 mg/L
0 苯丙氨酸 phe，λex=257nm， 250 270 290 310 330 350 λ /nm n=1,2处有峰， 1200 强度不随浓度变化 n=2
1000 800 600 400 200 0 450 500 550 λ /nm 600 650
A
入射的
出射的
A=kbc
I f 2.30 f I0 A 2.30 f I0kbc Kc
I f Kc
通常
泰勒级数展开，仅取一项，
x越小越符合
A<0.05
If
If与A 的关系 A与c正比，低浓度
0 0 0.1 A 0.2 0.3
2.1.1 产生
7.1.1 荧光的产生
7.1 荧光
1 2
Mg的S0/ S1/ T1态
1 2
1 2 1 2 1 2

1 2
2S+1=1
基态
2S+1=1
1st激发态
2S+1=3
J有2S+1个取值:(L+S),(L+S-1),…,(|L-S|) 0 (用S表示) 0 1(用P表示) 1 1 2, 1, 0
L= J=
单线态与三线态 单：荧光/三：磷光
激发态
单重态基态S0
辐吸 射收
单重态基态S0 激发后 S/T两态
泡利不相容原理 S= 1 2 1 2 1 辐吸 射收
通常自旋不变 激发态S1/ S2
自旋改变 激发态T1/T2
Hund 规 则
M=2S+1 3 平行自旋 能量更低 三重态triplet state
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单线态与三线态
③ 应用
无机物：已有～70种元素可分析。 鳌合物法：Be Al B Ga Se Mg
与荧光物质缔合猝灭法：F S Fe Ag
催化荧光法：Cu Be Fe Os H2O2
有机物：
简单有机物与其他有机试剂作用后产生荧光
芳族通常可直接测定
200
④ 荧光干扰峰 倍频峰
150 n=1 100
在激发波长λex的n倍处有荧光发射光谱
本质： 不同轨道的能量差
固定波长差，简化荧光光谱，提高选择性。 酪氨酸和色氨酸：荧光光谱严重重叠 同步荧光 普通荧光
Δλ<15nm, 仅显示酪氨酸光谱
Δλ >60nm, 则显示色氨酸光谱 激发
发射
k /(103 mg-1 L)
5 4 3 2 1 0 260 310 360 λ /nm 410 460 phe tyr try
用于选择条件，可组成两维光谱
2.1.1 产生
7.1.1 荧光的产生
7.1 荧光
7.1.2 荧光效率 7.1.4 定量关系 7.1.6 荧光仪器
7.1.3 荧光的影响因素 7.1.5 发射与激发光谱 7.1.7 实验技术与应用
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7.1.6 荧光仪
光源
单色器1
放大 与 记录
样品池
单色器2 垂直方向
第一单色器选激发光波长 第二单色器选荧光波长
7.1.7 实验技术与应用 Th 0.01μg
① 时间分辨技术, 各发光体的发光衰减速率不同
光谱重叠，发光寿命不同的组分可分辨与测定。 对门控时间扫描，测If～t，测定荧光寿命。 根据不同发光体形成速率，消除干扰。
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② 同步扫描技术
7.2.2 温度影响
室温下，T1分子与溶剂碰撞失活，几乎无磷光
液氮中，强荧光。低温磷光分析 室温磷光
胶束稳定 磷光基团结合入表面活性剂胶束中 固体表面 滤纸/硅胶/氧化铝/淀粉 敏化溶液 待测物D*的能量转给受体
7.2.2 温度影响
室温磷光
胶束稳定
S1
体系间跨 吸收激发 能量 磷 光 转 产生 移 跃 A* D*→ S →A+hv → A*T
氟苯 10
氯苯 溴苯 7 5
碘苯 0
重原子效应
环境因素-- 溶剂
激发态比基态极性大
溶剂极性增，则荧光红移并增强
8-羟基喹啉 溶剂的影响
奎宁在苯:乙醇:水＝1:30:1000 溶剂 介电常数 CCl4 2.24 CHCl3 5.2 CH3CN 38.8 λf/nm φf 390 0.002 398 0.041 410 0.064
自熄：浓度高时，激发态之间相互碰撞 自吸：荧光与吸收曲线重叠，又被基态分子吸收
这点也要求荧光测量：
低浓度！
2.1.1 产生
7.1.1 荧光的产生
7.1 荧光
7.1.2 荧光效率 7.1.4 定量关系 7.1.6 荧光仪器
7.1.3 荧光的影响因素 7.1.5 发射与激发光谱 7.1.7 实验技术与应用
分子中引入重原子 internal heavy-atom effect
称为(内外部)重原子效应 高核电荷使电子能级复杂， 电子自旋-规定耦合作用加强 S1－>T1增加 顺磁性物质，氧等
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7.2.4 仪器
与荧光仪一体化 试用室:试样池放在液氮杜瓦瓶内
固体表面磷光需特制试样室
1 1
固体表面
敏化溶液室温磷光
e A的选择： 受体
e T1 e T1 (1)在供体激发波长范围内，摩尔吸光系数较低
(2)T1能量略低于供体D的T1 S0 (3)量子产率大。常用有1,4-二溴萘
e
S0 合适的受体A
待测物D是能量供体 09:41:16
7.2.3 重原子效应
提高Ip:
用含重原子的溶剂(碘乙烷)
Mg的基态与第一激发态

3p 3s
1 2
1 2
1 2

1 2
1 2
1 2
基态
1st激发态
2S+1=1
2S+1=1
2S+1=3
内量子数J有2S+1个取值
(L+S),(L+S-1),…,(|L-S|)
好 单线态与三线态 S= 1 2 1 2 0 多 S ， 意 义 都 不 同
3p 3s
溶解氧(增大系间跨跃)：φf ↓
Βιβλιοθήκη Baidu
猝灭效应
(1)碰撞猝灭及能量转移：
主要是外部转换热效应 溶剂或溶质分子间发生物理或化学作用导致 荧光强度下降。
与熄灭剂碰撞：M* +Q →M+Q+热
激发熄灭剂： M* +Q →M+Q* 粘度大 ↓效应，利于荧光 度高 ↑效应，不利荧光 温
(2)氧熄灭 顺磁性氧分子，促系间跨跃成三重态 (3) 自熄灭/自吸收
室 温 无 磷 光
(6) 外部转换 external conversion
激发态分子和溶剂等能量转换 荧光/磷光 消失，称熄灭或猝灭
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去活化示意图
09:41:15
去活化演示 驰豫 吸收
e e
e
09:41:15
e
去活化演示 内部转换 荧光
e e
e
09:41:15
过程
吸收激发
内振 部动 转驰 换豫
多环芳烃, 杂环化合物