体外细胞培养的基本方法和技术

克隆培养法最基本的要求是拟用于培养并 分裂增殖的祖细胞必须是一个细胞，如此 才能获得具有同一祖先的子细胞。
能够进行克隆培养的细胞一般只是一些活 力强、增殖能力强、对体外生长环境适应 性强的细胞。
八、微载体细胞培养法
微载体细胞培养法是一种是用于培养贴壁 依赖性细胞的大规模培养技术。
这种培养技术是在培养容器内加入培养液 及一种用对细胞无害的材料制成的颗粒 （微载体），使细胞在微载体表面覆着和 生长，通过不断的搅拌使微载体保持悬浮 状态的培养方法。
培养液中大量的微载体为细胞提供了极大 的生长表面，从而在培养容器体积不很大 的情况下，可培养大量的细胞。
第二节 原代培养
原代培养：从直接取自生物体细胞、组织 或器官开始的培养。 原代培养也叫初代培养，是从供体取得细 胞后在体外进行的第一次培养。 原代培养是建立各种细胞系的第一步，是 从事组织培养工作人员应熟悉和掌握的最 基增殖而产生一个子细胞群的过程。
克隆培养法也可以称作为单细胞分离培养法， 就是从细胞悬浮液中获得的单个细胞用于培 养，使之分裂增殖而产生一个细胞群的方法。
克隆培养不同于普通的原代培养或传代培 养，他强调培养产物的单一性而排除异质 性，所获得的培养产物为遗传特性几乎完 全相同的纯细胞系即细胞株。
所谓旋转管培养法，就是将所培养的组织 细胞接种在一管状培养器皿，再将旋转管 固定在一个可旋转的装置上边旋转边培养 的一种培养方法。
旋转管培养法的最大优点，随着旋转管的 转动，所培养的组织细胞浆交替接触到培 养液和气体环境。有利于培养物的生长。
五、培养板培养法
培养板培养法过去曾被称为微量培养法，是 现代体外培养技术中最为普遍应用的常规培 养方法之一。
二倍体细胞培养法并不是一种专门的培养技术
细胞内遗传物质基础不发生变化是细胞性状稳 定的前提，稳定培养条件、减少传代次数是二 倍体细胞培养的主要原则。
培养成功的二倍体细胞最好尽快用于其他的实 验或者尽量进行冷冻保存。
七、克隆培养法
克隆（clone)一词作为名词时是指同一个祖 细胞分裂增生而来的一个细胞群，体外细胞 培养技术中常用的细胞克隆即为此意。
按照培养过程中培养物是否需要分割 后再培养，而将体外培养分为原代培 养或称为初代培养和继代培养或传代 培养两大类。
第一节 细胞培养的基本方法
一、悬滴培养法 是最早的经典细胞培养方法： 将组织接种在一张盖玻片上，加上一滴 培养液，反转盖破片使组织细胞及营养 液悬挂在盖破片表面，置盖片于一凹在 片之上，用熔蜡密封后入培养箱中培养。
取材：用颈椎脱位法使孕鼠迅速死亡。将 整个孕鼠浸入盛有75％乙醇的烧杯中数秒 钟消毒，取出后放在大平皿中。 用消过毒的剪刀在躯干中部环行剪开皮肤， 剖腹取出子宫置于无菌平皿中。用消过毒 的剪刀剪开子宫，取出鼠胎，剪去头、爪， 以平衡盐溶液洗去血污。
切割：用平衡盐溶液将取出的组织块清 洗三次，然后用眼科手术剪刀仔细将组 织反复剪碎，直到成1mm3左右的小块， 再用平衡盐溶液清洗，洗到组织块发白 为止。静置数分钟，使组织块自然沉淀 到管底，弃去上清
所培养的生物成分无外乎有两种结构形式，
一种是小块组织或称为组织块
另一种将生物组织分散后制成的单个细胞。 由组织分散后制成的单个细胞一般称为分 离的细胞或分散的细胞。
分散的过程通常在培养液或平衡盐溶液中 进行，分散的细胞被悬浮于培养液或平衡 盐溶液中。
单个细胞分散在培养液、平衡盐溶液或缓 冲液中成为细胞悬液。
原代培养的概念包括以下几个方面含义： ①原代培养的实质就是初次培养，即培养物 一经接种到培养皿中就不再分割，任其生长 繁殖而不更换培养物的生长器皿。 ②原代培养中的“代”并不是指细胞的“代” 数 原代培养物中的细胞接种后不一定没有分裂。 ③原代培养过程中不分割培养物不等于不更 换培养液，也不等于不更换培养器皿。
二、培养瓶培养法
培养总是一个与无菌息息相关的概念。
要保证所培养的对象处于一种与“菌”隔 离的环境，早期的培养瓶主要是玻璃培养 瓶，目前已发展出主要用于一次行使用的 塑料培养瓶。
培养瓶具有适合细胞贴壁生长又适合用显 微镜进行观察的扁平形状。
所谓培养瓶培养法，就是将拟培养对象直 接接种到在培养瓶内载入培养性进行培养 的方法。
原代细胞培养原理： 细胞培养是模拟机体内生理条件，将细胞从机 体中取出，在人工条件下使其生存、生长、繁 殖和传代，进行细胞生命过程、细胞癌变、细 胞工程等问题的研究。
原代培养细胞离体时间短，性状与体内相似， 适用于研究。
幼稚状态的组织和细胞，如：动物的胚胎、幼 仔的脏器等更容易进行原代培养
原代细胞培养操作（鼠胎组织细胞培养为例）：
它将培养的细胞接种在培养板的孔内，然后 在二氧化碳培养箱中培养的一培养方法
培养板的规格有6孔培养板、12孔培养板、 96孔培养板。
培养板培养法较为规范，培养板一般都是一 次性使用培养板。
不同规格的培养板
六、二倍体细胞培养法
二倍体细胞培养法就是能够始终维持培养细胞 的染色体倍数恒定为二倍体的方法。
体外培养的结果无外乎有两种：
一是维持生存，一是发生显著增长。
如果只是维持生存，培养物不发生明显的 量的变化，培养过程可以一直维持至培养 物死亡。
如果是后一种情况，培养物的体积不断扩 大，培养过程持续到一定的时候，原先的 培养器皿已不能满足培养物的空间的要求
这就需要将培养物分成若干小部分， 继续培养。
各种不同规格的培养瓶
三、盖玻片培养法
盖玻片培养法并不是一种专门的培养方法 或技术，它主要还是以培养瓶、皿为基础， 盖玻片只是给培养物提供了部分专门的生 长表面。
所谓盖玻片培养法，就是以盖玻片为生长 表面，将拟培养的组织、细胞接种在其上， 然后再一起放入培养瓶中继续进行培养的 方法。
四、旋转管培养法
第二章 体外细胞培养的基本方法和技术
体外培养就是将活的生物体结构成分或者 获得微小个体放到体外环境中让其生存和 生长的技术。
为了实现这一目的，必须给生物成分创造 一适合于它生长的环境。
对于部分培养来说，将活的生物成分置于 体外环境之中使其生长为体外培养，具体 操作时面临的第一个问题就是从体内取出 什么样的生物成分放到体外环境中让其生 长。