微生物的实验室培养(公开课)

3.高压蒸汽灭菌 100KPa、121℃、15～30min；加压 是为了提高温度，达到灭菌的目的。因 此必须当灭菌锅内的冷空气完全排尽后， 再将锅关闭，继续加热。适用于培养基 灭菌。 4.其他灭菌方法：紫外线、超声波、微波、化学药物 灭菌等。 附：实验室的消毒与灭菌 对接种室、接种箱、 超净工作台喷洒适量的石 炭酸或煤酚皂溶液等消毒 液后，用紫外线照射30min。
4. 试管、培养皿、锥形瓶等 5. 消毒、灭菌设备：酒精灯、干热灭菌箱、高压蒸汽 灭菌锅等。 6. 无菌实验室、超净工作台等
无菌技术
一、概念
泛指在分离、接种和培养微生物的操作中，所有 防止其他微生物污染的方法。是成功地培养微生物的 关键。
二、范围
1.对实验操作空间、操作者衣着和手进行清洁和消毒。 2.对培养器皿、接种用具、培养基等进行灭菌。 3.在酒精灯旁操作 4.已灭菌的材料与周围的物品分开。
4.紫外线（260nm）消毒法 抑制DNA的复制；产生臭氧，辅助杀菌。适用于空 气及物体表面消毒或灭菌。 （二）灭菌：强烈的理化方法，杀死所有微生物（包 括芽孢、孢子）
1.灼烧灭菌 在酒精灯火焰（200℃以上） 上灼烧，灭菌简捷可靠。适用于 接种环、接种针、接种钩等金属 用具以及试管口、三角瓶口灭菌 2.干热灭菌 干热灭菌箱内160～170℃ 1～2 小时，适用于耐高温、需保持干燥的 物品（吸管、培养皿）和金属用具等。
三、种类 （一）按物理性质分 种类 是否含凝固剂 固体培养基
用途 分离、计数、鉴定 观察运动、鉴定菌种 工业生产
1.5%-2.5%
0.2%-0.7% 否
半固体培养基 液体培养基
固体培养基：菌落
半固体培养基：运动
液体培养基：生长
（二）按化学成分
种类 天然培养基 合成培养基 化学成分 不明确 明确 用途 工业大规模生产 分类、鉴定
专题
2
微生物的培养与应用
微生物的类群
原核:
细菌、放线菌、支原体、蓝藻等
原生 生物 显微藻类：衣藻、小球藻等
微 生 物
真核
原生动物：草履虫、变形虫等
真菌： 酵母菌、霉菌等 非细胞类： 病毒、类病毒、朊病毒等
微生物的特性
①种类多；②分布广；③易培养；④个体微小； ⑤结构简单；⑥繁殖快；⑦代谢强；⑧易变异。
3.种类： 维生素、氨基酸、嘌呤及嘧啶三大类 4.来源： 酵母膏、蛋白胨、动植物组织提取液等 注一：自养微生物和某些异养微生物（如大肠杆菌） 不需要外源生长因子也能生长。 注二：对微生物生长所需生长因子的本质不了解时， 通常在培养基中加入酵母浸膏、牛肉膏及动植物组 织提取液等天然物质。 注三：最常用的碳源是糖类，尤其是葡萄糖。 注四：最常用的氮源是铵盐、硝酸盐。 注五：含C、H、O、N的有机物是异养型微生物的 碳源、氮源、能源
细菌的形态
（一）球菌
肺炎双球菌 金黄色葡萄球菌 乳酸链球菌
（二）杆菌
大肠杆菌
苏云金芽孢杆菌
枯草芽孢杆菌
（三）螺旋菌
霍乱弧菌 幽门螺旋菌 齿垢密螺旋体
细菌的芽孢
有些细菌在一定的条件下，细胞里面形成一个椭 圆形的休眠体（不是繁殖体），叫做芽孢。 芽孢的壁很厚，含水量极低，抗逆性极强（对干 旱、低温、高温等恶劣的环境有很强的抵抗力）。 环境适宜时，芽孢可以萌发，形成一个细菌。
空气中存在有大量的微生物，而接种灯的火焰 旁能形成一个无菌区域，在这里操作，可以避免杂 菌污染
例题：消毒和灭菌是两个不同的概念，下列哪些事物适 用于消毒处理( B ) ①皮肤 ②饮用水 ③牛奶 ④注射器 ⑤培养皿 ⑥接种环 ⑦培养基 ⑧果汁 ⑨酱油 ⑩手术刀 A． ④⑤⑥⑦⑩ B．①②③⑧⑨ C．①②③④⑤⑥⑧ D．以上全部
问题讨论
3.在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总 是从上一次划线的末端开始划线？ 划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要 少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数 目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由 单个细菌繁殖而来的菌落。 4.平板划线时不能划破培养基的原因？
一旦划破，会造成划线不均匀，难以达到分离单菌
精灯火焰周围等等。
培养基
2.功能 （1）参与酶的组成； （2）调节并维持细胞的渗透压； （3）调节PH的平衡。 （四）水 （1）良好溶剂，参与物质运输； （2）参与细胞内一系列化学反应； （3）酶催化的介质。
（五）生长因子
1.概念：微生物生长所必需的、微量的、自身不能 合成或合成很少的有机物。 2.作用： 酶和核酸的组成成分
②刚果红培 养基鉴别纤 维素分解菌
四、制备牛肉膏蛋白胨固体培养基
1.计算：依配方计算100mL培养基所需各成分的用量。
2.称量：玻璃棒挑取牛肉膏于称量纸上称取。 注：牛肉膏、蛋白胨易吸潮，要快、加盖。 牛肉膏黏稠，保证粘附在称量纸上 的牛肉膏也溶于水中，减少误差 3.溶化： 防止琼脂糊底而 、少量水加入烧杯→加热溶 作为凝固剂 牛肉膏、称量纸 导致烧杯破裂 解→取纸→蛋白胨、NaCl→搅拌溶解→冷却调pH→ 琼脂→搅拌熔化→补水至100mL
讨论:1．在高压蒸汽灭菌开始以前，为什么要将灭菌锅 内的冷空气排尽？ 在高压蒸汽灭菌以前，如果高压蒸汽灭菌锅内的 冷空气没有排尽，当压力上升到 100 kPa时，锅内的温 度就不会上升到应有的高度，导致灭菌不彻底。 2．灭菌完毕以后，如果压力未降到0就打开排气阀，会 出现什么现象？为什么？ 如果压力未降到零就打开排气阀，试管内的培 养基就会冲出管口。这是因为高压蒸汽灭菌锅内外 压力不平衡的缘故 3．接种操作为什么一定要在火焰旁边进行？
细菌芽孢的结构模式图
菌
落
菌落由单个细菌（或其他微生物）细胞或少数同 种细胞在适宜固体培养基表面或内部生长繁殖到一定 程度，形成肉眼可见的子细胞群落。 菌落具有大小、形状、光泽度、颜色、透明度等 基本特征。 菌落是鉴定菌种的重要依据。
病毒的繁殖
吸附 注入 合成
释放
组装
噬菌斑即噬菌体侵染细菌细胞，导 致寄主细胞溶解死亡，因而在琼脂培养 基表面形成的肉眼可见的透明小圆斑 （“负菌落”）。 在适当条件下，一个噬菌体形成一 个噬菌斑。
问题讨论
1.培养基灭菌后，需要冷却到50 ℃左右时，才能用 来倒平板。你用什么办法来估计培养基的温度？ 答：用手触摸锥形瓶，感觉刚刚不烫手时。 2.为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？ 答：灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。 3.平板冷凝后，为什么要将平板倒置？ 答：既可以防止培养基表面的水分过快挥发，又可以 防止皿盖上的水珠落入培养基，影响微生物的生长。 4.在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖 与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？ 为什么？ 答：最好不要用。因为空气中的微生物可能在此滋生。
二、稀释涂布平板法：
1、梯度稀释菌液：
微量移 液器
1ml
1ml
1ml
源自文库
1ml
1ml
1ml
101
102
103
104
105
106
菌液
6支试管，分别加入9ml无菌水
二、稀释涂布平板法：
1、梯度稀释菌液：
稀 释 103 倍
2、涂布平板：
浸 滴
稀 释 104 倍 稀 释 105 倍
灼
不超过0.1ml 各梯度分别涂布3个平板 1个不涂布作空白对照
涂
二、稀释涂布平板法：
1、梯度稀释菌液：
稀 释 103 倍
2、涂布平板：
稀 释 104 倍 稀 释 105 倍
问题讨论
涂布平板的所有操作都应在火焰附近进行。结合 平板划线与系列稀释的无菌操作要求，想一想，第2步 应如何进行无菌操作？
应从操作的各个细节保证“无菌”。例如，酒精灯与培养 皿的距离要合适、吸管头不要接触任何其他物体、吸管要在酒
问题讨论
①溶化时为什么要将牛肉膏连同称量纸一起加热? 可保证粘附在称量纸上的牛肉膏也能溶于水中, 减少误差 ②加琼脂的目的是什么?为什么要用玻璃棒搅拌？ 作为凝固剂；防止琼脂糊底导致烧杯破裂。 ③在灭菌前, 用牛皮纸、旧报纸包紧盛有培养基的 锥形瓶的目的是什么？ 在灭菌时能避免水蒸汽凝结时浸湿棉塞,在取出培养 基锥形瓶时也起到隔绝空气中杂菌污染的作用 ④培养皿能否用高压蒸汽灭菌？ 不能,因为培养皿要保持干燥,应该用干热灭菌.
三、消毒、灭菌
（一）消毒：较为温和理化方法，杀死部分有害菌体 （不包括芽孢、孢子）
1.巴氏消毒法 70℃～75℃煮30min或在85℃煮15min；杀灭非芽 孢致病菌，不破坏物料原风味；适用于对牛奶、啤酒 等消毒。 2.煮沸消毒法 在100℃煮沸5 ～6min可以杀死微生物细胞和部分芽孢。 3.化学药物消毒法 ①酒精消毒：使细胞脱水、蛋白质变性。 ②氯气消毒：氯气溶于水形成盐酸和次氯酸，次氯酸 可放出新生态的氧，从而杀死细胞。 ③其他：升汞、高锰酸钾、臭氧、甲酚皂、醋酸等等。
一、概念： 营养物质 的不同需求，配制 人们按照微生物对__________ 出供其 生长繁殖 的营养基质叫培养基 二、基本成分 （一）碳源 ①无机碳源： CO2、HCO3 等，适于自养生物。 ②有机碳源： 葡萄糖、牛肉膏、蛋白胨等，适于异养生物。 （二）氮源 ①无机氮源： N2、NH4＋、NH3、NO3-等 ②有机氮源： 牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、尿素等 （三）无机盐 1.种类：KH2PO4、K2HPO4、（NH4）2SO4、MgSO4、CaCl2、 Ca(NO3)2、NaCl、FeSO4等。
纯化大肠杆菌
最常用的是平板划线法和稀释涂布平板法
微生物的接种技术还包括斜面接种、穿刺接种 等方法。虽然这些技术和操作方法各不相同，但是， 其核心都是要防止杂菌污染，保证培养物纯度。
一、平板划线操作：
一、平板划线操作：
问题讨论
1、为什么在操作的第一步以及每次划线之前都 要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧 接种环吗？为什么？ ①操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环 上可能存在的微生物污染培养物 ②杀死上次残留的菌种，保证使下一次划线时， 菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线 次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少， 以便得到菌落。 ③及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污 染环境和感染操作者。 2、在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进 行划线？ 以免接种环温度太高，杀死菌种。
落的目的；存留在划破处的单个细胞无法形成规矩的菌
落，菌落会沿着划破处生长，会形成一个条状的菌落。
例：有关平板划线操作正确的是
（ C ）
A．打开含菌种的试管需要通过火焰灭菌，取出 菌种后需要马上塞上棉塞 B．使用已灭菌的接种环、培养皿，操作过程中 不再灭菌 C．最后将平板倒置，放入恒温箱中培养 D．将沾有菌种的接种环迅速伸入平板内，划三 至五条平行线即可
4.灭菌：培养基装入锥形瓶，加棉塞，包牛皮纸扎 紧，高压蒸汽灭菌；培养皿5～8套作一包，放于干 热灭菌箱内灭菌。 灭菌时避免水蒸气浸湿棉 塞，取出培养基时，也起 5.倒平板 培养基冷却至约50℃左右时
到隔绝空气中杂菌的作用
防止污染和挥发
①左手拔 出棉塞 ③倒入培 养基盖盖
②灼烧灭菌
④冷却倒置
6.无菌检查： 37℃倒置培养24～48h，观察是否有 微生物生长。
原理
加入相 应特殊 营养物 质或化 学物质 加入某 种特殊 的化学 物质
用途
从众多 微生物 中分离 所需的 微生物
举例
①加入青霉素分离 酵母菌和霉菌②缺 氮培养基分离固氮 菌③高浓度食盐的 培养基分离金黄色 葡萄球菌④无碳培 养基分离自养型微 生物
2. 选 择培 养基
3. 鉴 别培 养基
鉴别不 ①伊红和美 同种类 蓝培养基鉴 微生物 别大肠杆菌
课题
1
微生物的实验室培养
1. 接种工具： ① 接种针：直线状，多用于固体培养基穿刺接种。 ② 接种环：环状，常用于细菌和酵母菌的斜面、平板 接种。 ③ 接种钩：直角状，多用于霉菌和放线菌的接种。
接种针、钩、环
平板
斜面
2. 涂布器：多用于菌种的分离或微生物平板活菌计 数时涂布。 3. 吸管：0.1、0.2、0.5、1、5、10mL等移液管，常 用于液体接种及菌悬液系列稀释。
（三）按培养基的功能（用途） 1.基础培养基 （1）成分：一般微生物生长繁殖所需要的基本物质 （2）常用类型：牛肉膏蛋白胨培养基（20.0g琼脂）
种类
制备方法
依据某些微 生物的特殊 营养需求或 对某些物质 的敏感性 依据微生物 的代谢产物 与特殊化学 物质发生特 定的反应， 产生明显的 特征变化。