Gateway技术——克隆表达新方法

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(2)混合包含目的基因的入门克隆和合适的目的载体以及 Gateway LR Clonase酶,构建表达克隆
BP和LR反应示意图
BP反应
LR反应
反应特点:
入门载体的构建
(1)限制性内切酶消化和连接进入入门载体
(2)PCR克隆(定向TOPO克隆至入门载体 或与供载体B×P重组)
PCR定向TOPO克隆
引物设计:
1通用引物 :
attB1 adapter: 5’-GGGGACA AGT TTGTACAAA AAAGCAGGCT -3’ attB2 adapter: 5’-GGGGAC CACTTTGTACAAGAA AGCTGGGT -3’
2含部分接头的基因特异性引物 : attB1+gene forward: 5’-AA AAA GCA GGC TNN - template-specific
LR重组反应
Components Entry clone (50-150ng)
Sample 1-7 ul
Destination vector (150 ng/ul) 1 ul
5X LR Clonase enzyme mix
2 ul
TE Buffer, pH 8.0
to 10 ul
25℃温浴1-16h。终止反应后,最后取1-5ul BP反应液转化大肠杆菌
整合后的附着位点为 attL(BOP’) attRwk.baidu.comPOB’) 整合位点---attB attP
切除位点---attL attR 整合过程需要Int和IHF
共同作用
attB x attP →attL x attR
完成构建Gateway表达克隆仅需两步
(1)创建入门克隆,通过PCR或传统的克隆方法将目的基因 克隆进入门载体。
Gateway技术特点:
通过去除冗长的亚克隆步骤节省操作时间,同时将目的 基因转移到多个表达系统,在任何选择的表达系统如细菌, 酵母,昆虫,或哺乳动物进行基因的分析表达。
Gateway技术的灵活性:
Gateway技术的原理
Gateway的原理也是建立在噬菌体DNA定点整合到细菌宿 主基因组上。在噬菌体和细菌的整合因子(INF、Int)的 作用下,lambda的attP位点和大肠杆菌基因组的attB位点 可以发生定点重组,lambda噬菌体DNA整合到大肠杆菌 的基因组DNA中,两侧产生两个新位点:attL和attR。这 是一个可逆的过程,如果在一个噬菌体编码蛋白Xis和IHF、 Int的共同介导下这两个新位点可以再次重组回复为attB和 attP位点,噬菌体从细菌基因组上裂解下来。这一过程的 方向是受控于两个重要因素:存在的介导蛋白和重组位点。
3:PCR产物的纯化
4:BP重组反应
BP重组反应
Components attB-PCR product (>10ng)
Sample 1-7ul
pENTR vector (150 ng/ul)
1ul
5X BP Clonase Clonase enzyme mix 2ul
TE Buffer, pH 8.0
挑取阳性克隆,进行PCR或验证,然后抽提质粒 ,酶切验证。
Gateway技术的评价
一旦构建好Gateway入门克隆,蛋白表达和分析的大门就 会向您敞开。使用Gateway技术,您可以进入到几乎是无 数种的表达系统。因为没有一个单一的表达系统适合于每 一种蛋白,优化基因表达的最好方法是在多个系统中分析 您的蛋白 Invitrogen 已将Gateway技术合并到部分最高级的表达系 统中。无论选择哪个系统――体外,细菌,酵母,昆虫, 或哺乳动物――都可以获得Gateway目的载体。此外,你 可以很容易地把最称手的表达载体转换成Gateway目的载 体
to 10ul
25℃温浴1-16h。随着时间的延长,可有效增加克隆,但时间不宜超
, 过18h 终止反应后,最后取1-5ul BP反应液转化大肠杆菌。挑取阳
性克隆,进行PCR或验证,然后抽提质粒 ,酶切验证。
LR重组装入表达载体
根据自己实验目的,了解自己将要装入的载体的结构,原核表达,超 表达,抑制表达、特异表达、GUS/GFP表达等载体,
sequences-3’ attB2+gene reverse: 5’-A GAA AGC TGG GTN - template-specific
sequences-3’
BP重组装入入门载体
1:添加attB接头的PCR 以携带目的基因质粒为模板 ,加含部分接头的基
因特异性引物,进行第一轮PCR 2 :取第一轮的PCR产物做模板,加入通用引物,进行第二轮
PCR定向TOPO克隆流程
一:实验前的准备
1:认真阅读INVITROGEN公司的GATEWAY-MANUAL
2;在实验操作前,先要确保你的基因使用高保真的Taq酶克隆经过验证, 装入T载体中
3:入门载体质粒和目标表达载体质粒的抽提。质粒的浓度要求比较高,
150ng/ul.
4:引物设计。根据入门载体序列的特点,设计通用引物 和含部分接头的 基因特异性引物
Gateway技术 克隆、表达新方法
Gateway技术
Gateway技术:
一种克隆操作平台:把目的基因克隆到入门载体(Entry Vector)后,就不用依赖限制性内切酶,而靠载体上存在 的特定重组位点和重组酶,高效、快速地将目的基因克隆 到其它的受体载体(Destination Vector,目的载体)上。
Gateway表达载体的转换
连接多个片段到表达载体
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