Gateway技术-克隆、表达新方法.ppt

引物设计：
1通用引物 ：
attB1 adapter: 5’-GGGGACA AGT TTGTACAAA AAAGCAGGCT -3’ attB2 adapter: 5’-GGGGAC CACTTTGTACAAGAA AGCTGGGT -3’
2含部分接头的基因特异性引物 ： attB1+gene forward: 5’-AA AAA GCA GGC TNN - template-specific
整合后的附着位点为 attL（BOP’） attR（POB’） 整合位点---attB attP
切除位点---attL attR 整合过程需要Int和IHF
共同作用
attB x attP →attL x attR
完成构建Gateway表达克隆仅需两步
（1）创建入门克隆,通过PCR或传统的克隆方法将目的基因 克隆进入门载体。
挑取阳性克隆，进行PCR或验证，然后抽提质粒 ，酶切验证。
Gateway技术的评价
一旦构建好Gateway入门克隆，蛋白表达和分析的大门就 会向您敞开。使用Gateway技术，您可以进入到几乎是无 数种的表达系统。因为没有一个单一的表达系统适合于每 一种蛋白，优化基因表达的最好方法是在多个系统中分析 您的蛋白 Invitrogen 已将Gateway技术合并到部分最高级的表达系 统中。无论选择哪个系统――体外，细菌，酵母，昆虫， 或哺乳动物――都可以获得Gateway目的载体。此外，你 可以很容易地把最称手的表达载体转换成Gateway目的载 体
Gateway表达载体的转换
连接多个片段到表达载体
（2）混合包含目的基因的入门克隆和合适的目的载体以及 Gateway LR Clonase酶，构建表达克隆
BP和LR反应示意图
BP反应
LR反应
反应特点:
入门载体的构建
（1）限制性内切酶消化和连接进入入门载体
（2）PCR克隆（定向TOPO克隆至入门载体 或与供载体B×P重组）
PCR定向TOPO克隆
sequences-3’ attB2+gene reverse: 5’-A GAA AGC TGG GTN - template-specific
sequences-3’
BP重组装入入门载体
1:添加attB接头的PCR 以携带目的基因质粒为模板 ，加含部分接头的基
因特异性引物,进行第一轮PCR 2 :取第一轮的PCR产物做模板，加入通用引物，进行第二轮
PCR定向TOPO克隆流程
一：实验前的准备
1：认真阅读INVITROGEN公司的GATEWAY-MANUAL
2;在实验操作前，先要确保你的基因使用高保真的Taq酶克隆经过验证， 装入T载体中
3:入门载体质粒和目标表达载体质粒的抽提。质粒的浓度要求比较高，
150ng/ul.
4:引物设计。根据入门载体序列的特点，设计通用引物 和含部分接头的 基因特异性引物
Gateway技术 克隆、表达新方法
Gateway技术
Gateway技术：
一种克隆操作平台：把目的基因克隆到入门载体（Entry Vector）后，就不用依赖限制性内切酶，而靠载体上存在 的特定重组位点和重组酶，高效、快速地将目的基因克隆 到其它的受体载体（Destination Vector，目的载体）上。
LR重组反应
Components Entry clone （50-150ng）
Sample 1-7 ul
ห้องสมุดไป่ตู้
Destination vector (150 ng/ul) 1 ul
5X LR Clonase enzyme mix
2 ul
TE Buffer, pH 8.0
to 10 ul
25℃温浴1-16h。终止反应后，最后取1-5ul BP反应液转化大肠杆菌
to 10ul
25℃温浴1-16h。随着时间的延长，可有效增加克隆，但时间不宜超
, 过18h 终止反应后，最后取1-5ul BP反应液转化大肠杆菌。挑取阳
性克隆，进行PCR或验证，然后抽提质粒 ，酶切验证。
LR重组装入表达载体
根据自己实验目的，了解自己将要装入的载体的结构，原核表达，超 表达，抑制表达、特异表达、GUS/GFP表达等载体，
Gateway技术特点：
通过去除冗长的亚克隆步骤节省操作时间，同时将目的 基因转移到多个表达系统，在任何选择的表达系统如细菌， 酵母，昆虫，或哺乳动物进行基因的分析表达。
Gateway技术的灵活性：
Gateway技术的原理
Gateway的原理也是建立在噬菌体DNA定点整合到细菌宿 主基因组上。在噬菌体和细菌的整合因子（INF、Int）的 作用下，lambda的attP位点和大肠杆菌基因组的attB位点 可以发生定点重组，lambda噬菌体DNA整合到大肠杆菌 的基因组DNA中，两侧产生两个新位点：attL和attR。这 是一个可逆的过程，如果在一个噬菌体编码蛋白Xis和IHF、 Int的共同介导下这两个新位点可以再次重组回复为attB和 attP位点，噬菌体从细菌基因组上裂解下来。这一过程的 方向是受控于两个重要因素：存在的介导蛋白和重组位点。
3：PCR产物的纯化
4：BP重组反应
BP重组反应
Components attB-PCR product （>10ng）
Sample 1-7ul
pENTR vector (150 ng/ul)
1ul
5X BP Clonase Clonase enzyme mix 2ul
TE Buffer, pH 8.0