Gateway

Gateway™技术提供以下可能：
∙通过去除冗长的亚克隆步骤节省您的时间
∙将您的基因转入到多个表达系统
∙在任何您选择的系统――体外，细菌，酵母，昆虫，或哺乳动物――分析表达
Gateway™技术能够克隆一个或多个基因进入到任何蛋白表达系统（图1）。

这项强大的体外技术大大地简化了基因克隆和亚克隆的步骤，而同时典型的
克隆效率高达95％或更高。

当基因在目的表达载体之间快速简便的穿梭时，
还可以保证正确的方向和阅读框。

Gateway™也有助于进行带不同数目纯化和
检测标签的表达。

Gateway™利用了位点特异重组，所以在构建入门载体后，不再需要使用限制性内切酶和连接酶。

一旦您拥有了一个入门克隆，就可以多次使用它，转移您感兴趣的基因到Gateway™改造过的的各种表达载体（目的载体）。

此外，由于在重组时DNA片段的阅读框和方向保持不变，因而您不必再为新的表达克隆的测序担心。

在使用每一种新的表达系统时，将会节省您更多的时间。

图1-Gateway™技术的灵活性
*目的基因克隆进入门载体后，
可以同时转移目的基因到多个目的载体。

一种强大而可靠的技术
Gateway™技术是克隆和亚克隆DNA序列的一项新颖的通用系统，便于功能基因的分析和蛋白质的表达。

一旦进入这个多功能的操作系统，DNA片段可以通过位点特异的重组在载体之间转移。

Gateway™技术是基于已研究的非常清楚的λ嗜菌体位点特异重组系统（attB x attP →attL x attR）。

BP和LR两个反应就构成了Gateway™技术（表1和图2）。

BP反应利用一个attB DNA片段或表达克隆和一个attP供体载体之间的重组反应，创建一个入门克隆。

LR反应是一个attL入门克隆和一个attR目的载体之间的重组反应。

LR反应用来在在平行的反应中转移目的序列到一个或更多个目的载体。

Gateway™技术也利用了ccdB选择方法，确保高效率的分离重组克隆。

典型的效率是＞95％。

需要了解更多的有关ccdB的信息，请
参考术语表。

表1-反应和术语总结
完成构建Gateway™表达克隆仅需两步（图2）：
1.创建入门克隆，通过PCR或传统的克隆方法将目的基因克隆进入门载体。

2.混合包含目的基因的入门克隆和合适的目的载体及Gateway™ LR Clonase™酶，产生表达克隆。

（表达克隆用来在合适的宿主
中进行蛋白的表达和分析。

）
图2-Gateway™技术总结
在BP反应中基因转移形成入门克隆，在LR反应中入门克隆可以作为反应物产生最终的表达克隆。

可以通过以下几种方法构建Gateway™入门载体。

无论您选择何种方法，创建的入门载体都是用来与各种目的载体进行重组。

图
3-Gateway™定向TOPO®克隆
PCR克隆（定向TOPO®克隆至入门载体或与供载体BxP重组）
∙限制性内切酶消化和连接进入入门载体
∙使用pCMV·SPORT6或pEXP-AD502*构建Gateway™兼容cDNA文库
∙Gateway™改造过的克隆资源*
( * 这些克隆资源和cDNA文库两边加有attB位点。

这些克隆可以通过与供载体及BP Clonase™酶反应转换到入门载体。

请登录/获得已有克隆资源的更多信息。

)
PCR-定向(PCR-Directional)TOPO®克隆
定向TOPO®克隆使得克隆PCR产物和其它的DNA分子更加快速和有效。

进行5分钟的简单连接，产生＞90％的重组子。

您不仅会
比用连接酶介导的方法更快的获得克隆，而且可以节省因第一次无结果而重复试验所额外浪费的时间。

定向TOPO®克隆提供高效的一步法克隆策略，可以定向克隆平端PCR产物到入门载体。

平端PCR产物定向克隆的效率＞90％，从而简化了筛选。

同时不再需要连接酶、PCR后续步骤或限制性内切酶。

目前有两种定向TOPO®克隆载体:pENTR/D-TOPO® 和pENTR/SD/D-TOPO®（表2和图3），它们具有有以下特点：
∙位于PCR产物插入位点两侧的attL重组位点可以与Gateway™目的载体进行有效重组
∙通用M13位点便于测序
∙基于pUC的ori位点提供高产量质粒
∙大肠杆菌中卡那霉素（kanamycin）抗性基因筛选
表2-两种pENTR/D-TOPO®载体的简单比较
构建入门载体的各种选择
A 限制性内切酶消化
作为PCR克隆的替代方法，有5种Gateway™入门载体可以使用传统的限制酶切和连接的方法产生入门克隆。

这些载体配合合适的目的载体，可以用于表达天然蛋白或带有N端或C端融合标签的重组蛋白。

为了在真核细胞中有效地翻译蛋白，所有的5个Gateway™入门载体提供了Kozak 序列。

此外，pENTR™11提供了SD (Shine-Dalgarno)序列，便于在大肠杆菌中有效的翻译。

B PCR重组克隆
重组是从PCR产物创建Gateway™入门克隆的另一种方法。

这种方法是通过合并attB位点到上游和下游引物上，然后共同孵育扩增
PCR产物和pDONRTM载体(包含attP位点)及Gateway™ BP ClonaseTM酶混合物。

接着转化进大肠杆菌中，您将会获得包含目的基因的入门克隆，同时目的基因两侧具有attL重组位点。

这个入门克隆可以与任何Gateway™目的载体进行重组（参看图2）。

C Gateway™改造过的cDNA文库
如果您已经有了用Gateway兼容载体构建的cDNA文库，您就可以通过pDONRTM载体和BP ClonaseTM酶混合物进行一个简单的重组反应，很容易地把单个克隆转换成Gateway™入门克隆。

这样就不再需要亚克隆和测序，为您节约数小时的时间。

SuperScript cDNA 文库使用pCMV·SPORT（登录获得更多信息）构建，有几种的人组织来源可供选择，这些文库有很大一部分是全长的插入片段，可以完全代表来源mRNA。

如要了解Gateway兼容文库的详细列表，请登录/fulllength.
D 入门克隆的切入点――克隆资源
您可以从与10000个与人类基因相关的35000个克隆中进行选择，这些克隆的70％以上是全长序列的。

这些克隆来源于使用特殊的高级cDNA文库构建技术，oligo dT引物，以及SuperScriptTM II 反转录酶所构建的文库。

许多克隆来源于I.M.A.G.E.协会，NCI CGAP 项目，ResGenTM库或UltimateORF库。

克隆资源因为已克隆到Gateway改造过的载体，所以可以快速地将基因转到各种表达系统中。

图4-进入G ateway™系统的各种路线* 目前的克隆资源带有attB位点，需要与pDONR质粒重组
触手可及的最高级表达系统
一旦您构建好Gateway™入门克隆，蛋白表达和分析的大门就会向您敞开。

使用Gateway™技术，您可以进入到几乎是无数种的表达系统。

因为没有一个单一的表达系统蛋白适合于每一种蛋白，优化基因表达的最好方法是在多个系统中分析您的蛋白（图5）。

为了扩展表达的选择，Invitrogen 已将Gateway技术合并到部分最高级的表达系统中。

无论您选择哪个系统――体外，细菌，酵母，昆虫，或哺乳动物――都可以获得Gateway™目的载体。

此外，你可以很容易地把你自己最喜欢的表达载体转换成Gateway™目的载体。

图5-在Gateway™系统表达全长开放阅读框
大肠杆菌GUS基因、人类MAP4和Eif-4E基因平行转移
进目的载体，在Sf9昆虫细胞(杆状病毒)或大肠杆菌
BL21-SITM菌株表达天然蛋白、N-端His或N-端GST融
合蛋白。

在所有的系统中均观察到GUS良好的表达，而
MAP4只在昆虫细胞中表达，Eif-4E只在大肠杆菌中表
达。

在Hartley, J.L. et al. (2000) Genome Research
10(11):1788-95 可以找到更多的细节。

表3-Gateway™技术入门选择
体外表达
Expressway in vitro蛋白合成系统简化当前市场上的体外（无细胞）表达系统。

仅需两小时，您就可以在一个反应管中获得高达50μg 的表达蛋白，而无须传统细胞表达体系的烦琐和花费。

仅需加入优化构建的超螺旋或线性DNA模板到Expressway反应管，DNA模板由T7启动子驱动。

每一个反应管中包括大肠杆菌（E.coli）抽提物（可以同时进行转录和翻译）和强大的ATP能量更新系统（保证连续高水平活跃蛋白表达的能量水平要求）。

Gate way™技术为进行基因功能分析和蛋白表达提供了广泛深入的方法。

您可以通过把目的基因转移到优化构建的体外表达载体，pEXP1-DEST 或pEXP2-DEST（表4）（包括在系统中），然后开始体外蛋白合成。

pEXP1-DEST 或pEXP2-DEST载体中的T7启动子，核糖体结合位点（RBS）(仅pEXP1-DEST)以及T7终止子之间的间隔的序列搭配都为Expressway的蛋白表达专门优化（图6），从而用Expressway进行蛋白表达。

转移的基因定向、阅读框正确，并随时可以用于表达。

图6 pEXP1-DEST™ 和pEXP2-DEST™载体
表4-Gateway™体外蛋白合成目的载体
大肠杆菌表达
大肠杆菌提供了几种有利于重组蛋白生产的优点，包括容易操作、生长迅速和培养基要求简单。

大肠杆菌非常适于表达用于抗体生产和结构研究的蛋白。

目前有很多具有不同启动子的大肠杆菌目的载体（表5），从而为您提供一系列表达选择。

Gateway™目的载体也会为您提供N端或/和C端融合标签的选择，从而简化表达蛋白的纯化和检测。

5－Gateway™大肠杆菌表达目的载体
* 6xHis标签来自Qiagen授权
酵母表达
酵母是最简单的真核生物之一。

基因组了解清楚，生长迅速，并且非常适于大规模发酵。

由于酵母是真核细胞，它可以进行高等真核细胞的一些翻译后修饰，因而可以在廉价、易于操作的宿主中，为您提供一些哺乳动物表达的优点。

Invitrogen 的Gateway™酵母表达目的载体（表6）允许您利用酵母表达的优势生产目的蛋白。

表6-Gateway™酵母表达目的载体
在酵母中进行功能分析
除了在酵母中表达蛋白，现在用于研究蛋白－蛋白相互作用的ProQuest™酵母双杂交系统也是Gateway™-改造过的（表7）。

这种双杂交系统允许您：
∙通过重组反应转移目的基因到bait载体或prey载体
∙使用基于GAL4转录因子重建系统确定相互作用
∙筛选完整文库或单一克隆
∙通过提供低拷贝数质粒，具有独立启动子的三种报告基因，阳性和阴性对照，及一组扩展的酵母对照菌株降低假阳性率。

∙快速转移DNA序列进其它系统进行多种应用
表7-ProQuest™双杂交系统
* 3个载体全部是Gateway™-改造过的，而且具有att重组位点。

昆虫细胞表达
昆虫可以提供重组蛋白高水平、可溶性的表达。

由于昆虫细胞是较高等的真核细胞，它可以提供很多哺乳动物的翻译后修饰及悬浮状态下生长的优势。

由于杆状病毒和果蝇表达系统（DES®·）的改进，蛋白在昆虫细胞中表达已经大大简化。

Invitrogen Gateway™昆虫表达目的载体允许您在您选择的昆虫系统中生产蛋白，并且获得您想要的表达结果。

Bac-to- Bac®杆状病毒表达系统通过应用与bacmid的体内重组，简化了杆状病毒的表达。

这将允许您快速、简便地生产可以在昆虫细胞中表达的重组杆状病毒载体。

目前有3种Gateway™目的载体可以满足Bac-to- Bac®杆状病毒表达系统的应用。

这些载体允许裂解病毒系统中多角体(polyhedron)启动子控制下的天然蛋白、6xHis融合蛋白或GST融合蛋白的表达。

果蝇表达系统（DES®）允许在果蝇S2细胞中进行非裂解稳定或瞬时重组蛋白的表达。

DES®使用简单的载体及直接的转染方法，然而却生产高水平的重组蛋白。

最早自转染后两天就能够观察到瞬时表达，而仅仅两周就可以建立稳定的多克隆细胞系。

我们提供的产品正在不断的扩展。

如需要广泛的信息资源，请联系技术服务或登录/gateway
表8- Gateway™目的载体
﹡6xHis标签来自Qiagen授权。

哺乳动物表达
哺乳动物表达系统通常用来生产较高等的真核细胞蛋白。

由于转录、mRNA加工和翻译的信号是保守的，因而哺乳动物细胞一般会产
生正确加工的、有活性的蛋白。

哺乳动物表达系统是生产天然蛋白的理想表达系统，这些天然蛋白可以用于功能的研究和应用。

许多Invitrogen高级哺乳动物载体已经被改造，以使用Gateway™技术（表9）。

可以得到高水平诱导和组成表达Gateway™目的载体。

这些载体提供各种N-或C-端融合标签，从而对表达蛋白进行方便和可靠的检测和纯化。

表9- Gateway™哺乳动物目的载体
* 6xHis标签来自Qiagen授权。

** pCMV·SPORT6 包含attB位点，而且可以用限制性内切酶和连接酶进行传统的克隆。

使您的最喜欢的载体与Gateway™兼容
Gateway™技术具有非常大的灵活性，它允许您把您最喜欢的载体作为目的载体。

您可以使用Gateway™转换系统（图6），很容易地把任何载体变成G ateway™兼容载体。

仅仅需要在您的载体的平末端限制性酶切位点插入一个包含attR重组位点的盒（cassette），用氯霉素抗性筛选转换子。

目前有三种平末端的盒，可以将任何表达载体转化成目的载体，每个盒在5’端含有attR1位点，后面带氯霉素抗性基因(Cmr)和ccdB基因。

attR2位点的盒的3’端，每个盒在三个可能的开放阅读框中的一个框架中连接N端和C端的融合蛋白。

图7- Gateway™载体转换盒
克隆多个片段的前所未有的灵活性
从以往来看，克隆多个片段到一个载体上一直是一个烦琐和耗时的过程。

可以使用的限制性内切酶位点的局限和一次构建只能有一个的结果限制了成功。

现在，多位点Gateway™技术（MultiSite Gateway™Techno logy）为您提供这种灵活性，可以使用不同的重组反应组装片段，同时利用重组克隆的优势，确保准确、有效和定向的组装。

使用多位点Gateway™技术：
∙筛选来自不同启动子的表达
∙添加启动子/标签元件到当前的Gateway™入门克隆
∙转换编码蛋白结构域
∙构建生物学或生物化学途径
多位点Gateway™载体构建试剂盒（MultiSite Gateway™ vector construction kit）可以用于3个片段的克隆方案。

当您希望将不同的5’和3’片段添加到开放阅读框或基因从而获得多重功能时，使用这个试剂盒组装多个表达克隆（图8）。

多位点Gateway™技术使得复杂的克隆方案变得更加简单和有效。

图8-多位点Gateway™技术――前所未有的灵活性
产品名称目录号规格
MultiSite Gateway Three-fragment Vector 12537-023 20rxn
实验室定制服务
为了节省您在进行Gateway™克隆时的时间和精力，Invitrogen 提供广泛的定制服务。

如果您打算使用定向TOPO®克隆或重组的方法来克隆您的目的基因，Invitrogen可以为您合成PCR引物。

我们可以帮助您设计准确克隆和重组的引物，同时能保持基因的阅读框。

引物通过Parallel Array Synthesis™技术合成，并且可以以两种形式获得－－2ml 离心管冻干形式或进行自动操作的96-孔的冻干形式。

需要更多细节请登录/订制服务。

除了引物合成以外，Invitrogen 提供还提供多种分子生物学服务，从而节省您宝贵的时间、精力和资源。

利用我们训练有素的科学家完成您的全部或部分项目，这样将会增加您的能力和减少周转时间。

我们提供的一些服务包括：
∙定制Gateway™兼容表达载体
∙PCR 优化、扩增和克隆
∙Gateway™入门克隆重组进入任何数量的Gateway™目的载体
∙具有高同量克隆能力的TOPO®克隆
∙测序
∙表达的检测和蛋白的生产
Gateway™――开放共享的系统
购买克隆技术产品（例如，TOPO® cloning，TOPO TA cloning®，TA cloning®，TOPO® Tools，Drectional TOPO® cloning，Zero Background™，Gateway™ cloning Systems和Echo™ cloning Systems）就可以获得如下的有限授权：您可以根据随产品的有限标签授权协议中所阐述的条款获得使用产品的知识产权。

克隆技术产品和它们的使用是U.S.专利No.5,888,732；6,143,557；6,171,861；5,766,891；5,487,993；5,827,657；5,910,438；6,180,407；5,851,808；6,270,969和/或其它未定的U.S和外国专利的主体，它们被Invitrogen 公司拥有和授权。

使用这些产品要求Invitrogen 公司许可。

购买这些产品可以获得一些有限的不可以转让的权利。

购买这些产品的价格包括有限和不可以转让的权利，只能单独使用所购量的产品进行内部研究。

Invitrogen 保留其它所有权利，产品购买者不可以转让和出售所购产品或成分或衍生物到第三方，产品购买者无权对产品或组分或衍生物进行所限定的商业目的使用。

商业目的意味着某一团体获利的任何活动。

这些活动包括，但并不限于：①在生产中使用产品或组分或衍生物。

②使用产品或组分或衍生物提供服务、信息或数据。

③使用产品或组分或衍生物用于诊断目的。

④转让或出售通过产品或产品的组分或衍生物所制备的载体、克隆和文库，或⑤再一次出售产品或它的组分或衍生物，无论这一产品或它的组分或衍生物被再一次出售是否用于研究。

术语表
attL,attR,atttB，and attP Gateway™技术中使用的来源于λ嗜菌体重组位点。

·在LR Clonase™酶混合物介导的反应中，attL总是与attR重组，LR反应是入门克隆x目的载体反应的基础。

attL 和attR 位点重组反应后，在产物质粒上形成attB和attP位点。

·在BP Clonase™酶混合物介导的反应中，attB总是与attP重组，BP反应是PCR克隆载体（pDONRTM）与包含有attB 位
点的PCR产物、克隆资源或cDNA文库克隆之间反应的基础。

attB 和attP位点重组反应后，在产物质粒上形成attL和attR 位点。

BP Clonase™ enzyme mix（BP Clonase™酶混合物）λ嗜菌体重组蛋白的全部混合物，介导attBxattP重组反应。

ccdB gene（ccdB基因）编码干扰大肠杆菌DNA促旋酶的一种蛋白，从而抑制标准大肠杆菌宿主的生长。

这个基因存在于Gateway™目的载体、供载体（donor vector）和一些入门载体。

当目的载体和入门克隆发生重组时，ccdB基因被目的基因取代。

携带有ccdB基因的未反应载体、或保留有ccdB基因副产品的细胞将不会生长。

这将允许高效回收那些想要的克隆。

DB3.1™ Competent Cells（DB3.1™感受态细胞）这些细胞对于ccd基因的产物具有抵抗作用，因而用来扩增包含ccd基因的载体（例如pDONR™，超螺旋pENTR™,目的载体）。

Destination vector（目的载体）Gateway™适应载体，包含attR位点，允许与入门克隆重组。

可以得到用于原核、酵母、昆虫、或哺乳动物系统及天然或融合蛋白表达的载体。

Directional TOPO® Cloning（定向TOPO®克隆）一种PCR克隆方法，PCR产物优先以5’→3’方向插入载体。

参看TOPO®克隆，选择入门系统插页。

Donor vector(pDONR™)（供载体）包含attP位点的Gateway™载体。

这个载体用来克隆两侧具有attB位点（表达克隆）的PCR产物或目的基因，产生入门克隆。

当具有attB位点的PCR片段与pDONRTM载体在BP反应中进行重组时，它们会产生入门克隆。

PCR片段（attB位点）＋pDONRTM载体（attP位点）→入门克隆
Entry clone（入门克隆）克隆DNA片段到入门载体或供载体（donor vector）的产物。

入门克隆包含两侧具有attL位点的目的基因。

可以用于随后的向目的载体的基因转移。

Entry vector (pENTR™)（入门载体）包含attP位点的Gateway™载体。

通过使用定向TOPO®克隆或传统的限制性内切酶和连接酶的方法，克隆DNA片段。

Expression clone（表达克隆）通过重组反应，亚克隆入门载体中的目的DNA片段进入到目的载体后的产物。

目的基因或DNA两侧具有attB位点。

表达克隆可能是融合蛋白或天然蛋白。

入门克隆＋目的载体→表达克隆
LR Clonase™ enzyme mix（LR Clonase™ 酶混合物）λ嗜菌体独有的/特殊的重组蛋白混合物，介导attLxattR重组反应。

Recombination site（重组位点）参看attL,attR,atttB和attP
TOPO®cloning（TOPO®克隆）一种快速、有效的PCR克隆方法，这种方法利用了DNA拓朴异构酶Ⅰ的再连接活性。