基于Gateway技术的植物表达载体的构建
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第３ ８卷 第１ １期百度文库２ ０ １ ０年１ １月
西北农林科技大学学报 （ 自然科学版 ） （ ） Ｊ ｏ ｕ ｒ ｎ ａ ｌ ｏ ｆ Ｎ ｏ ｒ ｔ ｈ ｗ ｅ ｓ ｔ Ａ＆Ｆ Ｕ ｎ ｉ ｖ ｅ ｒ ｓ ｉ ｔ Ｎ ａ ｔ ． Ｓ ｃ ｉ ． Ｅ ｄ ． ｙ
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基于 Ｇ ａ ｔ ｅ ｗ ａ ｙ 技 术 的植物 表达载 体的 构 建
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（ ） 陕西 杨凌 ７ 陕西 杨凌 ７ １ 西北农林科技大学 ａ 生 命 科学学 院 ， ｂ 植物保护学院， １ ２ １ ０ ０； ２ 陕 西 省 农 业 分子 生 物 学 重点 实 验 室 ， １ ２ １ ０ ０
＊ ［ 收 稿日 期 ］ ０ １ ０ ０ ４ １ ９ ２ － － ［ ” ） ； ） 基 金项 目 ］ 计 划 项 目（ 高 等 学 校 学科 创新引 智 计 划 项 目 （ ９ ７ ３ ２ ０ ０ ６ Ｃ Ｂ １ ０ １ ９ ０ １ Ｂ ０ ７ ０ ４ ９ 科技 部 “ ［ ， ： 作 者简介 ］ 女， 山东青岛人， 在 读硕 士 ， 主 要从事 植 物 免疫 学 研究 。Ｅ－ｍ １ ９ ８ ５－ ） ａ ｉ ｌ ｓ ｈ ｓ ｈ ２ ０ ０ ６＠ｇ ｍ ａ ｉ ｌ ． ｃ ｏ ｍ 郭 姗姗 （ ｇ ［ ， ： 通 信 作 者］ 男， 新疆伊犁人， 教授 ， 博士生导师， 主 要从事 植 物 免疫 学 研究 。Ｅ－ｍ １ ９ ６ ７－ ） ａ ｉ ｌ ｗ ｘ ｓ ｈ ａ ｎ ｗ ｓ ｕ ａ ｆ ． ｅ ｄ ｕ． ｃ ｎ 单 卫 星（ ＠ｎ
１ ６ ２
西北农林科技大学学报 （ 自然科学版 ）
第３ ８卷
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ｃ ｉ ｅ ｎ ｓ ｅ ｄ ｉ ａ ｔ ｅ ｄ ｅ ｘ ｒ ｅ ｓ ｓ ｉ ｏ ｎ ｖ ｅ ｃ ｔ ｏ ｒ ｍ ａ ｋ ｅ ｓ ｉ ｔ ｔ ｏ ｃ ｏ ｍ ｂ ｉ ｎ ｅ ｃ Ｄ ＮＡ ｌ ｉ ｂ ｒ ａ ｒ ｃ ｏ ｎ ｓ ｔ ｒ ｕ ｃ ｔ ｉ ｏ ｎ ａ ｎ ｄ ｈ ｉ ｈ ｌ ａ ｎ ｔ ｏ ｓ ｓ ｉ ｂ ｌ ｅ －ｍ ｐ ｙ ｇ ｐ ｐ
［ 摘 要］ 目的 】为 方便 基 于 植 物 瞬 时表达 技 术 的 高 通 量 功 能 基 因 筛 选 ， 利用 Ｇ ａ ｔ ｅ ｗ ａ 【 ｙ技 术 实 现 植 物 表 达 载 体 和 表达 文 库 的 构 建 ， 将３ ５ Ｓ启动子和 Ｇ ａ ｔ ｅ ｗ ａ Ｄ ＯＮ Ｒ ２ ２ ２的同源重组区连接到植物表达载体 ｙ技术入门载体 ｐ 构建 Ｇ 方 法 】分 别 扩 增 ３ Ｃ ＡＭＢ Ｉ Ａ ０ ３ ８ ０上， Ｄ ＯＮ Ｒ ２ ２ ２上ａ ａ ｔ ｅ ｗ ａ ５ Ｓ启动子与 ｐ ｔ ｔ Ｐ特 ｐ ｙ 技 术 兼 容 的 植 物 表达 载 体 。【 异 识 别 序 列 之 间 的 功能 区 ， 并将其依次连入根癌农杆菌（ 介导的植物表达载体 ｐ Ｃ ＡＭ－ Ａ ｒ ｏ ｂ ａ ｃ ｔ ｅ ｒ ｉ ｕ ｍ ｔ ｕ ｍ ｅ ａ ｃ ｉ ｅ ｎ ｓ） ｇ ｆ 利 用 带 有ａ 对 构 建 的载体 功能 进 行 测 试 。【 结 果 】成 功 构 建 Ｂ Ｉ Ａ ０ ３ ８ ０ 的多 克隆 位 点区 ， ｔ ｔ Ｂ特异识别区域的Ｇ Ｕ Ｓ 基因 ， 了基于 Ｇ 载体 重 组 基因的 选 择 性 测 试 结 果 表明 ， １ １ ０ ４ Ｄ； １ １ ０ ４ Ｄ 对 目的基因 片 段 的 大 小 ａ ｔ ｅ ｗ ａ ｐ ｙ 技 术 的 植 物 表达载体 ｐ
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５ ／ 无严格选择性； 载体 重 组 效 率 测 试 结 果 表明 ， １ １×１ ０ ｃ ｆ ｕ ｍ Ｌ； Ｇ Ｕ Ｓ 报告基因瞬间表达试 １ １ ０ ４ Ｄ 重 组 平 均 滴 度 为 ５． ｐ
验结 果 表明 ， 改 造 后 的载体 可 以 实 现 目 标 基因的 顺 利 表达 。【 结 论 】基 于 Ｇ １ １ ０ ４ Ｄ 的构 ａ ｔ ｅ ｗ ａ ｙ技 术 的 植 物 表 达 载 体 ｐ 建， 为实现ｃ 有 望 推 动 植 物 －病 原 互 作 研 究 中 关 键 基 Ｄ ＮＡ 文 库 的 高 效 构 建 和 目 标 基 因 的 高 通 量 功 能 筛 选 提 供 了 可 能 ， 因的 鉴 定 与 克隆 。 ［ 关键词 ］ 植 物 表达载体 ； 瞬 时表达 ； 功能克隆 ａ ｔ ｅ ｗ ａ Ｇ ｙ技 术 ； ［ 中图分 类号 ］ ７ ８ ５ Ｑ ［ 文 献标识码 ］ Ａ ［ （ ） 文 章 编 号］ ６ ７ １ ９ ３ ８ ７ ２ ０ １ ０ １ １ ０ １ ６ １ ０ ６ １ － － －
（ １ ａ Ｃ ｏ ｌ ｌ ｅ ｅ ｏ Ｌ ｉ ｅ Ｓ ｃ ｉ ｅ ｎ ｃ ｅ， ｂ Ｃ ｏ ｌ ｌ ｅ ｅ ｏ Ｐ ｌ ａ ｎ ｔ Ｐ ｒ ｏ ｔ ｅ ｃ ｔ ｉ ｏ ｎ， Ｎ ｏ ｒ ｔ ｈ ｗ ｅ ｓ ｔ Ａ＆Ｆ Ｕ ｎ ｉ ｖ ｅ ｒ ｓ ｉ ｔ Ｙ ａ ｎ ｌ ｉ ｎ Ｓ ｈ ａ ａ ｎ ｘ ｉ ７ １ ２ １ ０ ０， Ｃ ｈ ｉ ｎ ａ； ｇ ｆ ｆ ｇ ｆ ｙ， ｇ ｇ， ２ Ｓ ｈ ａ ａ ｎ ｘ ｉ Ｋ ｅ Ｌ ａ ｂ ｏ ｒ ａ ｔ ｏ ｒ ｏ Ｍ ｏ ｌ ｅ ｃ ｕ ｌ ａ ｒ Ｂ ｉ ｏ ｌ ｏ Ａ ｒ ｉ ｃ ｕ ｌ ｔ ｕ ｒ ｅ， Ｙ ａ ｎ ｌ ｉ ｎ Ｓ ｈ ａ ａ ｎ ｘ ｉ ７ １ ２ １ ０ ０， Ｃ ｈ ｉ ｎ ａ） ｏ ｒ ｙ ｙ ｆ ｇ ｙ ｇ ｇ ｇ， ｆ
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第３ ８卷
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［ 摘 要］ 目的 】为 方便 基 于 植 物 瞬 时表达 技 术 的 高 通 量 功 能 基 因 筛 选 ， 利用 Ｇ ａ ｔ ｅ ｗ ａ 【 ｙ技 术 实 现 植 物 表 达 载 体 和 表达 文 库 的 构 建 ， 将３ ５ Ｓ启动子和 Ｇ ａ ｔ ｅ ｗ ａ Ｄ ＯＮ Ｒ ２ ２ ２的同源重组区连接到植物表达载体 ｙ技术入门载体 ｐ 构建 Ｇ 方 法 】分 别 扩 增 ３ Ｃ ＡＭＢ Ｉ Ａ ０ ３ ８ ０上， Ｄ ＯＮ Ｒ ２ ２ ２上ａ ａ ｔ ｅ ｗ ａ ５ Ｓ启动子与 ｐ ｔ ｔ Ｐ特 ｐ ｙ 技 术 兼 容 的 植 物 表达 载 体 。【 异 识 别 序 列 之 间 的 功能 区 ， 并将其依次连入根癌农杆菌（ 介导的植物表达载体 ｐ Ｃ ＡＭ－ Ａ ｒ ｏ ｂ ａ ｃ ｔ ｅ ｒ ｉ ｕ ｍ ｔ ｕ ｍ ｅ ａ ｃ ｉ ｅ ｎ ｓ） ｇ ｆ 利 用 带 有ａ 对 构 建 的载体 功能 进 行 测 试 。【 结 果 】成 功 构 建 Ｂ Ｉ Ａ ０ ３ ８ ０ 的多 克隆 位 点区 ， ｔ ｔ Ｂ特异识别区域的Ｇ Ｕ Ｓ 基因 ， 了基于 Ｇ 载体 重 组 基因的 选 择 性 测 试 结 果 表明 ， １ １ ０ ４ Ｄ； １ １ ０ ４ Ｄ 对 目的基因 片 段 的 大 小 ａ ｔ ｅ ｗ ａ ｐ ｙ 技 术 的 植 物 表达载体 ｐ
：【 】Ｔ Ａ ｂ ｓ ｔ ｒ ａ ｃ ｔ Ｏ ｂ ｅ ｃ ｔ ｉ ｖ ｅ ｏ ｆ ａ ｃ ｉ ｌ ｉ ｔ ａ ｔ ｅ ｌ ａ ｎ ｔ ｅ ｎ ｅ ｅ ｘ ｒ ｅ ｓ ｓ ｉ ｏ ｎ ｒ ｅ ｓ ｅ ａ ｒ ｃ ｈ ａ ｎ ｄ ｔ ｒ ａ ｎ ｓ ｉ ｅ ｎ ｔ ｅ ｘ ｒ ｅ ｓ ｓ ｉ ｏ ｎ ｂ ａ ｓ ｅ ｄ ｈ ｉ ｈ － ｊ ｐ ｇ ｐ ｐ ｇ ， ｅ ｎ ｅ ｌ ａ ｎ ｔ ｓｔ Ｂ ｉ １ ２ １ａ ｎ ｄ ｔ ｈ ｒ ｏ ｕ ｈ ｕ ｔ ｆ ｕ ｎ ｃ ｔ ｉ ｏ ｎ ａ ｌ ｃ ｌ ｏ ｎ ｉ ｎ ｉ ｎ ｈ ｅ ３ ５ Ｓｐ ｒ ｏ ｍ ｏ ｔ ｅ ｒ ｓ ｅ ｕ ｅ ｎ ｃ ｅ ｆ ｒ ｏ ｍ ｔ ｈ ｅ ｒ ｅ ｃ ｏ ｍ ｂ ｉ ｎ ａ － ｇ ｐ ｐ ｇ ｐ ｇ ｑ ｔ ｉ ｏ ｎ ｓ ｅ ｃ ｉ ｆ ｉ ｃ ｓ ｉ ｔ ｅ ｓ ａ ｔ ｔ Ｐ ｓ ａ ｎ ｎ ｉ ｎ ｒ ｅ ｉ ｏ ｎ ｆ ｒ ｏ ｍ Ｄ ＯＮＲ ２ ２ ２ｗ ｅ ｒ ｅ ｉ ｎ ｓ ｅ ｒ ｔ ｅ ｄ ｉ ｎ ｔ ｏ Ｃ ＡＭＢ Ｉ Ａ ０ ３ ８ ０ｔ ｏ ｍ ａ ｋ ｅ Ｇ ａ ｔ ｅ － － ｐ ｐ ｇ ｇ ｐ ｐ 【 】 ｗ ａ ｔ ｅ ｃ ｈ ｎ ｏ ｌ ｏ ｃ ｏ ｍ ａ ｔ ｉ ｂ ｌ ｅ Ａ ｒ ｏ ｂ ａ ｃ ｔ ｅ ｒ ｉ ｕ ｍ ｔ ｕ ｍ ｅ ａ ｃ ｉ ｅ ｎ ｓ ｅ ｄ ｉ ａ ｔ ｅ ｄ ｌ ａ ｎ ｔ ｅ ｘ ｒ ｅ ｓ ｓ ｉ ｏ ｎ ｖ ｅ ｃ ｔ ｏ ｒ ． Ｍ ｅ ｔ ｈ ｏ ｄ Ｔ ｈ ｅ － ｇ －ｍ ｙ ｇ ｙ ｐ ｐ ｐ ｆ ３ ５ Ｓｐ ｒ ｏ ｍ ｏ ｔ ｅ ｒ ｓ ｅ ｕ ｅ ｎ ｃ ｅ ａ ｎ ｄ ｔ ｈ ｅ ａ ｔ ｔ Ｐ ｓ ａ ｎ ｎ ｉ ｎ ｒ ｅ ｉ ｏ ｎ ｉ ｎ ｔ ｈ ｅ Ｇ ａ ｔ ｅ ｗ ａ ｖ ｅ ｃ ｔ ｏ ｒ Ｄ ＯＮＲ ２ ２ ２ｗ ｅ ｒ ｅ ａ ｍ ｌ ｉ ｆ ｉ ｅ ｄ ａ ｎ ｄ － ｑ ｐ ｇ ｇ ｙ ｐ ｐ ｉ ｎ ｓ ｅ ｒ ｔ ｅ ｄ ｌ ａ ｎ ｔ Ｃ ＡＭＢ Ｉ Ａ ０ ３ ８ ０ ｉ ｎ ｔ ｏ ｔ ｈ ｅ ｍ ｕ ｌ ｔ ｉ ｌ ｅ ｃ ｌ ｏ ｎ ｉ ｎ ｓ ｉ ｔ ｅ ｓ ｏ ｆ Ａ． ｔ ｕ ｍ ｅ ａ ｃ ｉ ｅ ｎ ｓ ｅ ｄ ｉ ａ ｔ ｅ ｄ ｅ ｘ ｒ ｅ ｓ ｓ ｉ ｏ ｎ ｖ ｅ ｃ ｔ ｏ ｒ －ｍ ｐ ｇ ｐ ｐ ｐ ｆ ｔ ｏ ｍ ａ ｋ ｅ １ １ ０ ４ Ｄ． Ｔ ｈ ｅ ｆ ｕ ｎ ｃ ｔ ｉ ｏ ｎ ａ ｌ ｉ ｔ ｏ ｆ ｔ ｈ ｅ ｃ ｏ ｎ ｓ ｔ ｒ ｕ ｃ ｔ ｅ ｄ ｖ ｅ ｃ ｔ ｏ ｒ １ １ ０ ４ Ｄｗ ａ ｓ ｔ ｅ ｓ ｔ ｅ ｄ ｂ ｃ ｌ ｏ ｎ ｉ ｎ ｍ ｕ ｌ ｔ ｉ ｌ ｅ ｅ ｎ ｅ ｓ ｐ ｙ ｐ ｙ ｇ ｐ ｇ 【 】 ｉ ｎ ｔ ｈ ｅ ｓ ａ ｍ ｅ Ｂ Ｐ ｒ ｅ ａ ｃ ｔ ｉ ｏ ｎ ａ ｎ ｄ ｂ Ｇ Ｕ Ｓｇ ｅ ｎ ｅ ｅ ｘ ｒ ｅ ｓ ｓ ｉ ｏ ｎ． Ｒ ｅ ｓ ｕ ｌ ｔ Ａ Ｇ ａ ｔ ｅ ｗ ａ ｔ ｅ ｃ ｈ ｎ ｏ ｌ ｏ ｃ ｏ ｍ ａ ｔ ｉ ｂ ｌ ｅ Ａ． ｔ ｕ ｍ ｅ－ － ｙ ｐ ｙ ｇ ｙ ｐ
Ｃ ｏ ｎ ｓ ｔ ｒ ｕ ｃ ｔ ｉ ｏ ｎ ｏ ｆ ａ Ｇ ａ ｔ ｅ ｗ ａ ｔ ｅ ｃ ｈ ｎ ｏ ｌ ｏ ｂ ａ ｓ ｅ ｄ － ｙ ｇ ｙ ｌ ａ ｎ ｔ ｅ ｘ ｒ ｅ ｓ ｓ ｉ ｏ ｎ ｖ ｅ ｃ ｔ ｏ ｒ ｐ ｐ
１ ａ１ ｂ １ ｂ １ ｂ２ ， ＧＵＯ Ｓ ｈ ａ ｎ ｓ ｈ ａ ｎ Ｚ ＨＡＮＧ Ｍ ｅ ｎ Ｓ ＨＡＮ Ｗ ｅ ｉ ｘ ｉ ｎ － － ｇ ， ｇ ， ，
５ ／ 无严格选择性； 载体 重 组 效 率 测 试 结 果 表明 ， １ １×１ ０ ｃ ｆ ｕ ｍ Ｌ； Ｇ Ｕ Ｓ 报告基因瞬间表达试 １ １ ０ ４ Ｄ 重 组 平 均 滴 度 为 ５． ｐ
验结 果 表明 ， 改 造 后 的载体 可 以 实 现 目 标 基因的 顺 利 表达 。【 结 论 】基 于 Ｇ １ １ ０ ４ Ｄ 的构 ａ ｔ ｅ ｗ ａ ｙ技 术 的 植 物 表 达 载 体 ｐ 建， 为实现ｃ 有 望 推 动 植 物 －病 原 互 作 研 究 中 关 键 基 Ｄ ＮＡ 文 库 的 高 效 构 建 和 目 标 基 因 的 高 通 量 功 能 筛 选 提 供 了 可 能 ， 因的 鉴 定 与 克隆 。 ［ 关键词 ］ 植 物 表达载体 ； 瞬 时表达 ； 功能克隆 ａ ｔ ｅ ｗ ａ Ｇ ｙ技 术 ； ［ 中图分 类号 ］ ７ ８ ５ Ｑ ［ 文 献标识码 ］ Ａ ［ （ ） 文 章 编 号］ ６ ７ １ ９ ３ ８ ７ ２ ０ １ ０ １ １ ０ １ ６ １ ０ ６ １ － － －