基于Gateway技术的植物表达载体的构建
利用Gateway技术构建天山雪莲cDNA表达文库
利用Gateway技术构建天山雪莲cDNA表达文库李晨;沈海涛;张煜星;王爱英;祝建波【摘要】以天山雪莲为材料,利用gateway技术构建天山雪莲cDNA表达文库.从经低温处理后的天山雪莲叶片中提取并分离mRNA,合成双链cDNA;cDNA经BP 重组反应重组到入门载体pDONR222上,构建得到天山雪莲entry cDNA文库;天山雪莲entry cDNA再经LR重组反应将雪莲cDNA重组到植物表达载体pLEELA 上,从而构建了天山雪莲cDNA表达文库.结果表明:cDNA入门文库滴度达到1.2×107 cfu/mL,文库总容量为4.8×107 cfu.表达文库的滴度为6.9×106cfu/mL,文库总容量为2.76×107 cfu,插入片段平均大小1000 bp.阳性克隆率100%.天山雪莲cDNA表达文库的建立为进一步高通量筛选天山雪莲抗寒基因奠定了基础.【期刊名称】《石河子大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2010(028)005【总页数】3页(P534-536)【关键词】天山雪莲;cDNA入门文库;cDNA表达文库;gateway技术【作者】李晨;沈海涛;张煜星;王爱英;祝建波【作者单位】石河子大学生命科学学院农业生物技术重点实验室,石河子,832003;石河子大学生命科学学院农业生物技术重点实验室,石河子,832003;石河子大学生命科学学院农业生物技术重点实验室,石河子,832003;石河子大学生命科学学院农业生物技术重点实验室,石河子,832003;石河子大学生命科学学院农业生物技术重点实验室,石河子,832003【正文语种】中文【中图分类】Q785%S580.1Abstract:The construction of a cDNA library ofS aussurea involucrataKar.et Kir using gateway technology was reported in this paper.The mRNA was isolated from Saussurea involucrata Kar.et Kir leaves.Then the double-strand cDNAs(ds-cDNAs)was synthesized.The ds-cDNAs were cloned into pDONR222 vector using BP reaction of Gateway cloning technology,and the entry clone was ing the LR reaction of Gateway cloning technology,the plant express vector pLEELA was ligated with the entry clone.Results showed that the entry cDNA library constructed in this report has a high titer of 1.2×107cfu/ml and contain a total clones of 4.8×107cfu and the expression library show a high titer of 6.9×106cfu/ml and contains a total clones of 2.76×107cf u,with an average inserts size of 1000bp.This cDNA library provides an important tool for filtrate the cold resistant genes.Key words:Saussurea involucrataKar.et Kir;cDNA entry library;cDNA expression library;gateway technologyGateway克隆技术是利用细菌λ噬菌体的整合酶-切除酶反应系统创建一种通过体外特异位点重组反应[1-2],并在该重组系统的基础上进行一系列修饰、改造,提高了这一重组系统的效率与特异性[3]。
基于Gateway技术的表达载体构建
基于Gateway技术的表达载体构建基于Gateway技术的表达载体构建1. Gateway-T载体（pGWC）的酶切反应pGWC除具有传统T载体的克隆功能外，还可以作为入门克隆（Entry Clone）与Gateway 重组克隆技术兼容。
该载体中的ccdB基因编码一个能够使大多数E. coli致死的毒蛋白，可作为重组子的负选标记取代了蓝白斑筛选。
该载体在使用前，需经过AhdI（实验中采用其同裂酶Eam1105 I）酶切，使载体两端产生5’T，用与PCR产物的两端的3’A互补。
PCR产物回收后与pGWC载体连接，挑取正向克隆送测序。
pGWC载体的酶切反应体系如下：pGWC10 μl（约2μg）10×Eam1105 I Buffer5 μlEam1105 I2 μlddH2O34 μl共计50 μl将反应混和液于37℃温育6h。
取1μl酶切反应液走1%琼脂糖凝胶电泳检测酶切效果，估测载体片段的浓度，该酶切反应液可直接用作连接无需纯化。
2. PCR产物的回收与连接反应PCR产物用琼脂糖凝胶回收试剂盒（北京天根生化科技有限公司）进行回收，与pGWC载体进行连接。
DNA片段与pGWC-T的连接：pGWC-T1μl（约50ng）DNA回收片段4μl（600bp片段约需40ng）Solution I （TaKaRa）5μl共计10μl反应混合液于4℃下连接过夜（约12~16h）。
3. 连接产物的转化取大肠杆菌DH5α感受态细胞（50μl/管）于冰上融化，加入5μl 连接产物，用移液器轻轻吸打混匀，在冰上放置30min，42℃水浴热激90s，冰上放置5min，加入无抗生素的LB培养基300μl，37℃，160rpm振荡培养45min，将菌液铺在氯霉素抗性（25mg/L）LB平板上，在超净台吹干后37℃倒置培养过夜。
4. LR反应与表达载体构建表达载体均采用Gateway重组克隆技术构建，目标基因连入pGWC后即为入门克隆（EntryClone），通过与表达载体做LR反应构建目标基因的表达载体。
以木糖异构酶基因xylA为选择标记的Gateway系统植物表达载体的构建
doi:10．3969／j．issn．1009－0002．2010．01．008研究报告以木糖异构酶基因xylA为选择标记的Gateway系统植物表达载体的构建阎淑滑，周波，赵霞，李玉花东北林业大学生命科学学院发育生物学研究室，黑龙江哈尔滨150040［摘要］目的：构建以木糖异构酶基因xylA为筛选标记的无抗生素标记Gateway系统植物表达载体。
方法：克隆大肠杆菌木糖异构酶基因xylA并用其替换植物表达载体pCAMBIA1301中的hpt基因，利用载体中的多克隆位点将Gateway Binary Vector（pH7WG2D）中酶切位点XbaⅠ和Hin dⅢ之间包括P35S、T35S、attR1、attR2和CmR－ccdB的片段重组入表达载体pCAMBIA1301中，构建表达载体pCAMBIA1301－xylA－GW，利用含有津田芜菁HY5基因片段的BP反应产物与载体进行LR反应，获得含有目的基因的植物表达载体pCAMBIA1301－xylA－HY5，并导入根癌农杆菌LBA4404中。
结果：抗生素筛选及酶切和PCR鉴定表明成功构建了以xylA为筛选标记的无抗生素标记植物表达载体pCAMBIA1301－xylA－HY5。
结论：利用木糖异构酶基因xylA结合Gateway克隆技术构建无抗生素标记植物表达载体，可简化、方便植物转基因表达载体构建。
［关键词］Gateway技术；木糖异构酶基因；LR反应；植物表达载体［中图分类号］Q78［文献标识码］A［文章编号］1009－0002(2010)01－0035－04Construction of Gateway Plant Expression Vectors with xylA Gene as Selection MarkerYAN Shu－Hua,ZHOU Bo,ZHAO Xia,LI Yu－HuaDepartment of Developmental Biology,College of Life Sciences,Northeast Forestry University,Harbin150040,China［Abstract］Objective:To construct plant expression vector with xylose isomerase gene xylA as the selection marker used in Gateway technology system．Methods:First,xylA gene was cloned from Escherichia coli,and was constructed into pCAMBIA1301by substituting for hpt gene．Second,the fragment including P35S,T35S,attR1,at-tR2and CmR－ccdB of the Gateway Binary Vector(pH7WG2D)was cut by XbaⅠand Hin dⅢand was recombi-nanted into the expression vector pCAMBIA1301－xylA．Third,the donor vector with HY5gene［cloned from‘Tsu-da’Turnip(Brassica campestris L．ssp．rapa)after BP reaction］was mixed with pCAMBIA1301－xylA－GW vector by LR reaction．Then,the recombinant plasmid was transformed into Agrobacterium tumefaciens LBA4404by electro-poration．Results:The plant expression vector pCAMBIA1301－xylA－HY5for Gateway technology system was suc-cessfully constructed by identification．Conclusion:The results showed that it is convenient to construct non－an-tibiotic marker plant expression vector by using xylA as selective marker and Gateway cloning technology．［Key words］Gateway cloning technology;xylose isomerase gene;LR recombination reaction;plant expression vector目前，随着植物转基因技术的飞速发展，已获得了大批转基因植物，但是伴随着转基因作物的广泛推广，人们开始对转基因植物中抗性标记基因的安全性产生越来越多的顾虑[1－4]。
GatewayTM系统快速构建番木瓜环斑病毒CP和CI基因的反向重复序列表达载体1
min, 然后 94 ℃ 变性 30 s, 55 ℃ 退火 30 s, 72 ℃ 延伸
1 min，30 个循环，以鉴定 基因是否真正重组到
pDONRTM221 中，代替了
基因的位置。
1.2.5 利用 LR 重组反应创建表达克隆 利用 LR
克隆酶 LR ClonaseTM 域催化入门克隆与目的载体之
间的重组反应。将入门克隆 pDONRTM221 、目的
当表达载体的质粒 DNA 经 玉酶切消化时，琼
脂糖凝胶电泳可观察到长度约为 1 700 bp 的片段产
生(图 4，b)。1 700 bp 是 LR 重组反应发生后，两个反
向重复的 基因长度加上两个内含子长度及
长度之和。PCR 扩增产物经过琼脂糖凝胶电泳分
析，表明：在引物对（P35S 和 PT1）和（Pocs 和 PT1）的作用 下，可分别扩增获得 582 和 773 bp 的 DNA 片段（图
进行 PCR 扩增，获得侧翼含有 位点的 基因
扩增产物（图 2）。
图 2. 基因的 PCR 产物的凝 胶电泳分析
Fig.2. Gel electrophoresis analysis PCR products of gene
M, DL2000 marker;1 和 2, 917 bp 的 基 因片段。
上清，用 20 滋L TE 缓冲液溶解残留物。该纯化过程
可以去除 300 bp 以下的片段，包括含 的引物及
其 引物二聚体。
1.2.4 利用 BP 重组反应创建入门克隆 用侧翼含
有 B 位点的 PCR 产物与受体载体 pDONRTM221
进行重组反应，预先，将受体载体 pDONRTM221 转
化 DB3.1 感受态细胞，并提取质粒 DNA。根据试剂
科技论文文献综述
科技论文课程综述题目：几种植物转基因表达载体的构建方法姓名: 保勇学院：农学院班级: 生物技术102班学号: 103135202几种植物转基因表达载体的构建方法作者：保勇指导老师：郭庆元摘要：表达载体的构建在植物基因工程研究中占据重要地位直接关系到目的基因的表达效果，本文比较分析了5种不同载体构建方法的特点，给出了不同载体构建方法的适用性建议，在构建多片段连接的复杂的大载体时采用相应的复杂载体构建技术在已获得无选择标记的转基因植株时采用三段T-DNA构建方法构建载体在做基因功能验证时采用的Gateway技术非常简单的载体构建可以采用传统的酶切连接的构建方式。
现在的主流构建载体方式是利用结合其他手段Gateway技术未来载体的发展趋势将是无酶连接。
关键词：载体构建：Gateway技术三段：T-DNAApproaches of Constructing Expressional Vectors Utilized inPlant GeneticTransformationName:BAO YongAbstract ：Construction of Expression Vector occupy an important position is directly related to the effect of target gene expression in plant genetic engineering, comparative analysis of five different vector construction method is characterized by given different vector construction applicability of the method recommended, build morecomplex large vector fragment connection when using the corresponding complex vector construct technology has marker-free transgenic plants using three sections of T-DNAbuild method to build carrier do gene function validation using the Gateway technology is very simple and the carrier buildenzyme digestion and ligation built. The the mainstream build carrier is using Gateway technology in combination with other means of the development trend of the future carrier enzyme-linked.Key words :construction ; vector ; gateway ; three T- DNAs ;在植物基因工程研究中,载体是携带靶DNA 片段进入宿主细胞进行扩增和表达的媒介,没有载体,目的基因无法进入受体,即使进入受体细胞也无法表达[1] 。
利用Gateway技术快速构建棉花GhANS基因植物表达载体
利用Gateway技术快速构建棉花GhANS基因植物表达载体孙宏伟;李艳军;王雅琴;刘永昌;薛飞;孙杰【摘要】[目的]为了进一步探讨GhANS(花色素合成酶)基因的上调表达对彩色棉纤维色素合成的影响,构建了棉花GhANS基因的植物表达载体.[方法]利用Gateway技术的同源重组原理,将GhANS基因通过BP反应和LR反应分别重组到植物过表达载体pGWB17与干扰表达载体pANDA35HK中.[结果]经PCR和酶切鉴定,PCR扩增片段与酶切片段大小与预期结果相一致.[结论]基于Gateway技术的棉花GhANS基因的过表达载体和干扰表达载体已构建成功,为进一步研究该基因的功能及棉花的遗传转化奠定了基础.【期刊名称】《新疆农业科学》【年(卷),期】2013(050)010【总页数】6页(P1773-1778)【关键词】彩色棉;花色素合成酶;Gateway技术【作者】孙宏伟;李艳军;王雅琴;刘永昌;薛飞;孙杰【作者单位】石河子大学农学院/新疆兵团绿洲生态农业重点实验室,新疆石河子832003;石河子大学农学院/新疆兵团绿洲生态农业重点实验室,新疆石河子832003;石河子大学生命科学学院,新疆石河子832003;石河子大学农学院/新疆兵团绿洲生态农业重点实验室,新疆石河子832003;石河子大学农学院/新疆兵团绿洲生态农业重点实验室,新疆石河子832003;石河子大学农学院/新疆兵团绿洲生态农业重点实验室,新疆石河子832003【正文语种】中文【中图分类】S562;S188.10 引言【研究意义】近年来随着人们健康和环保理念的增强，彩色棉引起了广泛关注。
彩色棉纤维颜色的形成与色素合成酶基因在纤维细胞中的特异性表达有关[1，2]，克隆与鉴定彩色棉色素物质生物合成途径中的相关酶基因，可为解析色素形成机制和利用基因工程手段改良彩色棉纤维色泽品质提供目标基因和理论基础。
【前人研究进展】花色素合成酶（Anthocyanidin synthase，ANS）是类黄酮化合物合成途径中的关键限速酶之一，它能够催化无色花色素生成有色花青素，再进一步转化为花色素苷，在植物的颜色形成过程中起重要作用。
Gateway技术构建棉花GhSAMDC基因植物表达载体
石河子大学学报 （ 自然 科 学 版 ） Ｊ ｕ ｌ ｆ ｈｈｚ Ｕｎ ｅｓ ｙＮａ ｒｌ ｃ ｎｅ ｏ ｍａ ｏ ｉｅ ｉ ｒｉ ｛ ｔ ａ Ｓ ｉ ｃ） Ｓ ｉ ｖ ｔ ｕ ｅ
Ｖｏ ． Ｏ Ｎｏ ２ １３ ．
Ａ ｐｒ ２ １ ． ０２
Ｃｏ ｔ ｎ Ｕｓｎｇ Ｇａ ｅ ｙ Ｔｅ ｈｎ ｌ ｇ ｔｏ ｉ ｔ ｗａ ｃ ｏ ｏ ｙ
ＧＥＮＧ ｅｄ ｎ Ｌ ｎｕ ＺＨＡＮＧ ｎ ｕ Ｓ Ｗ ｉｏ ｇ， ＩＹａ ｊｎ， Ｘｉｙ ， ＵＮ ｉ， ＨＵ ａ ｕ Ｊｅ Ｚ Ｈｕ ｇ ｏ
（ ｏｌｇ ｆＡｇ ｉｕｔｒ ， ｈｈ ｚ Ｕｎｖ ｒｉｙ Ｔｈ ｙＬａ ｏ ａｏ ｙｏ ｓｓＥｃ — ｒｃ ｌｕ ｅ Ｘｉｊ ｎ Ｃ ｌ ｅｏ ｒｃ ｌｕ ｅ Ｓ ｉｅｉ ｉｅｓｔ ／ ｅＫｅ ｂ ｒｔ ｒ ｆＯａ ｉ ｅ ｏＡｇ ｉｕｔ ｒ ， ｎｉ ｇ ａ
ｂ ｅｃｉｎ Ａｆｅ ａＩａ ｄＸｈ ｅ ｔｉｔｏ ｎ ｙ ｉｅ ｔ ｎ ｗｅｇ ｔｔ ｒｇ ｎｓｗｉｈ ｓｍｅｓｚ ， ｉｈ ｓ ｇ ｅｔｄ ｔ ａ ｙＢＰ ｒａ ｔｏ ． ｔｒＸｂ ｎ ｏＩｒｓｒｃｉｎ ｅ ｚ ｍｅｄｇ ｓｉ ， ｏ ｗｏ ｆａ ｍｅ ｔ ｔ ａ ｉｅ ｗｈｃ ｕ ｇ ｓｅ ｈ ｔ ｏ
ｔ ＮＡ ｉｖｅ ｔ ａ ｏ ｔ ｕ ｔ ｄｒ ｃ ｍ ｂｉ ｄ ｗｉｈ ｔ ｈｅ Ｒ ｃｏｒｗ ｓｃ ｎｓ ｒ ｃ ｅ ｕ ｃ ｓ ｆ ｌ Ｉ ｈｅ ｓ ｍ ｙ，ｈｅ １ ５９ ｂ ｆａ ｎｔｗａ ｅ ｏ ｎｅ ｔ ｈｅｐＧＷ Ｂ１７ ｖ ｃ ｏ ｅ ｔｒ
文章 编 号 ： ０ ７７ ８ ｛ ０ ２ ０ — １ ８０ １０ —３ ３ ２ １ ）２０ ３—４
Ｇ ｔｗ ｙ技 术 构 建棉 花 Ｇ Ｓ ＭＤ 基 因植 物 表 达 载 体 ａｅ ａ ｈＡ Ｃ
Gateway技术快速构建百合双价抗病毒RNAi表达载体
Gateway技术快速构建百合双价抗病毒RNAi表达载体徐品三;白建芳;刘纪文;李焕改【期刊名称】《中国农学通报》【年(卷),期】2011(27)4【摘要】为获得适合转化百合的双价RNAi表达载体,以感病百合叶片的总RNA 为模板,分别扩增400bp左右的LSV和LMoVCP基因。
通过重叠延伸PCR技术获得长约800bp的LSV-LMoV融合基因。
利用Gateway技术,通过BP反应及LR反应将LSV-LMoV融合基因克隆到双元载体pH7GWIWG2(Ⅱ),成功构建了含2种病毒基因的RNAi表达载体pH7GWIWG2(Ⅱ)-LSV-LMoV。
将构建好的双价表达载体导入农杆菌EHA105,PCR和测序表明所构建的载体及获得的工程菌与预期的完全一致。
【总页数】4页(P144-147)【关键词】百合无症病毒;百合斑驳病毒;RNAi载体;重叠延伸PCR;Gateway技术【作者】徐品三;白建芳;刘纪文;李焕改【作者单位】大连理工大学生命科学与技术学院【正文语种】中文【中图分类】Q782【相关文献】1.大豆凝集素和脂肪氧化酶双价RNAi表达载体的构建及其遗传转化 [J], 张学明;宋阳;王丕武;马建;晏佳琳;付永平;曲静;张卓;董环宇2.啤酒花抗病毒双价RNAi植物表达载体的构建及遗传转化 [J], 王琨;裴娟;黎玉顺;祝建波;向本春3.中国水仙NtBCH基因的克隆及LCYE RNAi与反义BCH双价植物表达载体的构建 [J], 廖正平;郑益平;罗鹏;吴雪琴;曾黎辉4.葡萄抗病毒双价RNAi植物表达载体构建及其对烟草的遗传转化 [J], 田莉莉;牛良5.同源重组快速构建百合LCHS2基因RNAi表达载体及其鉴定 [J], 化占勇;刘雅莉;徐伟荣;王跃进;张雄飞因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
利用Gateway技术快速构建棉花GhANS基因植物表达载体
利用 Ｇ ａ ｔ ｅ ｗ ａ ｙ 技术快速构建棉花 Ｇ ｈ Ａ Ｎ Ｓ基 因植物表达载体
孙宏伟 ， 李艳 军 ， 王雅琴 ， 刘永 昌 ， 薛飞 ， 孙杰
（ １ ． 石河子大学农学ｌ 览 ／ 新 疆兵 团绿洲生态农业重点实验 室， 新疆石 河子 ８ ３ ２ ０ ０ ３ ； ２ ． 石河子大学生命科学学院 ， 新疆石 河子 ８ ３ ２ ０ ０ ３ ）
摘
要【 目的 】 为 了进一步探讨 Ｇ ｈ Ａ Ｎ Ｓ （ 花色素合成酶） 基 因的上 调表达对彩色棉纤维 色素合成 的影 响， 构建
了棉花 Ｇ ｈ Ａ Ｎ Ｓ 基 因的植 物表达 载体。【 方法】 利用 Ｇ ａ ｔ ｅ ｗ ａ ｙ 技术 的同源重组原理 ， 将Ｇ ｈ Ａ Ｎ Ｓ 基因通过 Ｂ Ｐ 反应
（ Ｇ ｈ Ａ Ｎ Ｓ ）ｉ ｎ ｃ ｏ ｔ ｔ ｏ ｎ ｆ ｉ ｂ ｅ ｒ ｐ ｉ ｇ ｍ ｅ ｎ ｔ ｓ ｙ ｎ ｔ ｈ ｅ ｓ ｉ ｓ ． 【 Ｍｅ ｔ ｈ ｏ ｄ 】 Ｇ ｈ Ａ Ｎ Ｓ ｇ ｅ ｎ ｅ ｗ ａ ｓ ｒ ｅ ｓ ｔ ｒ ｕ ｃ ｔ ｕ ｒ ｅ ｄ ｔ ｏ ｔ ｈ ｅ ｏ ｖ ｅ ｒ ｅ ｘ ｐ ｒ ｅ ｓ ｓ ｉ ｏ ｎ ｖ ｅ ｃ —
新疆农业科学 ２ ０ １ ３ ， ５ ０ （ １ ０ ） ： １ ７ ７ ３— １ ７ ７ ８
Ｘ ｉ ￣ｉ ａ ｎ ｇ Ａ ｇ ｒ ｉ ｃ ｕ ｌ ｔ ｕ ｒ ａ ｌ Βιβλιοθήκη Ｓ ｃ ｉ ｅ ｎ ｃ ｅ ｓ
ｄ ｏ ｉ ： １ ０ ． ６ ｏ ４ ８ ／ ｊ ． ｉ ｓ ｓ ｎ ． １ ０ ０ １－ ４ ３ ３ ０ ． ２ ０ １ ３ ． １ ０ ． ０ ０ ２
ｖ ｅ ｃ ｔ ｏ ｒ ｉ ｎ ｏ ｒ ｄ ｅ ｒ ｔ ｏ ｅ ｘ ｐｌ ｏ ｒ ｅ ｔ ｈ ｅ ｅ ｆ ｆ ｅ ｃ ｔ ｓ ｏ ｆ ｕ ｐ— —ｒ ｅ ｇ ｕ ｌ ａ ｔ ｅ ｄ ｅ ｘ ｐ ｒ ｅ ｓ ｓ ｉ ｏ ｎ ｏ ｆ ｓ ｙ ｎ ｔ ｈｅ ｔ ａ ｓ ｅ ｇ ｅ ｎ ｅ ｏ ｆ ｌ ｆ ｏ ｗｅ ｒ ｐ ｉ ｇ ｍｅ ｎｔ ｓ
以木糖异构酶基因xylA为选择标记的Gateway系统植物表达载体的构建
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［ ｂｔａ ｔ Ｏｂｅｔ ｅ Ｔ ｏ ｓ ｕｔｐａｔｅｐｅｓ ｎ ｖ ｃ ｒｗｔ ｙｏｅ ｉ ｍ ｒｓ ｅｅ ｘｌ ａ ｈ ｓｌ ｔ ｎ Ａ ｓ ｃ】 ｒ ｊｃｉ ： ｏ ｃｎｔ ｃ ｌｎ ｘｒｓｉ ｅｔ ｉ ｘｌ ｓ ｅａｅ ｇｎ ｙ ｖ ｒ ｏ ｏ ｈ ｓ ｏ Ａ ｓ ｔｅ ｅ ｃｉ ｅ ｏ
Ｇ ｔ ａ ｉ ｒ ｅ ｔ （ Ｈ ＷＧ Ｄ） 酶 切 位 点 Ｘｂ ａ ｗ ｙ Ｂ ｎ ｙ Ｖ ｃ ｒｐ ７ ２ 中 ｅ ａ ｏ ａＩ和 Ｈｉ １ 之 间 包 括 Ｐ ５ 、 ３ Ｓ ａ Ｒ１ ａ Ｒ ｎ １ ｄＩ ３ Ｓ Ｔ ５ 、ｔ 、ｔ ２和 Ｃ Ｒ— ｃ Ｂ 的 ｔ ｔ ｍ ｃｄ
杆 菌 Ｌ Ａ ４ ４中。结 果 ： 生 素筛 选 及 酶 切 和 Ｐ Ｒ鉴 定 表 明成 功 构 建 了以 ｘ ｌ 为 筛 选 标 记 的 无抗 生 素标 记 植 物 表 Ｂ ４０ 抗 Ｃ ｙＡ
达 载 体 ｐ Ａ Ｉ ３ １ ｘ ｌ — Ｙ 。结 论 ： 用 木 糖 异 构 酶 基 因 ｘ ｌ 结 合 Ｇ ｔ ａ Ｃ ＭＢ Ａ１ ０ 一 ｙ Ｈ ５ Ａ 利 ｙ Ａ ａｅ ｙ克 隆技 术 构 建 无 抗 生 素标 记 植 物 ｗ 表 达 载体 ， 简 化 、 可 方便 植 物 转基 因表 达 载体 构建 。 ［ 键 词 ］ Ｇ ｔｗ ｙ技 术 ； 糖 异 构 酶 基 因 ； Ｒ 反 应 ； 物 表 达 载体 关 ａｅ ａ 木 Ｌ 植
东北白桦COMT1基因克隆及其植物表达载体构建
东北白桦COMT1基因克隆及其植物表达载体构建摘要：采用同源克隆法结合cDNA末端快速扩增（RACE）技术克隆东北白桦（Betula platyphylla）咖啡酸/5-羟基阿魏酸-O-甲基转移酶（COMT）基因COMT1，测序结果显示东北白桦COMT1 cDNA序列全长1 367 bp（GenBank登录号：KC292201），其中完整编码区长度1 095 bp，编码365个氨基酸。
利用Gateway技术分别构建了东北白桦COMT1植物过量表达和反义表达载体。
关键词：东北白桦（Betula platyphylla）；咖啡酸/5-羟基阿魏酸-O-甲基转移酶（COMT）；克隆；载体构建木质素（Lignin）是酚类多聚体，其在植物体内的含量仅次于纤维素[1，2]。
因聚合前单体（香豆醇、松柏醇、芥子醇）不同，木质素可分为紫丁香基木质素（S型木质素）、愈创木基木质素（G型木质素）和对-羟基苯基木质素（H型木质素）3种。
裸子植物木质素主要为G型，双子叶植物主要含G型和S型木质素，单子叶植物则含G型、S型和H型木质素[3]。
木质素的生物合成分为3个阶段：光合同化产物形成苯丙氨酸，苯丙氨酸代谢生成木质素单体以及单体聚合形成不同类型的木质素。
木质素单体合成途径中存在多种代谢关键酶类，如苯丙氨酸氨解酶（Phenylalanine ammonia-lyase，PAL），阿魏酸-5-羟基化酶（Ferulate 5-hydroxylase，F5H），咖啡酸/5-羟基阿魏酸-O-甲基转移酶（Caffeic acid-O-methyltransferase，COMT），咖啡酰辅酶-A-O-甲基转移酶（Caffeoyl-CoAO-methyltransferase，CCoAOMT）和肉桂酰CoA还原酶（Cinnamoyl-CoA reductase，CCR）等，该途径也是目前木质素调控研究的重点[4，5]。
COMT催化咖啡酸、5-羟基松柏醛和5-羟基松柏醇甲基化分别生成阿魏酸、芥子醛和芥子醇，参与S型木质素的合成，裸子植物中COMT只催化咖啡酸[6]。
几种植物转基因表达载体的构建方法
Approaches of Constructing Expressional Vectors Utilized in
Plant Genetic Transformation
LIN Chun -jing1 ,WEI Zheng -yi1 , CAI Qin -an1 , HOU Jing -yao1 , 2 , XING Shao -chen1 ＊
(1 .Biotechnology Research Center, Jilin Academy of Agricultural S ciences , Changchun 130033 , China; 2 .Institute of Genent ics and Cytology, Northeast Normal University , Changchun 130024 , China)
2008 年 18(5) 生 物 技 术 85
随着植物基因 工程 技术 的发展 , 适 合于 不同 研究 目 的各 种载体系统应运而 生 , 其 中在 转基 因植物 中最 常用的 是 质粒
载体 。 在为某种特定的 植物 构建 表达载 体时 , 为 了使 外 源基 因高效 、安全表达 , 或 由于特 定的 要求 , 需要 构建 新载 体 或改 造已有载体 , 而选 择 一种 合适 的 载体 构 建方 法 , 从 而 达到 方 便 、快捷的目的就 显得 十分 重要 。 鉴 于目前 还没 有关 于 对载 体构建技术方面的总结 , 在收集 整理前人工 作的基 础上 , 本文 选择介绍了其中几 种具有 代表 性的策 略 , 对其 适用的 情 况作 了阐述 , 进而指出它们的应用潜 力和主要应 用领域 , 期望 对实 际操作起到借鉴作用 。
基于Gateway技术的植物表达载体的构建
基于Gateway技术的植物表达载体的构建郭姗姗;张蒙;单卫星【摘要】[目的]为方便基于植物瞬时表达技术的高通量功能基因筛选,利用Gateway技术实现植物表达载体和表达文库的构建,将35S启动子和Gateway技术入门载体pDONR222的同源重组区连接到植物表达载体pCAMBIA0380上,构建Gateway技术兼容的植物表达载体.[方法]分别扩增35S启动子与pDONR222上attP特异识别序列之间的功能区,并将其依次连人根癌农杆菌(Agrobacterium tume faciens)介导的植物表达载体pCAM-BIA0380的多克隆位点区,利用带有attB特异识别区域的GUS基因,对构建的载体功能进行测试.[结果]成功构建了基于Gateway技术的植物表达载体p1104D;载体重组基因的选择性测试结果表明,p1104D对目的基因片段的大小无严格选择性;载体重组效率测试结果表明,p1104D重组平均滴度为5.11×105cfu/mL;GUS报告基因瞬间表达试验结果表明,改造后的载体可以实现目标基因的顺利表达.[结论]基于Gateway技术的植物表达载体p1104D的构建,为实现cDNA文库的高效构建和目标基因的高通量功能筛选提供了可能,有望推动植物-病原互作研究中关键基因的鉴定与克隆.【期刊名称】《西北农林科技大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2010(038)011【总页数】7页(P161-166,172)【关键词】Gateway技术;植物表达载体;瞬时表达;功能克隆【作者】郭姗姗;张蒙;单卫星【作者单位】西北农林科技大学生命科学学院,陕西,杨凌,712100;西北农林科技大学植物保护学院,陕西,杨凌,712100;西北农林科技大学植物保护学院,陕西,杨凌,712100;西北农林科技大学植物保护学院,陕西,杨凌,712100;陕西省农业分子生物学重点实验室,陕西,杨凌,712100【正文语种】中文【中图分类】Q785由Invitrogen公司开发的Gateway技术是一种通用型克隆方法，其基于λ噬菌体位点特异性重组系统，利用位点特异重组构建入门载体［1－3］，整个过程没有限制性内切酶和连接酶的参与。
花椰菜ERF114基因的克隆及Gateway技术构建表达载体
西"表$学&2018年31卷6期1128 Southwest China Journal of Agricultural Sciences Vol. 31 No. 6文章编号：1001 -4829(2018)6-1128-07D O I：10. 16213/j. cnki. scjas. 2018. 6. 006花椰菜；基因的克隆及Gateway技术构建表达载体韩占品\任健2,于玮玮\范夕玲\李慧“(1.天津农学院园艺园林学院，天津300384 $2.天津农学院基础科学学院，天津300384)摘要：【目的】为进一步探究花椰菜；基因功能，从花椰菜中克隆；R9J:基因并构建植物表达载体。
【方法】利用RT-P C R技术从花椰菜中分离；?9J:基因；通过生物信息学软件对E R]14蛋白特性进行预测和分析；采用Gateway技术构建 基因的植物表达载体。
【结果】克隆获得了花椰菜；R9J:基因，其全长为681 b p,编码226个氨基酸，具有1个A P2结构 域。
生物信息学分析显示，该蛋白质为亲水性蛋白，有1个跨膜区域，二级结构以！螺旋折叠和无规则卷曲结构为主。
进化树分析表明，花椰菜；与油菜的亲缘关系最近。
同时成功构建了植物表达载体。
【结论】成功克隆了花椰菜；R9J:基因，对其进行生物信息学分析，并构建其表达载体,为探究花椰菜基因功能及分子调控机制奠定了基础。
关键词：花椰菜%;% AP2/ERF % Gateway克隆技术；生物信息学中图分类号:S635.3 文献标识码：ACloning of Cauliflower ERF 114Gene and Constructionof Its Expression Vector by GatewayH ANZhan折in1%R E N Jian2 %YUW ei-wei1%FANXi-ling1%LI Hui1!(1. College of Horticulture a nd Landscape Architecture, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300384, China；2. College of Basic Sciences ,Tianjin Agricultural University, Tianjin 300384 , China)A b stract:& Objective】In order to further explore the function of cauliflower ；H9114 gene, ；H9114 gits plant expression v ector was constructed. & Method 】；H9114 gene fromcauliflower by RT-PCRtechnology was isolated, and the character-istics of ERF114 protein by bioinformatics software were predicted and analyzed, and the plant expression vector of ；H9 technology was constructed. &Result】；H9114 gene of cauliflower was cloned, and its length was 681 b p, encoding 226 amino acids with aAP2 domain. Bioinformatics analysis showed that the protein encoded by the gene was a hydrophilic protein with and the secondary structure was mainly composed of alpha helix, beta fold and irregular coiled structure. Phylogenetic that the relationship b etween cauliflower ERF114 and rape was the closest, meanwhile its plant expression vector was successfully constriac-ted. & Conclusion】The cauliflower ；H9114 gene was successfully cloned, its bioinformatics was analyzed, and its expression vectors wereconstructed, which laid a soli(d foundation for furtlier exploring the function and molecular mechanism of cauliflower ERF114gene.Key w ords: Cauliflower $；H9114 $A P2/ER F; Gateway cloning technology; Bioinformatics【研究意义】花椰菜，又称菜花、花菜或椰菜花, 是十字花科芸薹属一年生植物，是世界上最重要的 蔬菜作物之一,其营养价值和药用价值极高,在消费 市场占有重要地位。
利用Gateway克隆技术构建丹参SmNAC1转录因子的RNAi表达载体
利用Gateway克隆技术构建丹参SmNAC1转录因子的RNAi表达载体NAC转录因子参与植物生长发育和对生物和非生物胁迫的应答反应，利用Gateway克隆技术构建丹参NAC转录因子的RNAi植物表达载体，以便进一步研究丹参NAC转录因子的功能。
根据Gateway技术要求，设计含有attB接头的引物，使用NEB的Phusion超保真聚合酶，通过PCR方法，扩增SmNAC1基因的特异性片段。
通过BP重组反应，将带有attB接头的PCR产物克隆到入门载体pENTR/SD/D-TOPO上，再通过LR重组反应，利用入门载体上的SmNACi 特异性基因片断克隆到植物表达载体pK7GWIWG2D上。
实验结果表明Gateway 载体的构建方法能够高效、快速地将目的基因克隆到表达载体上，为植物基因转化提供基础。
标签：RNAi；Gateway载体；BP和LR反应Gateway克隆技术是由invitrogen公司开发，基于λ噬菌体的位点特异性重组原理[1-2]，可以使DNA片段在不同的克隆载体之间实现转移，并保持基因定位和阅读框架不发生改变。
λ噬菌体的位点特异性重组是在噬菌体和细菌的整合因子（INF，Int）的作用下，λ噬菌体的attP位点和大肠杆菌基因组的attB位点可以发生定点重组，λ噬菌体DNA整合到大肠杆菌的基因组DNA中，两侧产生2个新位点：attL，attR。
这是一个可逆的过程，在噬菌体编码蛋白Xis和细菌的整合因子IHF，Int的共同介导下这两个新位点可以再次重组回复为attB，attP位点。
这一过程受编码蛋白Xis和整合因子（IHF，Int）调控。
与经典基因克隆多个步骤相比，Gateway技术不用依赖限制性内切酶，而靠载体上存在的特定重组位点和重组酶，高效、快速地将目的基因克隆到表达载体（destination vector，目的载体）上，该方法只需一步生化反应便能达到目的，是高通量克隆基因的好方法。
基于Gateway技术的植物表达载体的构建
１ ６ ２
西北农林科技大学学报 （ 自然科学版 ）
第３ ８卷
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５ ／ 无严格选择性； 载体 重 组 效 率 测 试 结 果 表明 ， １ １×１ ０ ｃ ｆ ｕ ｍ Ｌ； Ｇ Ｕ Ｓ 报告基因瞬间表达试 １ １ ０ ４ Ｄ 重 组 平 均 滴 度 为 ５． ｐ
验结 果 表明 ， 改 造 后 的载体 可 以 实 现 目 标 基因的 顺 利 表达 。【 结 论 】基 于 Ｇ １ １ ０ ４ Ｄ 的构 ａ ｔ ｅ ｗ ａ ｙ技 术 的 植 物 表 达 载 体 ｐ 建， 为实现ｃ 有 望 推 动 植 物 －病 原 互 作 研 究 中 关 键 基 Ｄ ＮＡ 文 库 的 高 效 构 建 和 目 标 基 因 的 高 通 量 功 能 筛 选 提 供 了 可 能 ， 因的 鉴 定 与 克隆 。 ［ 关键词 ］ 植 物 表达载体 ； 瞬 时表达 ； 功能克隆 ａ ｔ ｅ ｗ ａ Ｇ ｙ技 术 ； ［ 中图分 类号 ］ ７ ８ ５ Ｑ ［ 文 献标识码 ］ Ａ ［ （ ） 文 章 编 号］ ６ ７ １ ９ ３ ８ ７ ２ ０ １ ０ １ １ ０ １ ６ １ ０ ６ １ － － －
利用Gateway技术构建黄瓜HPL基因的RNA干扰载体_王聪颖
西北农业学报 ２０１３，２２（２）：１５２－１５８Ａｃｔａ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｅ Ｂｏｒｅａｌｉ－ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ Ｓｉｎｉｃａ利用Ｇａｔｅｗａｙ技术构建黄瓜ＨＰＬ基因的ＲＮＡ干扰载体王聪颖，陈书霞，陈 巧，郝丽宁，孟焕文，万旭花，申晓青，程智慧（西北农林科技大学园艺学院，农业部西北地区园艺作物生物学与种质创制重点实验室，陕西杨凌７１２１００）摘 要 为探讨黄瓜脂氢过氧化物裂解酶基因（ＨＰＬ）下调表达对黄瓜果实挥发性醛类物质合成的影响，设计１对特异引物，以黄瓜ｐＤＯＮＲ２０１－ＨＰＬ质粒为模板，通过ＰＣＲ扩增出３２３ｂｐ的片段。
利用基于同源重组原理的Ｇａｔｅｗａｙ技术，将扩增的片段通过ＢＰ反应连接到入门载体ｐＤＯＮＲ２０１中。
对扩增出的３２３ｂｐ的片段进行测序，测序结果显示该序列与原序列同源性为１００％。
在此基础上，通过ＬＲ反应将目的片段插入过表达的植物ＲＮＡ干涉载体ｐＨｅｌｌｓｇａｔｅ８，构建黄瓜ＨＰＬ基因的ＲＮＡｉ表达载体ｐＨｅｌｌｓｇａｔｅ８－ＨＰＬｉ，分别经限制性内切酶ＸｈｏⅠ、ＸｂａⅠ酶切后获得３２３ｂｐ的片段，与预期结果一致。
采用热击法将ｐＨｅｌｌｓｇａｔｅ８－ＨＰＬｉ转化农杆菌ＧＶ３１０１，经菌液ＰＣＲ扩增获得３２３ｂｐ的目的条带，表明ＲＮＡｉ表达载体ｐＨｅｌｌｓｇａｔｅ８－ＨＰＬｉ已成功转入农杆菌中。
关键词 黄瓜；ＨＰＬ基因；ＲＮＡｉ干扰；克隆载体；表达载体；Ｇａｔｅｗａｙ技术中图分类号 Ｑ９４３．２；Ｓ６４２．２ 文献标志码 Ａ 文章编号 １００４－１３８９（２０１３）０２－０１５２－０７Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ＲＮＡｉ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ＨＰＬＧｅｎｅｏｆ Ｃｕｃｕｍｂｅｒ Ｕｓｉｎｇ Ｇａｔｅｗａｙ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＷＡＮＧ Ｃｏｎｇｙｉｎｇ，ＣＨＥＮ Ｓｈｕｘｉａ，ＣＨＥＮ Ｑｉａｏ，ＨＡＯ Ｌｉｎｉｎｇ，ＭＥＮＧ Ｈｕａｎｗｅｎ，ＷＡＮ Ｘｕｈｕａ，ＳＨＥＮ Ｘｉａｏｑｉｎｇ ａｎｄ ＣＨＥＮＧ Ｚｈｉｈｕｉ（Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒｅ，Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔ Ａ＆Ｆ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒａｌ ＰｌａｎｔＧｅｒｍｐｌａｓｍ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｉｎ Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔ Ｃｈｉｎａ，Ｙａｎｇｌｉｎｇ Ｓｈａａｎｘｉ ７１２１００，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｉｎ ｏｒｄｅｒ ｔｏ ｐｒｏｂｅ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｄｏｗｎ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＨＰＬｇｅｎｅ ｏｎ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆｖｏｌａｔｉｌｅ ａｌｄｅｈｙｄｅｓ ｉｎ ｃｕｃｕｍｂｅｒ，ａ ３２３ｂｐ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｗａｓ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｂｙ ＰＣＲ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｗｉｔｈ ｔｈｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｉｍｅｒｓ ａｎｄ ｕｓｉｎｇ ｃｕｃｕｍｂｅｒ ｐＤＯＮＲ２０１－ＨＰＬ ｐｌａｓｍｉｄ ａｓ ａ ｔｅｍｐｌａｔｅ．Ｔｈｅ ｆｒａｇｍｅｎｔｗａｓ ｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｐＤＯＮＲ２０１ｖｅｃｔｏｒ ｖｉａ ＢＰ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｏｆＧａｔｅｗａｙ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．Ｉｔ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｗａｓ ｔｏｔａｌｌｙ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ｗｉｔｈｔｈａｔ ｏｆ ＨＰＬｇｅｎｅ．Ｔｈｅｎ ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｗａｓ ｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｄｅｓｔｉｎａｔｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ ｐＨｅｌｌｓ－ｇａｔｅ８ｖｉａ ＬＲ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｔｏ ｆｏｒｍ ＲＮＡｉ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ ｐＨｅｌｌｓｇａｔｅ ８－ＨＰＬｉ，ｗｈｉｃｈ ｗａｓ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ ｒｅ－ｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｚｙｍｅ ＸｈｏⅠａｎｄ ＸｂａⅠａｎｄ ｉｔ ｗａｓ ｃｏｎｓｉｓｔｅｎｔ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｅｘｐｅｃｔａｔｉｏｎ．Ｔｈｅ ｐｌａｓｍｉｄ ｏｆ ｐＨｅｌｌｓ－ｇａｔｅ８－ＨＰＬｉ ｗａｓ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ ｉｎｔｏ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｔｒａｉｎ ＧＶ３１０１ｂｙ ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ ａｎｄ ｔｈｅ ３２３ｂｐ ｆｒａｇ－ｍｅｎｔ ｗａｓ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ｂａｃｔｅｒｉａ ｌｉｑｕｉｄ ＰＣＲ．Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ Ｃｕｃｕｍｂｅｒ；ＨＰＬｇｅｎｅ；ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ；Ｃｌｏｎｉｎｇ ｖｅｃｔｏｒ；Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ；Ｇａｔｅｗａｙｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ＊收稿日期：２０１２－０５－１７ 修回日期：２０１２－０６－１４基金项目：国家自然科学基金（３１０７１８１３）；高校基本科研业务费（ＱＮ２０１１０８８）；西北农林科技大学国际合作基金（Ａ２１３０２１１０２）；陕西省留学人员科技活动项目择优资助经费（Ａ２８９０２１２０２）。
Gateway_载体构建
Gateway技术特点：
通过去除冗长的亚克隆步骤节省操作时间，同时将目的 基因转移到多个表达系统，在任何选择的表达系统如细菌， 酵母，昆虫，或哺乳动物进行基因的分析表达。
Gateway技术的灵活性：
Gateway技术的原理
Gateway的原理也是建立在噬菌体DNA定点整合到细菌宿 主基因组上。在噬菌体和细菌的整合因子（INF、Int）的 作用下，lambda的attP位点和大肠杆菌基因组的attB位点 可以发生定点重组，lambda噬菌体DNA整合到大肠杆菌 的基因组DNA中，两侧产生两个新位点：attL和attR。这 是一个可逆的过程，如果在一个噬菌体编码蛋白Xis和IHF、 Int的共同介导下这两个新位点可以再次重组回复为attB和 attP位点，噬菌体从细菌基因组上裂解下来。这一过程的 方向是受控于两个重要因素：存在的介导蛋白和重组位点。
BP重组装入入门载体
1:添加attB接头的PCR 以携带目的基因质粒为模板 ，加含部分接头的基 因特异性引物,进行第一轮PCR 2 :取第一轮的PCR产物做模板，加入通用引物，进行第二轮 3：PCR产物的纯化
4：BP重组反应
BP重组反应
Components Sample attB-PCR product （>10ng） 1-7ul pENTR vector (150 ng/ul) 1ul 5X BP Clonase Clonase enzyme mix 2ul TE Buffer, pH 8.0 to 10ul
Gateway技术 克隆、表达新方法
Gateway技术
Gateway技术：
一种克隆操作平台：把目的基因克隆到入门载体（Entry Vector）后，就不用依赖限制性内切酶，而靠载体上存在 的特定重组位点和重组酶，高效、快速地将目的基因克隆 到其它的受体载体（Destination Vector，目的载体）上。
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基于 Ｇ ａ ｔ ｅ ｗ ａ ｙ 技 术 的植物 表达载 体的 构 建
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（ ） 陕西 杨凌 ７ 陕西 杨凌 ７ １ 西北农林科技大学 ａ 生 命 科学学 院 ， ｂ 植物保护学院， １ ２ １ ０ ０； ２ 陕 西 省 农 业 分子 生 物 学 重点 实 验 室 ， １ ２ １ ０ ０
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第３ ８卷
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第３ ８卷 第１ １期 ２ ０ １ ０年１ １月
西北农林科技大学学报 （ 自然科学版 ） （ ） Ｊ ｏ ｕ ｒ ｎ ａ ｌ ｏ ｆ Ｎ ｏ ｒ ｔ ｈ ｗ ｅ ｓ ｔ Ａ＆Ｆ Ｕ ｎ ｉ ｖ ｅ ｒ ｓ ｉ ｔ Ｎ ａ ｔ ． Ｓ ｃ ｉ ． Ｅ ｄ ． ｙ
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＊ ［ 收 稿日 期 ］ ０ １ ０ ０ ４ １ ９ ２ － － ［ ” ） ； ） 基 金项 目 ］ 计 划 项 目（ 高 等 学 校 学科 创新引 智 计 划 项 目 （ ９ ７ ３ ２ ０ ０ ６ Ｃ Ｂ １ ０ １ ９ ０ １ Ｂ ０ ７ ０ ４ ９ 科技 部 “ ［ ， ： 作 者简介 ］ 女， 山东青岛人， 在 读硕 士 ， 主 要从事 植 物 免疫 学 研究 。Ｅ－ｍ １ ９ ８ ５－ ） ａ ｉ ｌ ｓ ｈ ｓ ｈ ２ ０ ０ ６＠ｇ ｍ ａ ｉ ｌ ． ｃ ｏ ｍ 郭 姗姗 （ ｇ ［ ， ： 通 信 作 者］ 男， 新疆伊犁人， 教授 ， 博士生导师， 主 要从事 植 物 免疫 学 研究 。Ｅ－ｍ １ ９ ６ ７－ ） ａ ｉ ｌ ｗ ｘ ｓ ｈ ａ ｎ ｗ ｓ ｕ ａ ｆ ． ｅ ｄ ｕ． ｃ ｎ 单 卫 星（ ＠ｎ
５ ／ 无严格选择性； 载体 重 组 效 率 测 试 结 果 表明 ， １ １×１ ０ ｃ ｆ ｕ ｍ ０ ４ Ｄ 重 组 平 均 滴 度 为 ５． ｐ
验结 果 表明 ， 改 造 后 的载体 可 以 实 现 目 标 基因的 顺 利 表达 。【 结 论 】基 于 Ｇ １ １ ０ ４ Ｄ 的构 ａ ｔ ｅ ｗ ａ ｙ技 术 的 植 物 表 达 载 体 ｐ 建， 为实现ｃ 有 望 推 动 植 物 －病 原 互 作 研 究 中 关 键 基 Ｄ ＮＡ 文 库 的 高 效 构 建 和 目 标 基 因 的 高 通 量 功 能 筛 选 提 供 了 可 能 ， 因的 鉴 定 与 克隆 。 ［ 关键词 ］ 植 物 表达载体 ； 瞬 时表达 ； 功能克隆 ａ ｔ ｅ ｗ ａ Ｇ ｙ技 术 ； ［ 中图分 类号 ］ ７ ８ ５ Ｑ ［ 文 献标识码 ］ Ａ ［ （ ） 文 章 编 号］ ６ ７ １ ９ ３ ８ ７ ２ ０ １ ０ １ １ ０ １ ６ １ ０ ６ １ － － －
ｃ ｉ ｅ ｎ ｓ ｅ ｄ ｉ ａ ｔ ｅ ｄ ｅ ｘ ｒ ｅ ｓ ｓ ｉ ｏ ｎ ｖ ｅ ｃ ｔ ｏ ｒ ｍ ａ ｋ ｅ ｓ ｉ ｔ ｔ ｏ ｃ ｏ ｍ ｂ ｉ ｎ ｅ ｃ Ｄ ＮＡ ｌ ｉ ｂ ｒ ａ ｒ ｃ ｏ ｎ ｓ ｔ ｒ ｕ ｃ ｔ ｉ ｏ ｎ ａ ｎ ｄ ｈ ｉ ｈ ｌ ａ ｎ ｔ ｏ ｓ ｓ ｉ ｂ ｌ ｅ －ｍ ｐ ｙ ｇ ｐ ｐ
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