细胞工程复习资料

第二章

一.实验室的常规设备:

天平冰箱酸度计离心机水纯化装置可调式微量移液器磁力搅拌器水浴锅或微波炉.

二．实验材料的灭菌方法

物理方法

1.热力灭菌，干热湿热

2.辐射灭菌:常用紫外线灭菌(紫外灯)

3.过滤灭菌，孔径0.45或0.20微米

0.20微米滤膜除去病毒以外的所有微生物

0.45微米滤膜可过虑酶系或小量液体培养基

化学方法(化学药物灭菌)

1、含氯化合物:常用的为漂白粉、0.1%氯化汞、次氯酸钠。

2、过氧化物:3%一6%双氧水，0、2%过氧乙酸

3、醇类:70%乙醇。

4、季胺盐类:常用0.1%-0.5%新洁尔溶液

5、酚类:35%有炭酸或煤酚皂

6，醛类:甲醛30%-35%

三．灭菌

1.培养基灭菌

某些激素、维生素等不耐高温高压灭菌的采用过滤灭菌

若采用高压蒸汽灭菌（121℃，15-40min），具体操作方法：

（1）洗涤（2）配制培养基并分装包扎（3）装水，在高压灭菌锅内装水至淹没电热丝。（4）装物品（5）灭菌

注意：先打开放气闸，再打开锅盖（避免锅内压力大而爆炸）

2.玻璃器皿灭菌

干热灭菌：160-180℃，1.5h-2.0h；湿热灭菌：121℃，20-40min

操作步骤：

（1）洗涤（2）包扎（3）灭菌

3.金属用具灭菌

用前干热灭菌：160-180℃，1.5h-2h；用前湿热灭菌：121℃，20-30min

接种前酒精棉擦拭，浸入95%酒精灯中，并在酒精灯火焰上灼烧灭菌

4.接种室灭菌

紫外灯照射：波长260nm，距离小于1.2m，20-30min。

接种台喷雾消毒：75%酒精

四.培养条件

1.光照分为光照强度、光质、光周期。

光照强度:光照强度较强，幼苗生长粗壮，光照强度较弱，幼苗容易徒长

光质:光质对愈伤组织诱导、培养组织的增殖以及器官的分化都有明显的影响光周期:最常用的是16h光照、8h黑暗。（对短日照敏感品种的器官组织，在短日照下易分化，而在长日照下产生愈伤组织。）

2.温度:大多数植物组织培养都是在23-27℃进行

3.湿度:培养容器内的湿度条件，容器内主要受培养基水分含量和封口材料的影响及琼脂含量的影响。环境的相对湿度一般要求70~80%。

4.pH值不同的植物对培养基最适pH值的要求也是不同的，大多在

5.5-

6.5左右，一般培养基5.8。（注：高温灭菌会降低 0.2-0.3个PH值）

5.培养基中的盐类及蔗糖会影响到渗透压的变化。1-2个大气压对植物生长有促进作用，2个以上对生长阻碍，5-6个植物生长完全停止，大于6个植物细胞不能生存。

5.通气条件，氧气是组织培养中必需的因素，瓶盖紧闭时要考虑通气条件，可用附有滤气膜的封口材料。（通气最好的是棉塞封闭瓶口）

五．离体培养的营养需求

用于离体培养的培养基至少包括无机盐类、有机化合物类、植物激素及其他附加成分。

1.无机盐类包括大量元素和微量元素

（1）大量元素指浓度大于0.5mmol/L的元素，有N P K Mg S Ca等

N 制备培养基时以NO3-N和NH4-N两种形式添加，常用添加物质有KNO3或NH4NO3等。

P 常用的物质有KH2PO4或NaH2PO4等

K 常以KCL或KNO3等盐类提供。

Mg、S、Ca 常以MgSO4.7H2O和CaCL2.H2O形式提供。

（2）微量元素指浓度小于0.5mmol/L的元素，有Fe B Mn Cu Mo Co等

第三章

一.名词解释

1、单细胞培养:从植物器官、愈伤组织或悬浮培养物中游离出单个细胞，在无菌条件下，进行体外生长、发育的技术

2、看护培养:也称饲喂培养，是指用一块愈伤组织或植物离体组织看护单细胞使其生长并增殖的一种单细胞培养方法

3、植板率:植板率是平板培养中常用的一个术语，它以长出的细胞团的单细胞在接种细胞中所占的百分数来表示

植板率=每个平板中新形成的细胞团数/每个平板中接入的细胞数×100%

4.胞质杂种:融合细胞在发育过程中亲本之一的染色体组全部被排斥掉，细胞核中只有一个白亲本的全套染色体，但细胞质是双亲的

5.原生质体：指除去细胞壁的细胞或是说一个被质膜所包围的裸漏细胞。

6.原生质体融合:也就是体细胞融合，它是相对有性杂交而言的，它是指把两种不同种和不同属、不同科生物体细胞的原生质体分别分离出来，再用一定的技术融合成一个新的杂种

二.原生质体的分离过程

分离方法有机械法分离和酶解法分离

酶解法：

分离植物原生质体的酶制剂主要有：纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶、离析酶。渗透压的调节是保证原生质体完整性的前提。常用的稳定剂∶甘露醇、山梨醇、蔗糖、葡萄糖、麦芽糖等，浓度为0.4-0.8mol/L，本系统还可以促进分离的原生质体再生细胞壁并继续分裂。（或：盐溶液系统：包括KCL、MgSO4、KH2PO4，优点是获得的原生质体不受生理状态的影响）

酶解法分离原生质体（1）两步分离法

（2）一步分离法具体：若用叶片作为材料，取已展开的生活叶片，用0.53%次氯酸钠和70%酒精进行表面灭菌，然后切成2cm见方的小块。把4 g叶组织置

于含有200 mL不加蔗糖和琼脂的培养基500 mL三角瓶中。在4℃黑暗条件下培养16～24 h，以后叶片转人含有纤维素酶、果胶酶、无机盐和缓冲液的混合液中，p值为5.6，通常在酶液中使用的等渗剂为0.55～0.6 mol/L甘露醇。然后，抽真空使酶液渗入叶片组织。在28℃条件下，40 r/min的旋转式转床上培养4h 后，叶片组织可完全分离。若用悬浮培养细胞，可不经过果胶醉处理，因为悬浮细胞液主要由单细胞和小细胞团组成。取悬浮细胞放入10 mL的梅液中（3%纤维，14%蔗糖，pH值

5.0～

6.0)，在25～33℃条件下酶解24 h。原生质体-酶混合液用30μm的尼龙网过滤，通过低速离心收集原生质体。

二.原生质体活力的测定

1.形态识别:形态上完整，含有饱满的细胞质，颜色新鲜的原生质体即为存活的

2.染色识别：荧光素双醋酸酯(FDA)染色法:取纯化后的植物原生质体悬浮液0.5ml置于小试管中，加入含2mg/L的FDA的丙酮溶液，使最终浓度为0.01%，混匀，放置5分钟，荧光显微镜观察，有活力原生质体发绿色荧光，不产生荧光为无活力。对于叶肉、子叶、下胚轴而言，由于叶绿素的关系，原生质体发黄绿色荧光的为有活力的，发红色为没有活力的。

三.原生质体的培养方法

1.液体浅层培养法

2.平板培养法

3.悬滴培养法

4.双层培养法

5.饲喂层培养法双层培养法的过程

固体培养和液体培养浅层培养相结合的方法，效果最佳。原生质体采用平板培养方法包埋在培养皿底层，上面再加入相同成分的液体培养基，暗培养。需更换新鲜液体培养基。特点:原生质体分布均匀，有利于分裂，易获单细胞株系，能除去抑制分裂的有害物质，细胞植板率高。原生质体易受热伤害，易破碎。缺点：不宜观察细胞的发育过程。

四．原生质体发育与植株再生

包括（1）细胞壁的再生（2）细胞分裂和生长（3）愈伤组织形成（4）植株再生

五、原生质体融合的方法:

1.NaNO3诱导融合。

2.高ph值高Ca2+诱导融合。

3.PEG 诱导融合。

4.电融合法。

5.微滴培养与单细胞融合技术

六、PEG诱导融合优缺点，特点

①先制备融合亲本的原生质体，再将高密度的亲本双方原生质体(仍停留在酶溶液中)各

取0.5mL混合在一起，m酶洗液1000/min离心4min。

2吸去磨液，如上再重复洗一次，将沉淀的原生质体悬浮于1.0mL原生质体培养液中。3放一滴液态硅于60 mm×15 mm培养血中，再放一片方形载玻片(22 mm ×22 mm)于液态硅滴之上。

④滴3滴混合双亲的原生质体于上述载片上，静置5 min，让其在载玻片上形成薄薄的一层。

⑤缓缓小心地加入含相对分子质量在1500～1600的PEG的融合液0.45 mL于上述的原生质体小滴的中央，盖上培养皿盖。

⑥让在PEG融合液中的原生质体在室温下静置10～20 min。

⑦用移液管轻轻加入2～3滴高Ca+、高pH液于中央，静置10～15 min。