非连续性两步法培养雨生红球藻生产虾青素的方法与相关技术

本技术公开了非连续性两步法培养雨生红球藻生产虾青素的方法，在室内培养和室外诱导培养之间，增加如下步骤：步骤一、改变培养条件，将室内培养得到的雨生红球藻游动营养细胞转变为不动营养细胞；步骤二、收集并浓缩步骤一中所得藻液，加入抗生素和/或防腐剂，低温冷藏；步骤三、除去冷藏后的藻液中的抗生素和/或防腐剂，加入稀释的培养基，在弱光照条件下通气培养，对所述不动营养细胞进行活化。

本技术的方法能够在室外诱导培养中断的情况下，将室内培养的营养细胞进行浓缩储藏，在气候适宜的时候，将储藏的营养细胞快速活化并进行室外诱导培养，以大幅缩短整体培养周期，提高设备利用率和生产率，从而提高生产的稳定性。

权利要求书
1.非连续性两步法培养雨生红球藻生产虾青素的方法，其特征在于，在室内培养和室外诱导培养之间，增加如下步骤：
步骤一、改变培养条件，将室内培养得到的雨生红球藻游动营养细胞转变为不动营养细胞；步骤二、收集并浓缩步骤一中所得藻液，加入抗生素和/或防腐剂，低温冷藏；
步骤三、除去冷藏后的藻液中的抗生素和/或防腐剂，加入稀释的培养基，在弱光照条件下通气培养，对所述不动营养细胞进行活化。

2.如权利要求1所述的非连续性两步法培养雨生红球藻生产虾青素的方法，其特征在于，所述室内培养具体为：将雨生红球藻藻种置于BG11培养基中进行培养，初始接种量为5～30万个细胞/ml，培养温度为15～25℃，白色荧光灯24小时连续单侧光照，光照强度为50～
100μE/m2/s，pH为7.0～8.0，培养7～15天，游动营养细胞比例为80～100％。

3.如权利要求1所述的非连续性两步法培养雨生红球藻生产虾青素的方法，其特征在于，所述步骤一，具体为：将室内培养的温度提升至28-35℃和/或将pH提高至8.5-9.5，继续培养1-5
天，当90％以上游动营养细胞转变为不动营养细胞时，停止培养。

4.如权利要求3所述的非连续性两步法培养雨生红球藻生产虾青素的方法，其特征在于，所述步骤二，具体为：将步骤一中所得藻液进行沉降浓缩后，离心，去除上清液，向所得藻泥中加入防腐剂溶液和/或抗生素溶液，震荡混匀，在4℃下进行储藏，储藏周期为2～12周，其中，所述防腐剂溶液和/或抗生素溶液用灭菌水配制，经过滤除菌后，再加入所述藻泥中，所述防腐剂溶液和/或抗生素溶液为乳酸链球菌素溶液、纳他霉素溶液、ε-聚赖氨酸溶液、卡那霉素溶液、硫酸庆大霉素溶液以及山梨酸钾溶液中的一种或几种的混合液。

5.如权利要求4所述的非连续性两步法培养雨生红球藻生产虾青素的方法，其特征在于，所述防腐剂溶液和/或抗生素溶液中，乳酸链球菌素的浓度为0.1～1.0g/L，纳他霉素的浓度为0.1～1.0g/L，ε-聚赖氨酸的浓度为0.1～1.0g/L，卡那霉素的浓度为10～100μg/mL，硫酸庆大霉素的浓度为10～100μg/mL，山梨酸钾的浓度为0.2～2.0g/L。

6.如权利要求4所述的非连续性两步法培养雨生红球藻生产虾青素的方法，其特征在于，所述步骤三，具体为：向储藏后的藻液中加入无菌水，经离心、沉降或过滤，去除其中的抗生素和/或防腐剂，再将所得藻泥按照0.1～1.0g/L的浓度接种到5～20倍稀释的BG11培养基内，在弱光照条件下通气培养，对所述不动营养细胞进行活化，其中，光强为10～50μE/m2/s，温度为20～25℃，pH为
7.0～
8.0，活化培养时间为1～5天。

7.如权利要求1所述的非连续性两步法培养雨生红球藻生产虾青素的方法，其特征在于，所述室外诱导培养，具体为：向藻液中加入10～100mM的醋酸钠缓冲溶液，并置于室外进行诱导培养，其中，室外的光照强度为0～2000μE/m2/s，温度为25～30℃，pH为7.5～8.5，诱导培养周期为5～10天。

技术说明书
非连续性两步法培养雨生红球藻生产虾青素的方法
技术领域
本技术涉及雨生红球藻规模化培养领域。

更具体地说，本技术涉及一种非连续性两步法培养雨生红球藻生产虾青素的方法。

背景技术
雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)是一种单细胞绿藻，该藻能大量累积虾青素而呈现红色，含量可达细胞干重的3～5％，是目前天然虾青素的主要来源。

雨生红球藻的生活史分为营养细胞和厚壁孢子两个阶段：在环境适宜、营养丰富的条件下，雨生红球藻快速生长并分裂繁殖，产生大量带鞭毛游动的营养细胞；当环境条件变得不适宜的时候，游动细胞失去鞭毛，变为不动的营养细胞；在持续的不利环境条件刺激下，如高光照、高盐、营养饥饿等，营养细胞将不再继续分裂繁殖，并通过在细胞内积累大量的虾青素以对抗不利的环境条件，形成红色的厚壁孢子。

根据雨生红球藻的生理特性，通常采用两步法进行规模化培养，即营养细胞培养和诱导培养。

营养细胞的培养通常在室内进行，由于光照、温度等条件可控，可以进行全年连续生产。

诱导培养通常在室外进行，但室外培养条件受气候影响很大，如果出现连续阴雨天气、霜冻、台风等恶劣情况时，虾青素产率会大幅降低甚至出现生产中断。

虽然室内营养细胞培养不受影响，但由于不能进行室外诱导培养，也不得不停产，导致设备利用率低，人工闲置等问题。

另外，当室外培养条件恢复时，由于雨生红球藻生长慢，又不能及时供应充足的营养细胞用于诱导培养，也会导致产量降低。

即传统雨生红球两步法培养工艺在气候条件不适合室外诱导培养时，往往导致整体的停产，而当气候条件恢复正常时，又无法及时提供充足的营养细胞，快速恢复生产，导致产量降低，生产不稳定。

技术内容
本技术的目的是提供一种非连续性两步法培养雨生红球藻生产虾青素的方法，其能够在室外诱导培养中断的情况下，将室内培养的营养细胞进行浓缩储藏，在气候适宜的时候，将储藏
的营养细胞快速活化并进行室外诱导培养，以大幅缩短整体培养周期，提高设备利用率和生产率，从而提高生产的稳定性。

为了实现根据本技术的目的和其它优点，提供了一种非连续性两步法培养雨生红球藻生
产虾青素的方法，在室内培养和室外诱导培养之间，增加如下步骤：
步骤一、改变培养条件，将室内培养得到的雨生红球藻游动营养细胞转变为不动营养细胞；
步骤二、收集并浓缩步骤一中所得藻液，加入抗生素和/或防腐剂，低温冷藏；
步骤三、除去冷藏后的藻液中的抗生素和/或防腐剂，加入稀释的培养基，在弱光照条件下通气培养，对所述不动营养细胞进行活化。

优选的是，所述的非连续性两步法培养雨生红球藻生产虾青素的方法，所述室内培养具体为：将雨生红球藻藻种置于BG11培养基中进行培养，初始接种量为5～30万个细胞/ml，培养温度为15～25℃，白色荧光灯24小时连续单侧光照，光照强度为50～100μE/m2/s，pH为7.0～8.0，培养7～15天，游动营养细胞比例为80～100％。

优选的是，所述的非连续性两步法培养雨生红球藻生产虾青素的方法，所述步骤一，具体为：将室内培养的温度提升至28-35℃和/或将pH提高至8.5-9.5，继续培养1-5天，当90％以上游动营养细胞转变为不动营养细胞时，停止培养。

优选的是，所述的非连续性两步法培养雨生红球藻生产虾青素的方法，所述步骤二，具体为：将步骤一中所得藻液进行沉降浓缩后，离心，去除上清液，向所得藻泥中加入防腐剂溶液和/或抗生素溶液，震荡混匀，在4℃下进行储藏，储藏周期为2～12周，其中，所述防腐剂溶液和/或抗生素溶液用灭菌水配制，经过滤除菌后，再加入所述藻泥中，所述防腐剂溶液和/或抗生素溶液为乳酸链球菌素溶液、纳他霉素溶液、ε-聚赖氨酸溶液、卡那霉素溶液、硫酸庆大霉素溶液以及山梨酸钾溶液中的一种或几种的混合液。

优选的是，所述的非连续性两步法培养雨生红球藻生产虾青素的方法，所述防腐剂溶液和/或抗生素溶液中，乳酸链球菌素的浓度为0.1～1.0g/L，纳他霉素的浓度为0.1～1.0g/L，ε-聚
赖氨酸的浓度为0.1～1.0g/L，卡那霉素的浓度为10～100μg/mL，硫酸庆大霉素的浓度为10～100μg/mL，山梨酸钾的浓度为0.2～2.0g/L。

优选的是，所述的非连续性两步法培养雨生红球藻生产虾青素的方法，所述步骤三，具体为：向储藏后的藻液中加入无菌水，经离心、沉降或过滤，去除其中的抗生素和/或防腐剂，再将所得藻泥按照0.1～1.0g/L的浓度接种到5～20倍稀释的BG11培养基内，在弱光照条件下通气培养，对所述不动营养细胞进行活化，其中，光强为10～50μE/m2/s，温度为20～25℃，pH为7.0～8.0，活化培养时间为1～5天。

优选的是，所述的非连续性两步法培养雨生红球藻生产虾青素的方法，所述室外诱导培养，具体为：向藻液中加入10～100mM的醋酸钠缓冲溶液，并置于室外进行诱导培养，其中，室外的光照强度为0～2000μE/m2/s，温度为25～30℃，pH为7.5～8.5，诱导培养周期为5～10天。

本技术至少包括以下有益效果：提供了一种应对气候变化的更为稳定、高效的雨生红球藻规模化培养工艺，其能够在室外诱导培养中断的情况下，将室内培养的营养细胞进行浓缩储藏，在气候适宜的时候，将储藏的营养细胞快速活化并进行室外诱导培养，以大幅缩短整体培养周期，提高设备利用率和生产率，从而提高生产的稳定性。

本技术的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本技术的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。

具体实施方式
下面结合实施例对本技术做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

需要说明的是，下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

本技术所用BG11培养基参照Stanier的配方，具体为：硝酸钠1.50g/L，磷酸氢二钾0.04g/L，
七水硫酸镁75.0mg/L，二水氯化钙36.0mg/L，柠檬酸6.00mg/L，柠檬酸铁铵6.00mg/L，乙二胺四乙酸1.00mg/L，碳酸钠0.02g/L，硼酸2.86mg/L，氯化锰1.81mg/L，硫酸锌222μg/L，钼酸钠0.39mg/L，硫酸铜79.0μg/L，硝酸钴49.4μg/L。

实施例1：
(1)将雨生红球藻藻种(Haematococcus pluvialis FACHB-712，购买于中科院武汉水生生物研究所)置于BG11培养基进行培养，初始接种量为5万个细胞/ml，培养温度为20℃，白色荧光灯24小时连续单侧光照，光照强度为60μE/m2/s，通入含有0.5～1.5％(v/v)二氧化碳的混合空气进行搅拌，通过调整二氧化碳含量和通气量将藻液pH控制在7.5～7.8，培养8天，藻细胞数达到105万个细胞/ml，游动营养细胞比例为98％。

(2)改变培养条件，将温度提升至30℃，继续培养4天，95％的游动营养细胞转变为不动营养细胞，停止培养。

(3)沉降浓缩后离心去除上清液，得到雨生红球藻藻泥，用灭菌水配制0.15g/L乳酸链球菌素和30μg/mL卡那霉素混合溶液，并过滤除菌，加入到离心后的藻泥中，震荡混匀成悬浊液，在4℃进行储藏，储藏周期为4周。

(4)向储藏后的藻液加入无菌水，使用自然沉降方法去除上清液，再将所得藻泥按照0.5g/L的浓度接种到10倍稀释的BG11培养基内，在弱光照条件下通气培养，进行藻细胞活化，光强为40μE/m2/s，温度为25℃，通入含有0.5～1.5％(v/v)二氧化碳的混合空气进行搅拌，通过调整二氧化碳含量和通气量将藻液pH控制在7.5～7.8，活化培养时间为2天。

在活化过程中镜检发现细菌污染较少，部分藻细胞进入分裂增殖的状态，且漂白细胞数目较少。

(5)藻细胞经过活化后，培养基中的氮源基本消耗殆尽，向藻液中添加醋酸钠，使得藻液中醋酸钠浓度为60mM，并置于室外进行诱导培养，室外的光照强度为0～2000
μE/m2/s，温度为25～30℃，通过调整二氧化碳含量和通气量将藻液pH控制在8.0～8.5，诱导培养周期为7天。

培养结束后收集藻细胞，采用改良的Boussiba方法测定虾青素含量。

结果显示，添加醋酸钠进入诱导过程后，藻细胞迅速积累虾青素，向红色细胞转变，诱导结束后基本所有细胞都转化为红色不动细胞，仅有少量细胞漂白，细菌污染较少，最终的干重为1.8g/L，虾青素含量为3.26％。

实施例2
(1)将雨生红球藻藻种置于BG11培养基进行培养，初始接种量为20万个细胞/ml，培养温度为25℃，白色荧光灯24小时连续单侧光照，光照强度为100μE/m2/s，通入含有0.5～1.5％(v/v)二氧化碳的混合空气进行搅拌，通过调整二氧化碳含量和通气量将藻液pH控制在7.2～7.5，培养7天，藻细胞数达到120万个细胞/ml，游动营养细胞比例为85％。

(2)改变培养条件，将pH提升至9.0，继续培养3天，100％的游动营养细胞转变为不动营养细胞，停止培养。

(3)沉降浓缩后离心去除上清液，得到雨生红球藻藻泥，用灭菌水配制0.3g/L乳酸链球菌素和1.0g/L山梨酸钾混合溶液，并过滤除菌，加入到离心后的藻泥中，震荡混匀成悬浊液，在4℃进行储藏，储藏周期为5周。

(4)向储藏后的藻液加入无菌水，使用自然沉降方法去除上清液，再将所得藻泥按照0.8g/L的浓度接种到5倍稀释的BG11培养基内，在弱光照条件下通气培养，进行藻细胞活化，光强为50μE/m2/s，温度为25℃，通入含有0.5～1.5％(v/v)二氧化碳的混合空气进行搅拌，通过调整二氧化碳含量和通气量将藻液pH控制在7.8～8.0，活化培养时间为3天。

在活化过程中镜检发现细菌污染较少，部分藻细胞进入分裂增殖的状态，且漂白细胞数目较少。

(5)藻细胞经过活化后，培养基中的氮源基本消耗殆尽，向藻液中添加醋酸钠，使得藻液中醋酸钠浓度为50mM，并置于室外进行诱导培养，室外的光照强度为0～2000μE/m2/s，温度为25～30℃，通过调整二氧化碳含量和通气量将藻液pH控制在7.8～8.2，诱导培养周期为7天。

培养结束后收集藻细胞，采用改良的Boussiba方法测定虾青素含量。

结果显示，添加醋酸钠进入诱导过程后，藻细胞迅速积累虾青素，向红色细胞转变，诱导结束后基本所有细胞都转化为红色不动细胞，仅有少量细胞漂白，细菌污染较少，最终的干重
为1.6g/L，虾青素含量为3.32％。

实施例3
(1)将雨生红球藻藻种置于BG11培养基进行培养，初始接种量为10万个细胞/ml，培养温度为20℃，白色荧光灯24小时连续单侧光照，光照强度为50μE/m2/s，通入含有0.5～1.5％(v/v)二氧化碳的混合空气进行搅拌，通过调整二氧化碳含量和通气量将藻液pH控制在7.0～7.3，培养12天，藻细胞数达到150万个细胞/ml，游动营养细胞比例为90％。

(2)改变培养条件，将温度提升至35℃，继续培养1天，92％的游动营养细胞转变为不动营养细胞，停止培养。

(3)沉降浓缩后离心去除上清液，得到雨生红球藻藻泥，用灭菌水配制0.5g/Lε-聚赖氨酸溶液，并过滤除菌，加入到离心后的藻泥中成悬浊液，震荡混匀，在4℃进行储藏，储藏周期为2周。

(4)向储藏后的藻液加入无菌水，使用自然沉降方法去除上清液，再将所得藻泥按照0.8g/L的浓度接种到5倍稀释的BG11培养基内，在弱光照条件下通气培养，进行藻细胞活化，光强为50μE/m2/s，温度为25℃，通入含有0.5～1.5％(v/v)二氧化碳的混合空气进行搅拌，通过调整二氧化碳含量和通气量将藻液pH控制在7.8～8.0，活化培养时间为3天。

在活化过程中镜检发现细菌污染较少，部分藻细胞进入分裂增殖的状态，且漂白细胞数目较少。

(5)藻细胞经过活化后，培养基中的氮源基本消耗殆尽，向藻液中添加醋酸钠，使得藻液中醋酸钠浓度为40mM，并置于室外进行诱导培养，室外的光照强度为0～2000μE/m2/s，温度为25～30℃，通过调整二氧化碳含量和通气量将藻液pH控制在7.5～8.0，诱导培养周期为10天。

培养结束后收集藻细胞，采用改良的Boussiba方法测定虾青素含量。

结果显示，添加醋酸钠进入诱导过程后，藻细胞迅速积累虾青素，向红色细胞转变，诱导结束后基本所有细胞都转化为红色不动细胞，仅有少量细胞漂白，细菌污染较少，最终的干重为1.4g/L，虾青素含量为3.58％。

实施例4
(1)将雨生红球藻藻种置于BG11培养基进行培养，初始接种量为10万个细胞/ml，培养温度为23℃，白色荧光灯24小时连续单侧光照，光照强度为70μE/m2/s，通入含有0.5～1.5％(v/v)二氧化碳的混合空气进行搅拌，通过调整二氧化碳含量和通气量将藻液pH控制在7.0～7.3，培养10天，藻细胞数达到110万个细胞/ml，游动营养细胞比例为92％。

(2)改变培养条件，将温度提升至28℃，pH提升至8.5，继续培养5天，100％的游动营养细胞转变为不动营养细胞，停止培养。

(3)沉降浓缩后离心去除上清液，得到雨生红球藻藻泥，用灭菌水配制0.2g/L纳他霉素、
10μg/mL卡那霉素和30μg/mL硫酸庆大霉素混合溶液，并过滤除菌，加入到离心后的藻泥中，震荡混匀成悬浊液，在4℃进行储藏，储藏周期为9周。

(4)向储藏后的藻液加入无菌水，使用离心方法去除上清液，再将所得藻泥按照0.5g/L的浓度接种到20倍稀释的BG11培养基内，在弱光照条件下通气培养，进行藻细胞活化，光强为
30μE/m2/s，温度为20℃，通入含有0.5～1.5％(v/v)二氧化碳的混合空气进行搅拌，通过调整二氧化碳含量和通气量将藻液pH控制在7.5～7.8，活化培养时间为4天。

在活化过程中镜检发现细菌污染较少，部分藻细胞进入分裂增殖的状态，且漂白细胞数目较少。

(5)藻细胞经过活化后，培养基中的氮源基本消耗殆尽，向藻液中添加醋酸钠，使得藻液中醋酸钠浓度为30mM，并置于室外进行诱导培养，室外的光照强度为0～2000μE/m2/s，温度为25～30℃，通过调整二氧化碳含量和通气量将藻液pH控制在7.5～8.0，诱导培养周期为7天。

培养结束后收集藻细胞，采用改良的Boussiba方法测定虾青素含量。

结果显示，添加醋酸钠进入诱导过程后，藻细胞迅速积累虾青素，向红色细胞转变，诱导结束后基本所有细胞都转化为红色不动细胞，仅有少量细胞漂白，细菌污染较少，最终的干重为1.3g/L，虾青素含量为2.90％。

实施例5
(1)将雨生红球藻藻种置于BG11培养基进行培养，初始接种量为8万个细胞/ml，培养温度为25℃，白色荧光灯24小时连续单侧光照，光照强度为80μE/m2/s，通入含有0.5～1.5％(v/v)二氧化碳的混合空气进行搅拌，通过调整二氧化碳含量和通气量将藻液pH控制在7.3～7.8，培养9天，藻细胞数达到100万个细胞/ml，游动营养细胞比例为95％。

(2)改变培养条件，将温度提升至33℃，继续培养3天，100％的游动营养细胞转变为不动营养细胞，停止培养。

(3)沉降浓缩后离心去除上清液，得到雨生红球藻藻泥，不添加抗生素或防腐剂，在4℃进行储藏，储藏周期为7周。

(4)向储藏后的藻液加入无菌水，使用离心方法去除上清液，再将所得藻泥按照0.5g/L的浓度接种到20倍稀释的BG11培养基内，在弱光照条件下通气培养，进行藻细胞活化，光强为
50μE/m2/s，温度为25℃，通入含有0.5～1.5％(v/v)二氧化碳的混合空气进行搅拌，通过调整二氧化碳含量和通气量将藻液pH控制在7.3～7.8，活化培养时间为4天。

在活化过程中镜检发现藻液内杂菌较多，漂白死亡或裂解死亡细胞较多，藻细胞数目和藻液干重值急剧下降。

(5)藻细胞经过活化后，培养基中的氮源基本消耗殆尽，向藻液中添加醋酸钠，使得藻液中醋酸钠浓度为45mM，并置于室外进行诱导培养，室外的光照强度为0～2000μE/m2/s，温度为25～30℃，通过调整二氧化碳含量和通气量将藻液pH控制在7.5～8.0，诱导培养周期为7天。

培养结束后收集藻细胞，采用改良的Boussiba方法测定虾青素含量。

结果显示，在储藏过程中不添加抗生素或防腐剂，会导致大量杂菌生长，藻细胞的活性大幅降低，在添加醋酸钠进入诱导过程后，藻细胞大量漂白死亡且细菌污染严重。

实施例6
(1)将雨生红球藻藻种置于BG11培养基进行培养，初始接种量为5万个细胞/ml，培养温度为18℃，白色荧光灯24小时连续单侧光照，光照强度为50μE/m2/s，通入含有0.5～1.5％(v/v)二氧化碳的混合空气进行搅拌，通过调整二氧化碳含量和通气量将藻液pH控制在7.0～7.3，培养7天，藻细胞数达到80万个细胞/ml，游动营养细胞比例为99％。

(2)停止培养。

(3)沉降浓缩后离心去除上清液，得到雨生红球藻藻泥，用灭菌水配制0.5g/L乳酸链球菌素溶液，并过滤除菌，加入到离心后的藻泥中，震荡混匀成悬浊液，在4℃进行储藏，储藏周期为4周。

(4)向储藏后的藻液加入无菌水，使用离心方法去除上清液，再将所得藻泥按照0.5g/L的浓度接种到20倍稀释的BG11培养基内，在弱光照条件下通气培养，进行藻细胞活化，光强为40μE/m2/s，温度为25℃，通入含有0.5～1.5％(v/v)二氧化碳的混合空气进行搅拌，通过调整二氧化碳含量和通气量将藻液pH控制在7.0～7.3，活化培养时间为2天。

在活化过程中镜检发现细菌污染较少，漂白死亡或裂解死亡细胞较多，藻细胞数目和藻液干重值急剧下降。

(5)藻细胞经过活化后，向藻液中添加醋酸钠，使得藻液中醋酸钠浓度为80mM，并置于室外进行诱导培养，室外的光照强度为0～2000μE/m2/s，温度为25～30℃，通过调整二氧化碳含量和通气量将藻液pH控制在7.5～8.0，诱导培养周期为7天。

培养结束后收集藻细胞，采用改良的Boussiba方法测定虾青素含量。

结果显示，如果直接储藏游动营养细胞，藻细胞活性大幅降低，添加醋酸钠进入诱导过程后，藻细胞大量漂白死亡。

实施例7
(1)将雨生红球藻藻种置于BG11培养基进行培养，初始接种量为10万个细胞/ml，培养温度为20℃，白色荧光灯24小时连续单侧光照，光照强度为70μE/m2/s，通入含有0.5～1.5％(v/v)二氧化碳的混合空气进行搅拌，通过调整二氧化碳含量和通气量将藻液pH控制在7.0～7.3，培养7天，藻细胞数达到125万个细胞/ml，游动营养细胞比例为95％。

(2)改变培养条件，将温度提升至30℃，继续培养4天，90％的游动营养细胞转变为不动营养细胞，停止培养。

(3)沉降浓缩后离心去除上清液，得到雨生红球藻藻泥，用灭菌水配制0.4g/L乳酸链球菌素溶液，并过滤除菌，加入到离心后的藻泥中，震荡混匀成悬浊液，在4℃进行储藏，储藏周期8周。

(4)不进行活化培养。

(5)向藻液中添加醋酸钠，使得藻液中醋酸钠浓度为50mM，并置于室外进行诱导培养，室外的光照强度为0～2000μE/m2/s，温度为25～30℃，通过调整二氧化碳含量和通气量将藻液pH 控制在7.5～8.0，诱导培养周期为7天。

培养结束后收集藻细胞，采用改良的Boussiba方法测定虾青素含量。

结果显示，如果不进行活化培养，添加醋酸钠进入诱导过程后，藻细胞大量漂白死亡。

上述实施例仅以雨生红球藻为例进行了具体说明，本技术的方法也可以应用在其他采用两步法培养的藻类中。

尽管本技术的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本技术的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本技术并不限于特定的细节。