凝胶色谱柱清洗方案

反相硅胶键合相色谱柱的清洗

反相硅胶键合相一般包括C18 、C8 、C4 、苯基等，当用二元混合溶剂进行等强度洗脱时。为移去污染物，可用20 个体积的强洗脱溶剂，如甲醇、乙腈或四氢呋喃来冲洗柱子。如果流动相中含缓冲盐溶液，为防止有机溶剂清晰造成的盐析出，阻塞管路，应首先用20 个柱体积的不含缓冲盐的水- 有机相溶剂冲洗色谱柱，然后再用强洗脱溶剂清洗柱子。

如果用强洗脱溶剂仍不能驱除污染物，可以使用更强的溶剂或混合溶剂来洗脱。当需用一系列的有机溶剂清洗色谱柱时，应逐渐增加它们的洗脱强度，并确保溶剂之间的混溶性。对典型的反相硅胶柱，用于洗涤无缓冲盐的体系，推荐使用以下有机溶剂清洗系统：100 ％甲醇→100 ％乙腈→75 ％乙腈+25 ％异丙醇→100 ％异丙醇→100 ％四氢呋喃清洗后，按相反的顺序冲洗色谱柱，以返回到原始的流动相。如果使用者怀疑色谱柱被严重的污染或阻塞，可将二甲基亚砜与水或二甲基甲酰胺与水，以各自50 ％的比例混合，并以低于0.5mL/min 的流速通过色谱柱。

由于污染物聚集在色谱柱头，逆向冲洗会缩短污染物在柱中迁移的距离；又因为色谱柱皆在高于操作压力下填充的，通常逆向液流不会扰动色谱柱床。但如果色谱柱顶端过滤筛板的孔径大于柱底部过滤筛板的孔径，则固定相的微小粒子会在逆向冲洗过程通过筛板流出柱，从而会在柱中产生新的死空间引起柱床松动。因此在逆向冲洗前，应先确认柱管两端过滤筛板的孔径一致。

除盐：对普通反相C18 键合相柱，为除去柱中含有的缓冲盐类或水溶性物质时，不应使用纯水冲洗。因为C18 键合相像一条长链将硅胶黏结，当有有机溶剂存在时，其表面被流动相润湿，C18 长链完全展开，像海水中的海藻一样。当纯水或缓冲溶液通过时，C18 键合相不能被浸润，键合相表面会塌陷，从而将溶剂、样品分子或无机盐分子包合。此时仅用纯水无法将包合物洗脱出，应使用含5 ％有机溶剂的水溶液冲洗，以清除无机盐或水溶性物质。

蛋白污染：如果需从硅胶键合固定相清洗蛋白质残留物，必须使用和前述不同的程序。如果生物材料血浆或血清样品注入色谱柱，在大多数情况下，纯有机溶剂( 如乙腈或甲醇) 并不能溶解肽和蛋白质，用它们清洗色谱柱是无效的。然而，有时使用有机溶剂与缓冲物、酸或离子对试剂的混合物却是有效的。

清洗反相柱中的蛋白质类物质，可使用表1 溶剂系统。

表1 从HPLC 反相柱中清洗蛋白质类物质使用的清洗溶剂系统

金属污染：有时清洗硅胶反相固定相需使用特殊的技术，如在早期硅胶键合相生产中，使用高金属氧化物含量的硅胶，金属离子会吸附在键合相表面，此时可使用0.05mol/ EDTA 冲洗，将金属离子螯合，再用纯水将可溶性螯合物洗掉。

清洗溶液

TSK-SW&SW XL系列色谱柱

1. PH较低（如：pH 3.0）、浓度较高的盐溶液（如：0.5M Na2SO4）；

2. 添加水溶性有机物（MeOH、ACN、EtOH，10% -20%）的极性缓冲液；

3. SDS（0.1%）、尿素（8M）或胍（6M）的缓冲溶液。注意：这些试剂很难被去除。它们需要使用20-40个柱体积的20% ACN进行冲洗。因此，只有当先前的清洗方法无效时才选择使用本方法。

TSK色谱柱的再水化

TSK-GEL液相色谱柱的脱水现象，可能是因为使用不当或长期放置保存过程中造成的。有些TSK-GEL玻璃色谱柱中由于没有气密密封圈，这种情况下色谱柱会随时间而易发生干燥现象。对于其他的所有种类色谱柱如不锈钢或玻璃柱等，如果柱栓未拧紧或者使用过程中空气意外进入到色谱柱中，均可能发生柱子干燥的情况。很容易就可以辨认到玻璃色谱柱出现的脱水现象，因为可以很容易地看到干燥的填充物与柱壁分离的现象。我们推荐采用下列步骤，以消除色谱柱的脱水现象：

1. 按照相反的流动方向将色谱柱连接到液相系统上；

2. 不要将色谱柱与检测器相连；

3. 以推荐最大流速的一半流速，使用滤过的20%乙醇超纯水溶液进行色谱柱的过柱；

注意：反相色谱柱需要使用60%的乙醇。

4. 继续重复上述程序，直到您确信色谱柱已经再水化处理完毕。再水化处理可能需要

几个小时的时间，这取决于色谱柱的尺寸大小；

5. 按照正确的流动方向将色谱柱连接到液相系统上；

6. 如果有机物不是正常流动相的一部分的话，要使用3个柱体积的超纯水冲洗色谱柱

以去除有机物；

7. 使用上样缓冲液进行柱平衡（通常使用3～5个柱体积）；

8. 使用QC测试方法评价柱子的性能，以确保色谱柱能够正常使用。