石蜡包埋切片制作法

一、制备显微标本的切片法

一石蜡包埋切片制作法

这是最常用的切片法。以石蜡作为组织的填充支持介质，将整块组织加以包埋，最后凝固成均匀一致的固态结构。用切片机制取极薄的切片。为了让石蜡能浸入组织内部，需将组织经过脱水等处理。过程大致如下：

⑴固定：生物标本脱离机体或培养环境，细胞会发生自溶，腐败分解。因此，需用固定剂处理，使蛋白质凝固停止濒死或死后变化。凡供永久保存的标本都需经固定处理。

常用的固定剂是甲醛、乙醇等，能使蛋白质凝固。还有由几种试剂配成的固定液，例如Carnoy固定液，由无水酒精、氯仿、冰醋酸配成，固定力更快更强，不含水分，可避免水溶性物质如糖原等在固定过程中损失。

⑵脱水：是将组织细胞所含水分除去。通常用乙醇（Alcohol，酒精），浓度递升到100%。此过程还使组织块进一步硬化。

⑶透明：是用既能溶于纯酒精又能融解石蜡的有机溶剂，将组织中的酒精取代，以便石蜡浸入。通常用二甲苯（xylene）为透明剂。

⑷浸蜡：在温箱内进行。已透明的组织块放入加热融解的石蜡中，让石蜡浸透组织，作为支持介质。

⑸包埋：将已浸蜡的组织块放入热融的包埋石蜡中，迅速冷凝，组织决便被蜡包埋。

⑹切片：用切片机。常用的切片机有轮转式、平推式的。用轮转式的易于切出连续切片。切片厚度随制片目的而调整。教学标本厚度多是5~6μm。

⑺贴片烤干：石蜡切片在温水上展平后，移在玻片上，烤干，即可供染色处理。染色后用树胶、盖坡片封固，可永久保存。

二冷冻切片法

冷冻切片法是借组织在低温下，冻结变硬而达到符合切片要求。冷冻切片法需有冷冻切片机，或在普通切片上配制冷设施。恒冷切片机是高级冷冻切片设备。它有一个恒冷箱，标本致冷台和切片机都装在箱内。恒冷箱的作用类似冰箱，可在一定范围内调整温度，其结构有利于保持箱内恒定低温，减少箱门打开时环境温度的干扰。切片机的轮转把手装在箱外，便于操纵切片。

冷冻切片法的优点是：在处理得当时，它可以最大限度地保持组织的新鲜状态。并且，由于不需经脱水、透明、浸蜡等过程中有机溶剂的处理，及湿箱浸蜡热的影响，甚至可不经固定。所以能很好地保存组织细胞的各种成分和酶的活性，因此在酶的组织化学研究中常用此切片法。

二、显示标本结构成分的染色法

一苏木素伊红染色法（HE染色法）

为最常用的染色法。该法应用于各种组织的染色，是组织学技术的基本方法，对任何液体固定的组织和各种包埋的切片均可使用，只是对不同包埋的切片法处理略有不同。下面简介石蜡包埋切片的HE染色法。

1、脱蜡：石蜡切片的组织内部充满石蜡，不能使水溶性染液着色，因此在染色前必须首先用二甲苯将石蜡脱掉，共两次。

2、下行入水：将已脱蜡的标本浸入无水酒精及各级酒精，使组织逐步接近水。

3、蒸馏水略洗。

4、苏木素溶液染色约5—15分钟

5、自来水洗去多余染料。

6、入稀释的盐酸酒精溶液中分色，边分色边镜检，至核呈红紫色，细胞质无

色为合适。

7、分色后用自来水或加数滴氨水碱化，直至细胞核变成蓝色。这一步骤也可称为“蓝化”。

8、入蒸馏水洗去碱性水分。

9、入70%酒精→80%酒精各5分钟。

10、入伊红染液染色30秒至数分钟。

11、以95%酒精对伊红分色，至胞浆，结缔组织等呈桃红色。

12、上行脱水：染色后的切片，因组织内含水而不透明，不能清晰地观察其微细结构。因此，须将组织内的水分经各级酒精→无水酒精逐步置换，最后进入不含水份的透明剂内。

13、透明：入二甲苯透明剂，二次（各数分钟）。

14、取出切片：将组织周围多余的二甲苯擦去，滴树胶后加盖玻片封固。

结果：细胞核蓝紫色，胞浆、胶原纤维、肌纤维为桃红色，嗜酸性颗粒为鲜红色，弹性纤维呈明亮桃红色。

二组织化学和细胞化学染色法

组织化学和细胞化学，是将物理和化学的技术运用到组织标本，用显微镜和化学分析方法来研究组织和细胞内的化学成分，并观察该化学成分在组织、细胞内的定位、含量及其变化规律。这些化学成分借着化学反应所产生的不溶性着色物质来显示。对于某些化学成分，例如：Fe++糖原、核酸等，可以用直接或间接的化学反应产生着色沉淀而显示其部位和相对含量。对于酶类，显示它的活性，须有该种酶的底物（被该种酶作用的物质），由酶对底物的分解，直接或间接地生成着色物质而被显示。凡是在光学显微镜下观察细胞原位显示的化学物质，称组织化学，若用电镜观察细胞原位化学成分的着色部位，则称电镜细胞化学，下面从原理方面简要介绍几种常用的组织化学染色技术：

1、显示琥珀酸脱氢酶（SDH）活性的硝基-BT法：

（Succinate dehydrogenase）

⑴酶的定位及生物学意义：

琥珀酸脱氢酶是线粒体标志酶，其存在于所有有氧呼吸的细胞，和线粒体内膜紧密结合。该酶不需辅酶而自身有黄素蛋白（FP,Flavoprotein）为辅基。在组化反应中常用来反映三羧酸循环的情况。其催化过程如下：

弱-单甲（紫红色）

HOOC-CH2-CH2-COOHFPH2四唑（甲）↓

（有色）强-双甲（深紫蓝色）

（琥珀酸）（黄素蛋白）

HOOC-CH=CH=COOHFPH2四唑（无色）

（延胡索酸）

⑵原理：上述的反应最后一步的原理是，硝基-BT（Nitro-blue tetrozolyum，四唑氮蓝）系异环族化合物四唑盐，当它接受氢时，本身被还原为有色沉淀产物（甲）（Formazan）。

⑶孵育液配制：

A液（贮备液）

0.2M磷酸缓冲液（PH7.6）10ml等量混合

0.2M琥珀酸钠（S01.succinate）10ml备用

B液：

硝基四唑（Nitro-Br）2mg

2ml

0.2M磷酸缓冲液（PH7.6）2ml

取：A液2ml

B液2ml孵育液

聚乙烯吡烷酮（PVP）300mg

⑷方法：

①新鲜恒冷箱冷冻切片，厚6~8μm，平贴在盖玻片上。

②滴染法：将有冷冻切片的盖玻片（标本面朝上）平放于预热好的培养皿中（底部垫一湿滤纸），滴加孵育液至全部覆盖组织，于37℃温箱中孵育45~60分钟（肝，心肌组织15分钟即可）。

③于生理盐水中冲洗二次（轻晃，以防脱片）。

④10%福尔马林生理盐水固定10分钟。

⑤15%酒精浸洗5分钟（换二次）。

⑥甘油明胶封片。

⑸结果：酶活性强处呈蓝色颗粒（双甲沉淀），酶活性较低时形成紫红色单甲。在光镜下，该酶活性于肝小叶内分布呈明显分带现象，周边带强于中央带。在心肌细胞纵切面，酶活性颗粒沿心肌细胞长轴整齐排列，相邻心肌细胞的空白处为闰盘。

2、显示葡萄糖-6-磷酸酶（G-6-Pase）活性的铅法：

（Glucosel-phosphate phosphohydrolase）

①酶的定位及其生物学意义：

该酶主要位于内质网，是内质网的标志酶。G-6-Pase参与糖代谢，能水解葡萄糖-6-磷酸而释放出葡萄糖和磷酸。

⑵原理：G-6-Pase将底物（葡萄糖-6-磷酸钾盐）水解产生磷酸离子，后者被孵育液中的硝酸铅所捕获，最终反应物为颗粒状的硫化铅沉淀，其反应式如下：酶Pb(NO3)2

葡萄糖-6-磷酸钾+H2O葡萄糖+磷酸

(NH4)2S

Pb2(PO4)2PbS↓

(无色)（棕色）

（试剂配制及方法详见组织学技术专著）

⑶结果：酶活性部位呈棕色硫化铅颗粒沉淀。在光镜下G-6-Pase活性颗粒较均匀地分布于胞质中。

3、显示碱性磷酸酶（APL）的钙钴法（Alkaline phosphohydrolase）

⑴酶的定位及其生物学意义：

ALP在碱性环境下能催化各种醇和酚的磷酸酯水解，参与磷酸根的跨膜转运过程，并有磷酸转移的作用，故在细胞膜上运输较活跃，如毛细血管内皮细胞，肾近曲小管刷状缘，肠上皮纹状缘等处，该酶的活性较高。