仪器分析高效液相色谱

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恒流型 溶剂流量恒定，与柱填充情况无关，使用较多。 有机械注射式和机械往复式两种。应用最多的是机械往复式 恒流泵，适于梯度洗脱。
每分钟往复25~100次，因此脉动小。对流量变化敏感 的检测器也会有噪声干扰，此时可连接一脉动阻尼器。
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马达
密封
往复式拉动
机械往复柱塞泵示意图
聚物、农药、抗生素、
胆固醇、金属有机物。
极性增加 不溶于水 非极性
非离子极性
溶于水 离子
吸附
分配
反向分配
正向分配 离子交换
凝胶渗透
尺寸排阻
凝胶过滤
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各种HPLC方法的应用范围及对象
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10.2 HPLC 仪器
1. 高压输液装置; 2. 进样系统; 3. 分离系统; 4. 检测系统;
此外还配有梯度淋洗、 自动进样、脱气装置和数据 处理装置。
峰形展宽相对要小些。 HPLC 的展宽因素： 进样系统 连接管道 检测器的死体积
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进样装置包括两种： 1）隔膜注射进样：微量注射器--装置简单、死体积小。但 进样量小且重现性差。 2）高压进样阀：常用的为六通阀--进样量可控制，进样准 确，重复性好。
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Sample Loop
第10章 高效液相色谱
10.1 概述 10.2 HPLC 仪器
包括： 高压输液装置; 进样系统; 分离系统; 检测系统;辅助系统
10.3 流动相和固定相简介 10.4 高效液相色谱方法简述
分配色谱、吸附色谱、离子交换色谱、尺寸排阻色谱和亲和色谱
10.1 概述
高效液相色谱
（High performance liquid chromatography, HPLC）
除了起运载作用外，还可与组分作用，并与固
定相对组分的作用产生竞争。
操作温度：GC 需高温；
HPLC 通常在室温下进行。
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3. 应用
适于非挥发性和热
不稳定组分的分析。
在工业、科学研究，
尤其是在生物学和医
学等方面应用极为广
泛。
分 子
量
如氨基酸、蛋白质、
核酸、烃、碳水化合
物、药品、多糖、高
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1. 高效液相色谱与经典液相色谱方法的比较 高速：HPLC采用高压输液设备，流速大大增加，分析
速度极快，只需数分钟；而经典方法靠重力加料，完成一 次分析需时数小时。
高效：填充物颗粒极细且规则，固定相涂渍均匀、传质 阻力小，因而柱效很高。可以在数分钟内完成数百种物质 的分离。
高灵敏度：检测器灵敏度极高：UV—10-9g, 荧光检测 器—10-11g。
到色谱柱 脉动阻 尼器 球阀
溶剂
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4）梯度淋洗装置： 在分离过程中逐渐改变流动相组成或极性，从而改变分
配比k 值。 一个泵：可采用低压混合设计（将两种或以上的溶剂按
一定比例混合，再由高压泵输出）； 两个或以上泵：调节各自的流量，在高压下混合。
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2. 进样系统 与GC 相比，HPLC 柱要短得多，由于柱本身所产生的
➢ 这种色谱技术曾被称为： 高速液相色谱（High Speed Liquid Chromatography） 高压液相色谱（High Pressure Liquid Chromatography）
➢ 目前使用最多的名称为： 高效液相色谱 （High Performance Liauid Chromatography, HPLC）
其孔径约2m，可防止颗粒物进入泵内。
2）脱气：超声波脱气或真空加热脱气。溶剂通过脱气器中 的脱气膜，相对分子量小的气体透过膜从溶剂中除去。
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3）高压泵： 输液泵的要求：密封性好、输液流量稳定无脉动、可调
范围宽、耐腐蚀。 输液泵种类：恒压型和恒流型。
恒压泵（类似于风箱）采用适当的气动装置，使高压惰 性气体直接加压于流动相，输出无脉动的液流。常称为气动 泵。这种泵简单价廉，但流速不如恒流泵精确稳定，故只适 用于对流速精度要求不高的场合，或作为装填色谱柱用泵。
是以溶剂液体为流动相的色谱方ห้องสมุดไป่ตู้。
按照固定相不同可分为： 液-液分配色谱； 吸附色谱（液-固色谱）； 离子交换色谱； 尺寸排阻色谱（凝胶渗透色谱） 亲和色谱 平板色谱（薄层色谱）等。
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早期液相色谱，包括Tswett的工作，都是在直径1~5cm, 长 50~500cm的玻璃柱中进行的。为保证有一定的柱流速，填充 的固定相颗粒直径多在150~200m范围内。即使这样，流速仍 然很低（<1mL/min），分析时间仍然很长！
Sample injector
Pump
六通阀示意图
进样前
waste
HPLC column
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进样中
进样后
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3. 色谱柱 1）色谱柱的要求：内壁光滑的优质不锈钢柱，柱接头的死 体积小。柱长多为10~30cm，内径为4~5mm（制备色谱柱 除外）；
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2）填充：主要采用匀浆法。 根据使用匀浆试剂的性质不同可分为：
平衡密度法：使溶剂密度和填充颗粒密度相近，此时颗 粒沉降速度趋于0。常用的匀浆试剂有四氯乙烯、四溴乙烷 和二碘甲烷等；
➢ 解决分析时间及柱效问题的方法: 加压：增加流速（真空或空气泵）时，分析时间减少，却
柱塔板高度H也相应增加，柱效下降。 H = A + B/u + Cu ➢ 解决分析时间及柱效问题的方法：
减小填充物的粒径（3~10 m ）！
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➢ Martin 和Synge在1941年就提出高效相色谱的设想，但直 到60年代，高效固定相以及高灵敏检测器的出现及发展， 才彻底解决了分析时间及柱效的问题。
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2. HPLC与GC的比较
分析对象及范围：
GC ：气体和低沸点的稳定化合物，占有机物20%；
HPLC ：高沸点、高分子量的稳定或不稳定化合物，
占有机物80%。
流动相的选择：
GC ：流动相为有限的几种“惰性”气体，
只起运载作用，对组分作用小；
HPLC：流动相为液体或各种液体的混合，
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HPLC工作过程示意图
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He
HPLC仪器详解
出口检查
储液瓶 分布器 过滤 2m
高压泵
脉流消除
入口检查
抽气
到检测器
分离柱
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压力计
反压调节
注样阀
过滤器
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1. 高压输液系统（150～350×105 Pa） 1）贮液器：1-2L的玻璃瓶，配有溶剂过滤器（镍合金），