Loop-mediated isothermal amplification 环介导等温扩增技术

样本前处理
• 简化样本提取DNA/RNA步骤 煮沸法、抽提液、自动化提取……
应用
• RT-LAMP：1步法，逆转录和扩增同时进行 • 原位LAMP • LAMP在核酸测序、SNP分型、DNA/PRO芯片有广泛 应用前景。 • 日本Eiken公司已开发包括禽流感、SARS、西尼罗河 病毒、牛胚胎性别检测等19种LAMP产品出售。 • 我国有20几种LAMP试剂盒申请了专利，但没有一个 通过FDA、SFDA认证。 • 在中国，产品主要覆盖猪、禽、结核、支原体、衣 原体、嗜血杆菌等。
LAMP的特点
• 特异性强：受非靶序列的影响小。 • 灵敏度高：与PCR相比，其检测极限更小，仅为几个拷贝。 • 等温高效：LAMP在等温条件下扩增，不会因温度改变而造 成时间的损失。耗时短。若再增加一对环引物，扩增时间能 缩短到30min内。 • 产物易检测，操作简便，反应不需PCR仪。 • 稳定性、精密度均符合试剂盒（研发）要求。 • 一次只能检测一个病原 • 引物设计比传统的PCR复杂，须用专业软件设计（免费）。 在200bp片段内选择6个设计区域，引物筛选周期2-3个月。 引物特异性 • 产物鉴定麻烦，需开管酶切，仅日本拥有LAMP产物测序技 术？ • Cutoff值，检测仪器LA-320C实时浊度仪
扩增效率：107
原 理
温度 60~65℃是双链DNA复性及延伸的中间温度，DNA在65℃左右 处于松散的动态平衡状态。 酶 Bst DNA大片段聚合酶，能在引物配对双链DNA的互补部位进 行延伸扩增，同时将另一条链解离，变成单链。 引物 利用4条特异引物使链置换DNA合成在不停地自我循环。
• 副产物—— 焦磷酸镁的浊度检测：在核酸大量合成时，从dNTP析出的 焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg离子 结合，产生副产物——焦磷酸 镁，白色沉淀，只要用肉眼观察或浊度仪在400nm光下，检测沉淀浊 度就能够判断扩增与否。
• 荧光检测：钙黄绿素（螯合Mn2+） 替代品：sybr green？
Ladder-like pattern in gel-electrophoresis
Loop-mediated isothermal amplification 环介导等温扩增技术
与PCR方法对比
PCR 需热循环（PCR仪） 针对两个区域设计2条引物 扩增片段是匹配目的基因的条带 LAMP 不需热循环，恒温65℃左右 针对6个区域设计4条引物 扩增片段加入了反向互补的茎环结构 扩增效率：1010，比PCR高100-1000 倍
引 物
基于靶基因3’端的F3c、F2c和F1c 区以及5’ 端的B1、B2 和B3区等6个不同的位点设计4种引物。 • • • • FIP引物：上游内引物 F3引物：上游外引物 BIP引物：下游内引物 B3引物：下游外引物
起始阶段
链置换型DNA聚合酶
LAMP法基因扩增循环
LAMP扩增产物的检测Fra bibliotek