海洋微生物多样性的研究【文献综述】

毕业论文文献综述

海洋生物资源与环境

海洋微生物多样性的研究

摘要：海洋微生物多样性是生物多样性的重要组成部分。本文综述了海洋微生物多样性的概念，海洋养殖环境中微生物多样性的研究现状以及国内外开展海洋微生物多样性的主要研究方法和原理。重点介绍了分子生物学技术在研究中的应用,对DGGE指纹图谱和16S rDNA进行了详细的阐述。

关键字：海洋微生物多样性；分子生物学技术；DGGE； 16S rDNA 克隆文库

1. 海洋微生物多样性的概念

海洋微生物的种类繁多，可达1000万种，其种群的丰富程度也远远超出人类先前的认识，且大部分属于未知的品种。通过对海洋微生物多样性的研究，特别是针对大多数未知种群的研究，可以探知蕴藏其中的无法估量的资源，同时也可用于监控环境变化，对于环境状态、环境污染，微生物群落会作出迅速反应。

早在20世纪90年代，Solbrig[1]指出微生物群落多样性有3个组成要素：即物种多样

性、遗传多样性和功能多样性。起初的研究重点在物种多样性和遗传多样性，但随着各项技术的发展和研究角度的拓宽，微生物多样性的研究还包括生活环境的多样性、生长繁殖速度的多样性、生活方式的多样性、基因的多样性和微生物资源开发利用的多样性等（Watve et al，1996，Istock et al，1996，刘晶晶等，2006）。[2,3,4]本文所说的海洋微生物多样性（Marine microorganisms diversity）是指所有海洋微生物种类、种内遗传变异以及它们生存环境的总称，是物种多样性、遗传多样性和生态系统多样性的综合表述。目前，柳承璋等（2002）[5]认为多样性的研究作为海洋微生物资源开发的基础，通常集中在以下几个层次：即分类多样性（Taxonomic diversity）、系统发育多样性（Phylogenetic diversity）、遗传多样性（Genetic diversity）和功能多样性（Functional diversity）。近年来，刘真等（2007）[6]对于海洋天然药物的开发和利用，海洋污染环境的生物修复与整治，刘晶晶等（2006）[4]微生物对近海养殖环境的生态影响以及海水养殖动物的病害等热点的研究也大大推动了微生物多样性的研究。

2 . 海洋养殖环境中微生物多样性的研究现状

我国的海水养殖业有着悠久的历史，随着市场需求的扩大和海水养殖技术水平的提

高，海水养殖业已趋向集约化、高密度、高产出的养殖模式,越来越多的养殖环境遭到了

严重破环，极大的制约了养殖业的健康发展。在海水养殖生态系统里，微生物对其生态环

境的平衡以及水质的调节起着重要的作用，它们参与物质的循环和能量的流动。因此，了解海水养殖环境中微生物的多样性，有助于我们更为深入地掌握微生物的分布特征及其在整个生态系统中的功能与作用，对发展健康养殖业具有重要的意义。

近年来，在养殖环境微生物群落结构的研究方面，国内外已有很多相关报道。从研究方法来看，已由传统的培养方法逐渐向各种分子手段转变。早期的研究主要以平板培养计数的方法为主，研究对象也集中在几类致病菌或某些功能微生物上。李秋芬等（2002）[7]报道了虾池生态系统中几类细菌的季节性变化，他们发现在养殖中后期弧菌和硝酸盐还原菌数量增长很快且数量较高。高尚德等（1994）、郭平等（1994）[8,9]报道了养虾池中细菌的数量和变化规律同温度、pH值及虾病有密切关系。王晓颖等（2006）[10]研究了虾池沉积环境中若干功能菌及弧菌的时空变化。这些研究多是在传统的分离培养方法的基础上进行细菌计数，而我们知道自然界中绝大部分的微生物是目前人们还无法纯培养的，采用传统的分离培养方法，不足以得到丰富的微生物多样性信息。

近几年，以PCR-DGGE为代表的DNA指纹图谱技术以及荧光原位杂交等分子手段常被应用于微生物群落的分析。Matthew等（2006）[11]应用PCR-DGGE技术以及构建16S rDNA克隆文库的方法研究了南美白对虾育苗池微生物群落的多样性，结果发现不同分析方法所得出的结果之间存在着差异。从研究内容来看，这些微生物群落所处的环境多样，其中包括网箱养殖区、养殖池塘、滩涂等。另外微生物所处的微环境（生境）也各不相同，包括养殖水体、沉积物、甚至是养殖动物体内。

综上所述，微生物群落结构的组成及变化与海水养殖的关系十分密切，在养殖池塘的物质循环、能量流动、生态平衡及环境净化等方面起着十分重要的作用。了解养殖环境中细菌群落的组成、功能及其多样性，有助于了解养殖池塘生态系的特性，并对病害起到早期的预警作用。

3. 微生物多样性的研究方法

3.1 微生物多样性研究的传统方法

自19世纪科赫（Koch）创立微生物纯培养技术以来，已有数千种细菌、病毒和约10万种真菌在实验室中得到了纯培养，纯培养技术已成了研究微生物的必要技术之一。所谓纯培养技术（Culture Methods），是指在实验室条件下，利用合适的培养基对样品进行稀释培养，最终获得纯培养物，进而开展一系列的研究。早期的海洋微生物多样性研究也是建立在这种传统培养基础上的，主要是从细菌形态和生理生化水平出发，对不同菌株的各种分类特征进行实验和描述，并以此为依据从众多考虑的细菌中逐个排出，直至正确的鉴定出未知菌株。

通过纯培养方法对可培养细菌（Cultivated Bacteria）进行一系列的研究，可以准确的了解微生物细胞的生命活动以及环境中各种微生物相互协调的规律。但是传统的分离培养法也存在很多不足之处，某些寡营养微生物较难用培养方法进行分析，如海洋微生物

等。此外，在对微生物分类特征进行常规鉴定时，也经常出现表型表达不稳定、敏感性不高、测试项目多等问题。

3.2 基于分子生物学技术的研究方法

越来越多的证据（表1）[12]表明，由于受到现有技术的限制，自然界中绝大部分的微生物是目前人们还无法纯培养的。钱丽君等（2007）[13]将传统的微生物培养方法与现代分子生物学技（PCR-DGGE）相结合，研究了三疣梭子蟹养殖塘底泥可培养微生物的多样性，提高了分析通量。但仍未涉及到占细菌总数99％的不可培养细菌。1982年，徐怀恕等[14]提出了“不可培养（活）微生物”（viable but nonculturable microorganisms，VBNC Microorgani-sms）的概念。顾名思义，不可培养微生物（Uncultivated Microorganisms）是指迄今所采用的分离培养方法还未获得纯培养的微生物。由于不可培养微生物无论是其物种类群，还是新陈代谢途径、生理生化反应、产物等都存在着丰富的新颖性和多样性，因而比以往的可培养微生物具有更为丰富和多样的可供人类开发利用的生物资源。

表1 几个环境样品中可培养细菌的比率

环境样品可培养率（％）海水（Sea water）0.01～0.10

淡水（Freshwater）0.25

湖水（Mesotrophic lake）0.1～1.0

无污染的河口水样（Unpolluted estuarine waters）0.1～3.0

活性污泥（Activated sludge）1～15

沉淀物（Sediment）0.25

土壤（Soil）0.3

注：可培养的细菌是以菌落生成单位（CFU）来计算的（引自Amann et al，1995）

上世纪60年代开始，分子遗传学和分子生物学技术在细菌分类学中得到了广泛应用。Woese指出16S rRNA及其类似的rRNA基因序列作为生物系统发育指标最为合适。Morris等人