脂肪酶催化合成生物柴油实验

3、 酯交换合成酯化率的测定: 酯交换合成酯化率的测定:
在己酸乙酯合成的反应体系中， 在己酸乙酯合成的反应体系中，将摩尔浓度 比为1： 的己酸和无水乙醇溶于正庚烷 的己酸和无水乙醇溶于正庚烷， 比为 ：1.3的己酸和无水乙醇溶于正庚烷，制 备己酸浓度为0． 的反应底物。 备己酸浓度为 ．6mol／L的反应底物。在 ／ 的反应底物 100mL具塞三角瓶中，加入 具塞三角瓶中， 具塞三角瓶中 加入5mL反应底物及 反应底物及 0．4g脂肪酶，在35℃及150r／min振荡反应。 脂肪酶， 振荡反应。 ． 脂肪酶 ℃ ／ 振荡反应 反应16h后，取出样品100uL加入到 反应 后 取出样品 加入到5mL水溶 水溶 加入到 液中，再用0． 液中，再用 ．025mol／L的NaOH滴定未反应 ／ 的 滴定未反应 的己酸， 的己酸，以1滴0．5％酚酞为指示剂。 滴 ． ％酚酞为指示剂。
转化率
=脂肪酸减少的滴定摩尔数／反应初始 脂肪酸减少的滴定摩尔数／ 时的脂肪酸滴定摩尔数×100％ 时的脂肪酸滴定摩尔数×100％ 4. 酯化过程反应温度: 酯化过程反应温度:
个反应温度， 设5个反应温度，即25℃、30℃、 个反应温度 ℃ ℃ 35℃、40℃和45℃，用己酸乙酯合成的 ℃ ℃ ℃ 反应体系测定酯化率。 反应体系测定酯其进 对脂肪酶进行固定化， 行活性测定。 行活性测定。 2、熟悉酶法制备生物柴油的操作方法。 熟悉酶法制备生物柴油的操作方法。 3、掌握酶法制备生物柴油的实验室制 备方法。 备方法。
实验原理
实验仪器和材料
• 材料：大孔吸附树脂、菜籽油、脂肪酶、 材料：大孔吸附树脂、菜籽油、脂肪酶、 95％乙醇均为分析纯、 甘氨酸-NaOH缓冲 95％乙醇均为分析纯、 甘氨酸-NaOH缓冲 液 、油酸甲酯 、 • 仪器：电子台秤、磁力搅拌加热、恒温摇 仪器：电子台秤、磁力搅拌加热、 真空泵1L/S、吸虑瓶、布氏漏斗、 床 、真空泵1L/S、吸虑瓶、布氏漏斗、分 液漏斗
实验步骤
一、固定化脂肪酶的制备
1、树脂载体的预处理 树脂载体用95%的乙醇洗涤数次，洗 树脂载体用95%的乙醇洗涤数次，洗 去未聚合的单体、制孔剂及其分解物、分 散剂和防腐剂等脂溶性杂质，并且使打孔 树脂充分溶胀。除去乙醇后用去离子水洗 至无乙醇味。清洗干净的树脂浸泡于去离 子水中备用。
2、脂肪酶的固定化 1g载体在使用前用0.2M PH9.0的甘氨酸 1g载体在使用前用0.2M PH9.0的甘氨酸 -NaOH缓冲液平衡2h后，抽干。将一定量的 NaOH缓冲液平衡2h后，抽干。将一定量的 脂肪酶粉溶于PH9.0的甘氨酸-NaOH缓冲液中， 脂肪酶粉溶于PH9.0的甘氨酸-NaOH缓冲液中， 在低温条件下中速搅拌10min，使之充分溶 在低温条件下中速搅拌10min，使之充分溶 解。然后离心，取上清液，往其中加入经过 预处理的载体，于低温条件下进行吸附。吸 附后离心小心倾去上清液。
结论
二、酶活力测定： 酶活力测定：
1.固定化脂肪酶活力的测定方法 1.固定化脂肪酶活力的测定方法
橄榄油乳化法， 橄榄油乳化法，将一定量的聚乙烯醇溶液和橄榄油按 照一定的体积比（ 混合， 照一定的体积比（3：1）混合，再用超声波乳化成乳状 4ml乳化液和5mlPH9.0的缓冲液加入1mg/ml的酶 乳化液和5mlPH9.0的缓冲液加入1mg/ml的酶， 液。取4ml乳化液和5mlPH9.0的缓冲液加入1mg/ml的酶， 预热5min 5min后 同时在另一三角瓶中加入乳化液做空白样， 预热5min后，同时在另一三角瓶中加入乳化液做空白样， 反应15min 15min后 向两瓶仲加入15ml 95%乙醇 终止反应， 乙醇， 反应15min后，向两瓶仲加入15ml 95%乙醇，终止反应， 0.05mol/L的标准氢氧化钠溶液滴定 的标准氢氧化钠溶液滴定， 用0.05mol/L的标准氢氧化钠溶液滴定，计算可得固定化 酶的分解活力。水解橄榄油每分钟产生1 mol游离的脂 酶的分解活力。水解橄榄油每分钟产生1μmol游离的脂 肪酸定义为一个酶活力。 肪酸定义为一个酶活力。 酶活回收率 =(固定化酶的总活力 加入酶粉的总活力) =(固定化酶的总活力/加入酶粉的总活力)×100% 固定化酶的总活力/
三、固定化酶催化合成生物柴油： 固定化酶催化合成生物柴油：
1、酶的预处理： 酶的预处理： 先将酶在油酸甲酯中浸泡2 ， 先将酶在油酸甲酯中浸泡 h，用菜 籽油洗涤后，最后在菜籽油中浸泡12 籽油洗涤后，最后在菜籽油中浸泡 h 。
2、酯交换过程合成脂肪酸甲酯： 酯交换过程合成脂肪酸甲酯：
具塞锥形瓶中， 在50ml具塞锥形瓶中，依次加入大豆油 ， 具塞锥形瓶中 依次加入大豆油5g， 甲醇0.99ml（醇油摩尔比为 ），蒸馏水 ），蒸馏水 甲醇 （醇油摩尔比为3:1）， 0.24ml ,固定化脂肪酶 固定化脂肪酶1.2g，置于 ℃ ，180 固定化脂肪酶 ，置于40℃ r/min，PH=9.4条件下振荡反应 条件下振荡反应48h。 条件下振荡反应 。 甲醇的加入方法：分别在反应刚开始时、 甲醇的加入方法：分别在反应刚开始时、 反应24和 反应 和48 h时，每次加入甲醇总量的 ／3(总 时 每次加入甲醇总量的1／ 总 的醇与油摩尔比为3： 的醇与油摩尔比为 ：1) 在分液漏斗中静置4 ，分去甘油层， 在分液漏斗中静置 h，分去甘油层，用水 洗至中性，干燥后得生物柴油。 洗至中性，干燥后得生物柴油。