§8-5吸光光度法的应用
第 08章 吸光光度法
电子能级间跃迁
电子能级间跃迁的同 时总伴随有振动和转 动能级间的跃迁。即 电子光谱中总包含有 振动能级和转动能级 间跃迁产生的若干谱 线而呈现宽谱带。
2020年8月4日4时5分
吸收曲线与最大吸收波长
分子结构的复杂性使其对不同波长光的吸收程度 不同，用不同波长的单色光照射，测吸光度— 吸收曲
线与最大吸收波长 max；
其他
2020年8月4日4时5分
特点：
(1) 具有较高的灵敏度，适用于微量组分的测定。 (2) 通常所测试液的浓度下限达10-5~10-6 mol·L-1。 (3) 吸光光度法测定的相对误差约为2%~5%。 (4) 测定迅速，仪器操作简单，价格便宜，应用广泛 (5) 几乎所有的无机物质和许多有机物质的微量成分都 能用此法进行测定。 (6) 还常用于化学平衡等的研究。
表8-1 物质颜色与吸收光颜色的互补关系
物质颜色
黄绿 黄 橙 红
紫红 紫 蓝
绿蓝 蓝绿
颜色 紫 蓝
绿蓝 蓝绿
绿 黄绿
黄 橙 红
吸收光
波长/nm 400~450 450~480 480~490 490~500 500~560 560~580 580~600 600~650 650~780
2020年8月4日4时5分
物理性因素：
难以获得真正的纯单色光。 分光光度计只能获得近乎单色的狭窄光带。复合
光可导致对朗伯—比耳定律的正或负偏离。
非单色光、杂散光、非平行入 射光都会引起对朗伯—比耳定律的偏 离，最主要的是非单色光作为入射 光引起的偏离。
2020年8月4日4时5分
非单色光作为入射光引起的偏离： 假设由波长为λ1和λ2的两单色光 组成的入射光通过浓度为c的溶液，则：
吸光光度法的应用
bc x
△Cx
（Cx > Cs）
△C
c x c x cs
适宜 高 浓度的测定
Analytical Chemistry 分析化学
示差法的误差
方法 常规法
示差法
∵ I0 > Is
Ax bc x lg Tx d dT c Ix cx Tx ln Tx Tx I0 d cx dT Ac bc x lg Tr cx Tr ln Tx Ix Tr d c x dcx Is 有 cx cx ∴ Tr > Tx
Analytical Chemistry 分析化学
在上述实验的基础上作数据处理 对特定 pH
pH < pKa-1
Ai HR [ HR] R [R ]
b = 1 cm
C = [HR]
AHR HR C
pH > pKa+1 C = [R-] 代入，得 整理，得
AR RC
四、弱酸弱碱离解常数的测定
HR HR = H+ + RR
A
HR
R
用光度法可以测定其离解常数
HR
R
[H ][R ] Ka [HR]
[HR] pK a pH lg [R ]
[ HR] [ HR] 用吸光值表征 lg ，相对于pH作图，可求得pKa 或 [R ] [R ]
A
曲线 1 2
3 4 5 6
pH 1.10, 1.38 2.65
3.06 3.48 3.98 5.53,6.80
1
2 3 4 5 6
Aa(HL)
Ab 6
5 4 3 2 1
吸光光度法
单色器 作用:产生单色光 常用的单色器：棱镜和光栅 样品池（比色皿） 厚度(光程): 0.5, 1, 2, 3, 5…cm 材质：玻璃比色皿－－可见光区 石英比色皿－－可见、紫外光区
检测器 作用：接收透射光，并将光信号转化为电信号 常用检测器： 光电管 光电倍增管 光二极管阵列
光电管分为红敏和紫敏，阴极表面涂银和氧 化铯为红敏，适用625－1000nm波长；阴极 表面涂锑和铯为紫敏，适用200－625nm波长
T－透光率（透射比）（Transmittance）
T=
A 吸光度
It I0
A = lg (I0/It) = lg(1/T) = -lgT
I I-dI I0
朗伯定律(1760)
It
s
b dx
A=lg(I0/It)=k1b
比尔定律(1852)
A=lg(I0/It)=k2c
A=lg(I0/It)=kbc
根据吸光度的加和性可以进行多组分的测定以及 某些化学反应平衡常数的测定
光吸收曲线
有色溶液对各种波长的光的吸收情 况，常用光吸收曲线来描述。将不 同波长λ的单色光依次通过一定的 有色溶液，分别测出对各种波长光 的吸收程度（即吸光度，用字母A 表示）。以波长λ为横坐标，吸光 度为纵坐标作图，所得的曲线称为 吸收曲线或吸收光谱曲线。
准确度高
依据化学反应, 使用玻璃仪器
仪器分析：微量组分(<1%), Er 1%～5% 灵敏度高 依据物理或物理化学性质, 需要特殊的仪器
吸光光度分析法是以物质对光的选择 性吸收为基础的分析方法。根据物质 所吸收光的波长范围不同，吸光光度 分析法又有紫外、可见及红外分光光 度法。本章重点讨论可见光光度法 （又称分光光度法，简称光度法）。
吸光光度法知识点
第九章吸光光度法知识点吸光光度法是基于分子对光的选择性吸收而建立的一种分析方法，包括比色法、紫外一可见吸光光度法、红外光谱法等。
1．吸光光度法的基本原理①物质对光的选择性吸收：当光照射到物质上时，会产生反射、散射、吸收或透射。
若被照射的物质为溶液，光的散射可以忽略。
当一束白光照射某一有色溶液时，一些波长的光被溶液吸收，另一些波长的光则透过，溶液的颜色由透射光的波长所决定。
吸收光与透射光互为补色光(它们混合在一起可组成白光)。
分子与原子、离子一样，都具有不连续的量子化能级，在一般情况下分子处于最低能态(基态)。
当入射光照射物质时，分子会选择性地吸收某些频率的光子的能量，由基态跃迁到激发态(较高能级)，其能级差E激发态一E基态与选择性吸收的光子能量hv的关系为Hv=E激发态一E基态分子运动包括分子的转动、分子的振动和电子的运动。
分子转动、振动能级间隔一般小于1 eV，其光谱处于红外和远红外区。
电子能级间的能量差一般为1～20 eV，由电子能级跃迁而产生的吸收光谱位于紫外及可见光区，其实验方法为比色法和可见-紫外吸光光度法。
②吸收曲线：以波长为横坐标，以吸收光的强度为纵坐标绘制的曲线，称为吸收光谱图，也称吸收曲线。
它能清楚地描述物质对不同波长的光的吸收情况。
③光的吸收定律——朗伯一比尔定律：当一束平行单色光垂直通过一厚度为b、非散射的均匀吸光物质溶液时，吸光物质吸收光能，致使透射光强度减弱。
若用I。
表示入射光强度，I t表示透射光强度，I。
与I t之比称为透光率或透光度T，T=I。
/I t，吸光物质对光的吸收程度，还常用吸光度A表示，A=lgT=log I。
/I t。
实验证明，当一束平行单色光垂直照射某一均匀的非散射吸光物质溶液时，溶液的吸光度A与溶液浓度c和液层厚度b的乘积成正比，此即朗伯一比尔定律，其数学表达式为A=lgT=log I。
/I t =abc式中，a为吸收系数。
溶液浓度以g·L-1为单位、液层厚度以cm 为单位时，a的单位为L·g-1·cm-1。
吸光光度法是基于物质对光的选择性吸收而建立起来的一类
1852年；比尔： 阐明了物质对光的吸收程度与溶液浓度之间的关 系.
Ak2c
由比尔将二者结合起来,就得到布格-朗伯-比尔定 律,一般叫做朗伯-比尔定律.
AKbc
2、朗伯-比尔定律 的推导〔数学表达 式〕<略〕
3、灵敏度的表示方法
<1>吸收系数a〔吸光系数a 〕 当液层厚度b以cm为单位、吸光物质的浓度c以
§8-4 吸光光度法分析条件的选择
在光度分析中,一般需先选择适当的试剂与试样中的 待测组分反应使之生成有色化合物,然后再进行测定.
因此,分析条件的选择包括反应条件和测量条件的选 择.
一、显色反应及其条件的选择 〔一〕显色反应和显色剂 1、概念：
显色反应：将被测组分转变成有色化合物的反应称 为显色反应. M + R = MR
这种方法简便、快速,对于解离度小的络合物,可 以得到满意的结果.
2、等摩尔连续变化法
此 法 的 做 法 是 保 持 CM 和 CR 的 浓度保持不变,即CM + CR = 常数, 连续改变CM和CR的比值,在选定 的仪器条件和波长下测定溶液的 吸光度A.
以A对CM/CR +CM作图.
等摩尔连续变化法测定络合物组成
g·L-1为单位时,K用a表示,称为吸收系数,其单位为 L·g-1·cm-1.此时朗伯-比尔定律表示为
A=abc
<2>摩尔吸光系数ε 当液层厚度b以cm为单位、吸光物质的浓度c
以mol·L-1为单位时,K用ε表示,称为摩尔吸收系 数,其单位为L·mol-1·cm-1.此时朗伯-比尔定律表 示为
A= εbc
二、吸光光度法的测量误差及测量条件的选择
光度法的误差除各种化学因素外,还有因仪器精度 不够,测量不准所带来的误差.
吸光光度法的应用
国家标准（GB）采用二苯碳酰二 肼分光光度法测定六价铬。
例2 维生素B6注射液的测定
维生素B6在290 ± 1 nm处有最大吸收，药典采用 紫外可见分光光度法测定维生素B6注射液。测量 在0.1 mol· -1HCl介质中进行，按 E (290 1nm) 427计 L 算维生素B6的含量。
配制三种分析浓度(c =[HB]+[B-])相等而pH不同 的溶液。
第一种溶液
pH在pKa附近，此时溶液中HB与B-共存，用1cm
的吸收池在某一定的波长下，测量其吸光度：
A AHB AB HB [ HB ] B [ B ]
A HB
K ac [ H ]c B [H ] Ka [H ] Ka
原因：示差光度法需要一个发射强度较大的光源，才能将
高浓度参比溶液的 A 调至零。
例题
1. 用一般光度法测 0.0010mol.L-1 锌标液和含锌的试 液，分别测得 As = 0.700 和 Ax =1.00，两溶液的透
光度相差多少？若用 0.0010mol.L-1锌标液作参比，
试液的A为多少？示差光度法与一般光度法相比， 读数标尺放大了多少倍？
B
AB c
推
导
将上各式整理得：
AHB A [H ] A AB A AB AHB A
Ka
pK a pH lg
上式即为用光度法测定一元弱酸解离常数的基本公式。 A为式中所示的pH时溶液的吸光度。
六、双波长分光光度法
A A1 A 2 y y x x ( A1 A1 ) A 2 A 2） （ y y ∵ A1 A 2
第八章吸光光度法
Energy
A
B Rotational C Vibrational energy leverls energy levels
A: pure rotational changes (far infrared) B: rotational-vibrational changes (near infrared) C: rotational-vibrational-electronic changes transitions (visible and ultraviolet) 三、光与颜色 波长在200~400 nm(nanometers)范围内的光称为紫外光 (Ultraviolet light)。人眼能感觉到的光的波长在400~750 nm 之间，称为可见光(Visible light)。可见光是一种复合光， 它是由赤橙黄绿青蓝紫等各种单色光(Monochromatic light) 按一定的比例混合而成的。 显然，不同颜色的单色光，其波长范围也不同。物质 的颜色正是由于物质对不同波长的光具有选择性吸收作用 而产生的。例如，CuSO4溶液因吸收了可见光中的黄色而 呈蓝色；而 KMnO4溶液因吸收了可见光中的黄绿色而呈 紫色。可见，物质的颜色是由它所反射或透过光的颜色来 决定的。注意：课本p.128的论述不够确切。
一、分光光度法的特点 1、由于入射光是纯度较高的单色光，因此用 分光光度法可以得到十分精确细致的吸收光谱。通 过选择最合适的波长进行测定，可使偏离朗伯-比 尔定律的情况大为减少，标准曲线直线部分的范围 更大。另外，分光光度计要比光电比色计精密，因 而，分光光度法的准确度要比光电比色法高。 2、由于可以任意选择某种波长的单色光，故 可在一定条件下，利用吸光度的加和性，可以同时 测定溶液中两种或两种以上的组分。 3、由于入射光的波长范围扩大了，故许多无 色物质，只要它们在紫外或红外光区域有吸收峰， 都可以用分光光度法进行测定。
项目五——吸光光度法
03
吸光光度法的仪器和试剂
分光光度计
01
定义
分光光度计是分光光度法中使用的核心仪器，用于测量溶液对特定波长
的光的吸光度。
02 03
工作原理
分光光度计通过光源发出连续光谱的光，经过单色器分光后，得到特定 波长的单色光，照射到样品上，然后通过检测器检测透过样品的光强， 从而计算出样品的吸光度。
类型
常见的分光光度计有紫外-可见分光光度计、红外分光光度计等。
酶活性测定
某些酶催化的反应会产生或消耗具有 特定吸光特性的物质，利用吸光光度 法可以测定这些物质的浓度变化，从 而推算出酶的活性。
工业生产中的吸光光度法
产品质量控制
在某些工业生产过程中，产品的吸光特性与其质量密切相关。通过吸光光度法测 量产品的吸光度，可以实时监控产品质量，确保生产过程的稳定性和产品的一致 性。
通过合成具有更高选择性和灵敏度的试剂和探针，提高吸光光度法 对目标分析物的检测灵敏度。
引入多元校正技术
利用多元校正算法，消除干扰因素，提高吸光光度法在复杂样品中 的测量精度和灵敏度。
拓展应用领域和范围
环境监测领域
将吸光光度法应用于大气、水体 等环境样品的检测，实现对环境
污染物的快速、准确测定。
生物医学领域
引入人工智能、物联网等技术， 实现吸光光度法仪器的远程操控 、数据自动处理和分析等功能， 提高仪器的易用性和分析效率。
多功能集成
将多种分析方法集成到一台仪器 中，实现一台仪器同时具备多种 分析功能，提高仪器的综合性能
和应用范围。
谢谢您的聆听
THANKS
常见试剂
常见的吸光光度法试剂有显色剂、还原剂、氧化剂等。
使用注意事项
第八章吸光光度法解析
C
ห้องสมุดไป่ตู้
A. T 2 B. 2T C. T 1/2
D. T / 2
2021/4/9
6、在光度计的检流计上刻有A 和T，二者关系为
A lgT
7、某有色物质溶液，遵守比尔定律，当其浓度
为c 时，吸光度A = 0.30，那么当浓度为2 c 时，
该溶液的吸光度A =
0.60
A bc
2021/4/9
第四节 显色反应及显色条件的选择
2021/4/9
吸光度的加和性
若溶液中含有两种或两种以上的吸光物质，且
各物间无相互作用，则测得的吸光度为各种吸光
物质吸光度之和。
如溶液中含有A、B 两物质，对波长为λ的光
均有吸收，则
A = AA + AB
A Ai ibci b ici
i
i
i
2021/4/9
例题
铁（Ⅱ）浓度为5.0×10-4 g·L-1 的溶液，与 1，10-邻二氮菲
MR max
R max
60nm
2021/4/9
二、显色条件的选择 1、显色剂的用量：
M R MR
待测组分 显色剂 有色配合物
2021/4/9
2、溶液的酸度 ⑴影响显色剂浓度和颜色； 显色剂不少是有机弱酸，因此酸度的变化， 将影响显色剂的平衡浓度，并影响显色反应的完 全程度。
M HR MR H
⑵影响Mn+的存在状态;
2021/4/9
⑶影响配合物的组成
2021/4/9
3、显色温度的选择 一般在室温，有时需加热，通过实验确定
A abc
L ·g –1 ·cm -1
与 a 的关系：
Ma
吸光光度法和应用
656 Ni Ni
即
0.467 3.64 10 4 CCo 5.52 103 CNi
0.374 1.24 103CCo 1.75 10 4 CNi
解得
cCo =9.70×10-6 (mol·L-1) cNi =2.06×10-5(mol·L-1)
土壤样品中Co和Ni的含量计算如下：
吸光光度法的应用
一、微量组分的测量 二、示差分光光度法 三、光度滴定法 四、络合物组成的测定 五、酸碱离解常数的测定 六、双波长分光光度法
1.单组分的测定
A-c 标准曲线法
举例
例1 水中六价铬的测定
在酸性条件下，六价铬与二苯碳酰二肼反应生 成紫外红色络合物，λmax＝540 nm，
ε＝2.6×104~4.17×104 L·mol-1·cm-1。
A B
c
推导
将上各式整理得：
Ka
AHB A [ H ] A AB
pKa
pH
lg
A AB AHB A
六、双波长分光光度法
X
Y
A
A A1 A 2
(Ax1 Ay1) （Ax2 Ay2）
∵ Ay1 Ay2
∴ A Ax1 Ax2
wCo
m ms
100 %
9.70 10 6 50 10 3 0.376 25.00
58.93
100 %
=0.015%
50.00
wNi
m ms
100 %
2.06 10 6 50 10 3 58.69 0.376 25.00
100 %
50.00
吸光光度法
ln T＋1＝0，即T=0.368, A=－lgT=0.434时△C/C最小。
由（7－5）计算可知，当△T＝0.01，要使△C/C<5％，则 T应在70～10％，A为0.15～1.00；实际最好为0.2～0.8，这 就是吸光光度分析中较适宜的吸光度范围(P327)
采取措施： （1）调节待测溶液浓度（通过改变称样量和稀释 等办法 改变c）； （2）选厚度不同的吸收池(改变b)。
K1b
b－液层厚度（cm）
1852年，比尔（Beer）指出，当溶液的厚度一 定时，吸光度与溶液的浓度成正比
A lg
I0 It
K2c
c－吸光物质的浓度 （mol/l）
• 将朗伯定律和比尔定律结合起来，可得朗 伯－比尔定律的数学表达式 ：
A lg I0 Kbc It
（7－3）
◆物理意义：当一束平行单色光通过某均匀吸收 溶液时，溶液的吸光度与吸光物质的浓度、吸 收层厚度成正比。
分光实验时，盛试液和参比的比色皿（吸收池）
采用相同质料和厚度的光学玻璃制成，所以Ir 基本不变。
令I0
I
' 0
Ir ,则I0
Ia
It
(7-1a)
即I0固定时，It透过光强度愈小，则Ia愈大，有 色溶液对光的吸收程 1 lgT
It
T
(7-2)
It--透射光强度 I0为入射光强度 T-透光度（以％表 示时称为透光率）
即溶液的透光率愈大，对光的吸收愈小；相反， 透光率愈小，对光的吸收愈大。
A与溶液浓度、液层厚度及入射光波长等因素有 关，如保持入射光波长不变，则A只与c、b有关。
1760年，朗伯（Lamber）指出，如溶液浓度一定， 该溶液对光吸收程度与液层厚度（吸收池厚度、 光程长度）成正比。
吸光光度法
表示物质的量浓度为1mol/L，液层厚度为1cm时溶液的吸光度。 在分析实践中，不能直接取浓度为1mol/L的有色溶液来测定，而是 在适当的低浓度时测定有色金属的吸光度，通过计算求得值。
A
A bC
0
工作曲线的斜率即 为摩尔吸收系数
C
对于ε的理解
（1）摩尔吸收系数反映吸光物质对光的吸收能 力，由吸光物质的结构特征/吸光面积等因素决定。 （2） 也反映用吸光光度法测定吸收光物质的灵 敏度。在一定条件下，它们是一常数。同一物质 与不同的显色剂反应生成不同有色化合物时，具 有不同值。因此值是选择显色反应的重要依据。 （用于定量分析的 一般104 ~ 105 L·mol-1·cm-1 ）
(C2 H5 ) N 2 O
C COO H + N (C2 H5 ) 2 H
.
AuCl 4-
成盐反应
N HS C S C C O CH N (CH3 ) 2 N C C S O CH N (CH3 ) 2
+ Ag+
AgS
C
褪色反应: Zr(IV)-偶氮胂III络合物测定草酸
吸附显色反应: 达旦黄测定Mg(II),Mg(OH)2吸附达旦黄呈红色
(H3C)2N C N(CH3)2
N(CH3)2
邻菲罗啉类：新亚铜灵
N CH3
N CH3
肟类：丁二肟
CH 3 HO C N C N CH 3 OH
4 多元络合物 混配化合物 Nb-5-Br-PADAP-酒石酸 V-PAR-H2O 离子缔合物 AuCl4--罗丹明B 金属离子-配体-表面活性剂体系 Mo-水杨基荧光酮-CTMAB
影响被测金属 离子的存在型体
第八章 吸光光度法
的溶液， 例：铁（II）质量浓度为 ＊10－4g/L的溶液，与邻二杂 ）质量浓度为5.0＊ 的溶液 氮菲反应生成橙红色配合物，该配合物在波长508 nm， 氮菲反应生成橙红色配合物，该配合物在波长 ， 比色皿厚度为2cm时，测得 比色皿厚度为 时 测得A=0.19，计算邻二杂氮菲亚铁 ， 的a及ε。 及 。 的原子质量为55.8 解：Fe的原子质量为 的原子质量为
0.506 31.2 100 A= log T(%) 1 1 T% = A *100% = 0.946 *100% =11.3% 10 10
A 0.946 c= = = 6.33*10−5 mol / L εb 9.96*103 *1.5
9.96*1 156.7 1.5 6.33*10-5 03 2.67*1 420.1 1.5 0.803mg/ L A04εbc = a =ε / M
12
A=εbc
假设由波长为λ 的两单色光组成的入射光通过浓度为c的 假设由波长为 1和λ2的两单色光组成的入射光通过浓度为 的 溶液， 溶液，则：
A = lg( I01 / It1) = ε1bc 1
−ε1bc
A2 = lg( I02 / It 2 ) = ε2bc
−ε 2bc
It1 = I01 ×10 ; It 2 = I02 ×10 (I01 + I02 ) A = lg (It1 + It 2 )
5
吸收曲线的讨论： 吸收曲线的讨论： ①同一种物质对不同波长 光的吸光度不同。 光的吸光度不同。吸光度最 大处对应的波长称为最大吸 大处对应的波长称为最大吸 收波长λmax 不同浓度的同一种物质， ②不同浓度的同一种物质， 其吸收曲线形状相似λmax 不变。 不变。而对于不同物 它们的吸收曲线形状和λmax则不同。 则不同。 质，它们的吸收曲线形状和 则不同 吸收曲线可以提供物质的结构信息， ③ 吸收曲线可以提供物质的结构信息，并作为物质定性 分析的依据之一。 分析的依据之一。 不同浓度的同一种物质， ④ 不同浓度的同一种物质，在某一定波长下吸光度 A 有 差异， 处吸光度A 差异，在λmax处吸光度 的差异最大。此特性可作为物质定 处吸光度 的差异最大。 量分析的依据。 量分析的依据。 处吸光度随浓度变化的幅度最大， ⑤ 在λmax处吸光度随浓度变化的幅度最大，所以测定最 处吸光度随浓度变化的幅度最大 灵敏。吸收曲线是定量分析中选择入射光波长的重要依据 灵敏。
8章吸光光度法
A∝b
A lg
I0 I
k1
b
①
A∝ c
A lg I0 I
k2
c
②
朗伯定律:(1760) A=lg(I0/It)=k1b
当入射光的l ,吸光物质的c 一定时,溶液的 吸光度A与液层厚度b成正比.
比尔定律(1852) A=lg(I0/It)=k2c
当入射光的l ,液层厚度b 一定时,溶液 的吸光度A与吸光物质的c成正比.
2020/3/5
吸收曲线的讨论：
（1）不同物质,曲线形状 不同，最大吸收波长λmax 不同，可用作定性鉴定各 种物质
（2）同一种物质，浓度 不同，其吸收曲线形状相 似，λmax不变。
2020/3/5
（3）同一种物质，浓度不同，在某一定波长下吸光 度 A 有差异，在λmax处吸光度随浓度变化的幅度最 大，所以测定最灵敏。吸收曲线是定量分析中选择 入射光波长的重要依据。
仪器分析：微量组分(<1%), Er : 1%～5% 灵敏度高 依据物理或物理化学性质, 需要特殊的仪器
例: 含Fe约0.05%的样品, 称0.2 g, 则m(Fe)≈0.1 mg
容量法 V(K2Cr2O7)≈0.02 mL, 测不准
光度法 结果0.048%～0.052%, 满足要求
2020/3/5
A = Kbc
c: mol/L c: g/L
A = bc
A = abc a: 吸光系数
表示物质的浓度为1mol/L,液层厚度为1cm时溶液
的吸光度。单位： (L•mol-1 •cm-1)
2020/3/5
ε可作为物质的吸光能力的度量
ε越大表明该物质的吸光能力越强，用光度
第八章 吸光光度法共42页文档
第一节 吸光光度法的基本原理
吸光光度法基于物质对光的选择性吸收而建立起来 的分析方法。
一、物质对光的选择性吸收 光是一种电磁波，具有波粒二像性。
λ= c /ν ，E =h =hc / λ
光的波长越短（频率越高），其能量越大。
波长在400~750nm范围内的光是可见光
红、橙、黄、绿、青、蓝、紫
2020/6/22
的含义
是吸光物质的浓度为1mol/L，液层厚度为1cm时的
吸光度。
可在化学手册上查到
与物质的性质、入射光波长和温度等有关
最大吸收波长λmax处的 用max表示
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思考？
一个未知浓度的KMnO4溶液，它的浓度可以怎 么得到？
cx Ax
εb
仪器测得
ε
AS
bcS
仪器测得 标准溶液
手册查得 手册与
变化将影响。
克 例服如办：法 用： 分光光度法测定Cr2O72-的浓度 202控0/6/2制2 合适的条件。
第二节 光度计及其基本部件
一、目视比色法 历史上最早不用仪器测量，直接用眼睛比较溶液的 颜色确定物质的含量。
测定方法： 标准系列法。
标准系列
未知样品
优点：
设备简单，不需要光学电子学仪器，不需要单色光。
二、光吸收的基本定律（朗伯-比尔定律）
1、透光率和吸光度
透光率
T 取值为0.0 % ~ 100.0 % 全部吸收 T = 0.0 % 全部透射 T = 100.0 %
吸光度 AlgT
A 取值为0 ~ +∞ 全部吸收 A = + ∞
全部透射 2020/6/22 A = 0
2、朗伯-比尔定律
吸光光度法 原理及应用
第9章 吸光光度法【知识要点】1、光吸收的基本定律（1） 理论上将具有同一波长的光称为单色光，由不同波长组成的光称为复合光。
白光是可见光，它的波长范围为400～750nm ，它是由红、橙、黄、绿、青、蓝、紫各种色光按一定比例混合而成。
其中各种色光的波长范围不同(称为波段)。
实际上只要将两种颜色适当的色光按一定的强度比例混合，就可形成白光，这两种色光就称为互补色光。
（2）光吸收的基本定律——郎伯-比尔定律实验证明，当一束平行单色光垂直照射某一均匀的非散射吸光物质溶液时，溶液的吸光度A 与溶液浓度C 和液层厚度b 成正比，这就是郎伯-比尔定律，其数学表达式：Kbc I I T A t==-=0lg lg 式中：I 0为入射光强度；I t 为透射光强度；T(=I t /I 0)为透射比或透光度；A 为吸光度，反应吸光物质对光的吸收程度；K 为比例常数。
注：一般来说，郎伯-比尔定律只适用于稀溶液。
（3）摩尔吸光系数和桑德尔灵敏度a 摩尔吸光系数若溶液浓度以1-⋅L mol 为单位、液层厚度以cm 为单位，则郎伯-比尔定律中的比例常数K 称为摩尔吸光系数，用符号ε表示。
郎伯-比尔定律可写成：bc A ε=式中：ε的单位为11--⋅⋅cm mol L 。
摩尔吸光系数ε是吸光物质在给定波长和溶剂下的特征常数，ε越大，表示该物质对某波长光的吸收能力越强，测定方法的灵敏度也就越高b 桑德尔灵敏度（用S 表示）它是指在一定的波长下，测得的吸光度A=0.001时，1cm 2截面积内所含的吸光物质的质量，其单位为.2-⋅cm g μ经推导可得εMS =（.2-⋅cm g μ） 2、分光光度计及吸收光谱（1）分光光度计的基本结构由五部分组成：光源、单色器、吸收池、检测器及数据处理装置各部分的作用及性能如下：光源的作用是提供所需波长范围内的连续光，光源要有足够的光强度和稳定性。
可见分光光度计的光源多属热光源，如钨灯。
单色器的作用是将光源发出的连续光谱分解为单色光。
《吸光光度法教案》课件
《吸光光度法教案》PPT课件第一章：引言1.1 吸光光度法的定义1.2 吸光光度法在分析化学中的应用1.3 吸光光度法的原理1.4 吸光光度法的仪器与操作步骤第二章：吸光光度法的原理2.1 光的吸收与发射2.2 朗伯-比尔定律2.3 摩尔吸光系数2.4 吸光度的计算与单位第三章：分光光度计的结构与操作3.1 分光光度计的组成部分3.2 分光光度计的操作步骤3.3 光谱仪的使用与维护3.4 波长的选择与调整第四章：标准曲线的制备与分析4.1 标准曲线的制备方法4.2 标准曲线的绘制与分析4.3 样品浓度的计算与误差分析4.4 实际案例分析：药物含量测定第五章：吸光光度法的应用5.1 环境监测中的应用5.2 生物化学中的应用5.3 食品分析中的应用5.4 临床诊断中的应用第六章：吸光光度法的准确度与精确度6.1 准确度的评估6.2 精确度的评估6.3 干扰因素及其影响6.4 提高吸光光度法准确度的方法第七章：溶液的制备与处理7.1 溶液的配制方法7.2 溶液的浓度与体积的计算7.3 样品的前处理与分离7.4 样品分析中的常见问题与解决方法第八章：光散射与吸光光度法8.1 光散射现象的介绍8.2 光散射对吸光光度法的影响8.3 光散射的测定与分析8.4 光散射在吸光光度法中的应用案例第九章：吸光光度法在药物分析中的应用9.1 药物分析中的重要性9.2 药物的紫外吸收特性9.3 药物含量测定的方法与步骤9.4 实际案例分析：药物制剂中主成分的测定第十章：现代吸光光度法技术进展10.1 光纤吸光光度法10.2 微透析吸光光度法10.3 激光吸光光度法10.4 在线监测与自动化分析技术第十一章：吸光光度法在有机合成中的应用11.1 有机化合物的紫外吸收特性11.2 有机合成中光催化反应的监控11.3 有机物含量的测定与分析11.4 实际案例分析：有机合成产物的纯度测定第十二章：吸光光度法在材料科学中的应用12.1 材料科学中的光吸收现象12.2 吸光光度法在材料合成与表征中的应用12.3 材料性能与吸光性质的关系研究12.4 实际案例分析：纳米材料粒径的测定第十三章：吸光光度法在生命科学中的应用13.1 生物大分子的紫外吸收特性13.2 蛋白质浓度与纯度的测定13.3 核酸的定量分析与监测13.4 实际案例分析：细胞培养中的营养物质监测第十四章：吸光光度法在环境监测中的应用14.1 环境污染物的紫外吸收特性14.2 水质分析与监测14.3 大气污染物分析与监测14.4 实际案例分析：水体中有机物的总量测定第十五章：实验与练习15.1 吸光光度法的基本实验操作15.2 标准曲线与样品分析的实验操作15.3 常见干扰因素的实验探究15.4 综合实验练习：饮料中维生素C含量的测定重点和难点解析重点：1. 吸光光度法的定义、原理及其在分析化学中的应用。
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4.有一浓度为2.00×10-4mol/L的有色溶液，在某吸收 波长处，于3.00cm的吸收池中测得其吸光度为0.120。 将此溶液稀释一倍，在相同波长处，于5.00cm的吸收池 中测得其吸光度仍为0.120。问此溶液是否符合比尔定律？ 为什么？
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5.某化合物A 在287nm处有强吸收，将其配制成4.0 mg /L 溶液，用1 cm比色皿测得吸光度为0.56，求透光率、摩尔 吸光系数 和桑德尔灵敏度。假定MA=100g/mol
6 用分光光度法测铁，已知溶液中Fe2+的浓度为500µg/L， 液层厚度2cm，在508nm处测得透光率为0.645。计算吸 收系数，摩尔吸收系数和桑德尔灵敏度。 M（Fe）=55.85g/mol
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10.吸光光度法是基于 物质对光的选择性吸收 而 建立的分析方法。
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5.符合朗伯—比尔定律的有色溶液，浓 度增加1倍后，max、T、A、 有无变 化？为什么？ 6.吸光光度分析中，应如何选择参比溶 液？ 7.在分光光度法测定中，为什么尽可能 选择最大吸收波长为测量波长？ 8.在分光光度分析中，引起朗伯－比耳 定律偏离的原因有哪些？ 9.简述分光光度计的主要部件及作用。
A.一般选蒸馏水 B.一般选试剂溶液 C.一般选褪色溶液 D.根据加入试剂和被测溶液 的颜色、性质选择
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3.分光光度分析中，如入射光为非平行光， 通常情况下会使工作曲线（ ）。 A.向下弯曲 B.向上弯曲 C.无变化 D.变化不确定 4 .下列各单色光，波长在可见光区的是（ ）。 A.1cm B.0.7µm C.10µm D.100µm
§8-5 吸光光度分析法及应用
⑵示差吸光光度法 当待测组分浓度过高,以一个比待 测溶液浓度稍低的标准溶液作参 比溶液.
A=A=Ax-As =b(cx-cs)=b c
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c x c s c
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1.比色分析中，用１cm的比色皿测得的透光率 为Ｔ，若改用２cm的比色皿测得的透光率为 （ ）。 Ａ.2T Ｂ.T/2 Ｃ．T 2 ＤT1/2 2.光度分析中，选择参比溶液的原则是（ ）。
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1. 某有色溶液以试剂空白作参比,用1cm吸收池,于最大吸收波长处, 测得其吸光度A=1.120,已知有色溶液的ε=2.5×104 L· -1· -1。 mol cm 若用示差分光光度法测定上述溶液时,欲使其测量误差最小,求参比 溶液的浓度。（吸收池仍为１cm厚)
2.以示差分光光度法测定高锰酸钾的浓度，以含锰10.0mg/mL的 标准溶液做参比溶液其对水的透光度为T=20%，并以此调节透光 率为100％，此时测得未知浓度KMnO4溶液的透光率Tx=40% , 计算KMnO4的浓度。（mg/mL）
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3.以邻二氮菲分光光度法测定试样中的铁，称取试样 0.200g，处理后在25mL容量瓶中定容，移取5.00mL， 加显色剂后定容为25.00mL，用1cm比色皿于510nm 波长处以试剂空白测得吸光度A＝0.440。计算试样中铁 的含量。 ε＝1.1×104 L· -1· -1， M(Fe)=55.85g/mol mol cm
4.在分光光度法中，当T＝ 0.368 即A= 0.434 时， 测量浓度的相对误差最小。
5.分光光度法中，定量的依据是 上一页 结束
朗伯—比尔定律Leabharlann 。6.分光光度分析中，吸光度A=______时，浓 0.434 度测量的相对误差最小。 7.示差法与普通分光光度法的不同点 所采用的参比溶液不同 于 。 8.在分光光度法中，当T= 0.368 时测量浓度的相 对误差最小。