过表达前列腺特异性膜抗原和荧光素_省略_C3稳定细胞系的建立及成瘤性鉴定_张玲玲
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5 + －
PSMA 的表达情况。 2 2． 1 结果 C42 和 LNCaP 细胞表达 PSMA，而 PC3 和 将 PE 标记的抗 PSMA 的抗体与 4 种前列腺癌细 2 细胞和 胞孵 育 后， 流 式 细 胞 术 检 测 发 现， C4LNCaP 细胞上 PSMA 表达阳性，而 PC3 细胞和 DU145 细胞为 PSMA 阴性细胞（ 图 1 ） 。
+ PC3 肿瘤上 PSMA 的表达为阳性。结论 学染色检测证实 PSMA + PC3 细 成功建立了能稳定表达 PSMA 和荧光素酶的 PSMA -
胞系，并在裸鼠体内证实其可有效成瘤 ，为靶向 PSMA 的研究提供了有用的细胞和动物模型 。 ［ 关键词］ PSMA； 慢病毒； 前列腺癌； 靶向治疗； 动物模型 ［ 中图分类号］ R737． 25 ［ 文献标志码］ A
收稿日期： 2017 － 10 － 14 ； 接受日期： 2017 － 02 － 24
基金项目： 国家重点基础研究发展计划 （ 973 ） （ 2013CB530500 ） ； 国家自然科学基金（ 81372225 ） 作者简介： 张玲玲（ 1984 － ） ，女，陕西西安人，硕士研究生 Tel： 84774531808 ； Email： linglingzhang2020@ 126． com
2． 5 ˑ 107 个 / mL。 取 0． 2 mL 分别接种于每只裸鼠的右 下肢皮下，各接种 5 只； 接种 2 周后，用生物发光成
+ PC3 像法（ bioluminescence imaging，BLI） 检测 PSMA － PC3 细胞的成瘤情况。 细胞和 PSMA -
胞用 含 100 mL / L 胎 牛 血 清 的 RPMI1640 培 养 基， PC3 细胞和 DU145 细胞用含 100 mL / L 胎牛血清的 DMEM 培养基，于 37ħ 、50 mL / L CO2 的孵箱中培 养，定期换液传代。 1． 2． 2 况 流式细胞术检测 PCa 细胞上 PSMA 的表达情 取生长状态良好的上述前列腺癌细胞，将其消
+ PC3 细 胞 和 PSMA － PC3 细 胞。 用 PE 得到 PSMA -
PSMA － PC3 细胞，将它们消化成单细胞悬液，进行细 胞计数后，用无血清培养基重悬细胞，使细胞数为
标记抗人 PSMA 抗体分别与这 2 种细胞孵育后， 用流
+ PC3 细胞中 式细胞术进行检测。 结果显示，PSMA -
化成单细胞悬液； 进行细胞计数后，分至各流式管， 使每管细胞数为 1 ˑ 10 个。 每种细胞均设置空白对 照组、同型对照组和 PSMA 抗体组。 空白组加入流 式细胞术分选液，同型对照组加入人 IgG，PSMA 抗 体组加入 PE 标记的 PSMA 抗体，4ħ 孵育 30 min。 随后，除 PSMA 抗体组外，每管加入 100 μL PE 标记 4ħ 避光孵育 30 min。洗涤后， 的抗人 IgG， 用流式细 胞仪进行检测。 1． 2． 3 PC3 细胞最佳嘌呤霉素筛选剂量的确定 取 生长状态良好的 PC3 细胞，消化成单细胞悬液，均匀 0． 5、 1、 1． 5、 2） μg / mL 嘌 次日， 加入（ 0、 铺至 6 孔板， 48 h 细胞全部死亡的最 呤霉素，每天观察细胞状态， 低剂量即为最佳筛选剂量。 1． 2． 4 的建立 PSMA PC3 和 PSMA PC3 稳定转染细胞系 取生长状态良好的 PC3 细胞，消化成单细
其接种到裸鼠皮下检测其成瘤能力 。方法
包装表达 PSMA 的慢病毒和表达荧光素酶的慢病毒 ，将其感染 PC3 细胞后，用嘌呤
+ PC3 细胞和仅表达荧光素酶的 PSMA － PC3 细胞； 利用流式细胞 建立能够稳定表达 PSMA 和荧光素酶的 PSMA 霉素进行筛选， + PC3 和 PSMA － PC3 细胞接种于裸鼠皮下建立荷瘤模型 ，利用生物发光成像法观察其在 术检测 PSMA 的表达情况。将 PSMA + PC3 和 PSMA － PC3 肿瘤组织中 PSMA 的表达情况。 结果 体内的成瘤情况，利用免疫组织化学染色法检测 PSMA -
△
同为第一作者
* 通讯作者，温伟红，E-mail： wenweih@ fmmu． edu． cn； 杨安钢，E-mail： agyang@ fmmu． edu． cn
514 1． 2 1． 2． 1 方法 PCa 细胞系的培养 C42 细胞和 LNCaP 细
33 （ 4 ） 细胞与分子免疫学杂志 （ Chin J Cell Mol Immunol） 2017 ，
远远高于正常前列腺上皮，其表达水平与格里森评 分呈正相关，并且在绝大多数的转移灶都呈阳性表
［4 － 6 ］ 。 这 些 表 达 特 点 使 得 PSMA 被 认 为 是 达 PCa 免疫诊断和免疫治疗的理想靶点［7 － 8］。 多种靶向 PSMA 的研究已经确认了 PSMA 作为
前列腺癌特异性诊断和治疗靶点的有效性，特异性 识别 PSMA 的导向肽、适配子以及针对 PSMA 的抗 体，都 显 示 出 比 较 理 想 的 靶 向 诊 断 和 抗 肿 瘤 活 ［9 － 11 ］ 。特别是近年来基于抗体的肿瘤免疫治疗研 性 究发展迅速，被认为是继手术治疗、化疗及放疗之后 ［12 ］ 的第四大抗肿瘤治疗策略 。 因此，靶向 PSMA 的 抗体用于 PCa 治疗的研究被认为具有良好的应用前 2 细胞和 景。但是，由于 PSMA 阳性的前列腺癌 C4LNCaP 细胞恶性程度较低，不易在裸鼠体内成瘤，这 对以 PSMA 为靶点的靶向治疗研究带来了一定的困
33 （ 4 ） 细胞与分子免疫学杂志 （ Chin J Cell Mol Immunol） 2017 ，
513 文章编号： 1007 － 8738 （ 2017 ） 04 － 0513 － 04
·论著·
过表达前列腺特异性膜抗原和荧光素酶的 PC3 稳定细胞系的建立及成瘤性鉴定
1 1 2 2 2 2 1 1 2 1* 1* 张玲玲 △ ，吴介恒 △ ，韩东晖 ，史圣甲 ，杨发 ，谢品 ，席文锦 ，郭张燕 ，秦卫军 ，杨安钢 ，温伟红
（ 第四军医大学： ［ 摘 要］ 目的
1
2 免疫学教研室， 西京医院泌尿外科，陕西 西安 710032 ）
+ PC3 细胞系，并将 利用慢病毒感染的方法建立能稳定表达前列腺特异性膜抗原 （ PSMA） 和荧光素酶的 PSMA -
+ PC3 细 胞 和 取 生 长 状 态 良 好 的 PSMA － +
图1 情况
流式 细 胞 术 检 测 4 种 前 列 腺 癌 细 胞 上 PSMA 的 表 达
2． 2
PSMA + PC3 和 PSMA － PC3 稳定转染细胞系 用表达 PSMA 的慢病毒和 / 或表达萤光素酶的慢
的建立 病毒感染 PC3 细胞后，用嘌呤霉素筛选并扩大培养，
DU145 细胞不表达 PSMA
胞悬液后，按照 1 ˑ 10 个 / mL 的细胞数铺至 6 孔板 中，培养过夜； 次日， 弃孔中液体， 每孔加入 1 mL 感 染增强液、1 μL 聚凝胺 （ polybrene ） ； 按照感染复数 （ multiplicity of infection， MOI） = 20 的比例，加入 10 μL 包装好的慢病毒 （ PSMA 和 / 或荧光素酶 ） 进行感染， 对照孔加入 10 μL 对照慢病毒，37ħ 、50 mL / L CO2 条件下孵育 12 h； 12 h 后， 向孔中补充 1 mL DMEM / F12 培养液，继续培养 3 d； 加入 2 μg / mL 嘌呤霉素进行 48 h 后，存活的细胞即为稳定转染细胞，将细 筛选， 胞进行扩大培养。 将稳定表达 PSMA 和荧光素酶的 PC3 细胞命名为 PSMA PC3 细胞，将只稳定表达荧 PC3 细胞。 用 光素 酶 的 PC3 细 胞 命 名 为 PSMA PE 标记的抗 PSMA 的抗体，依次与筛选获得的细胞 孵育后，用流式细胞术检测细胞表面 PSMA 的表达 情况，具体方法同前。 1． 2． 5 检测 PSMA + PC3 和 PSMA － PC3 细胞成瘤能力的
DOI:10.13423/j.cnki.cjcmi.008110
前列腺癌（ prostate cancer，PCa） 是严重威胁男性 健康的常见泌尿系肿瘤。在西方国家，PCa 占男性癌 。 在 我 国 随 着 人 口 老 龄 化， 症死 因 的 第 二 位 PCa 的发病率和死亡率也逐年升高。 前列腺特异性膜 抗原（ prostate specific membrane antigen，PSMA ） 是一
成功建立
+ PC3 细 胞 和 仅 表 达 荧 光 素 酶 的 PSMA － PC3 细 胞，流 式 细 胞 术 检 测 证 实 了能够稳定 表 达 PSMA 和 荧 光 素 酶 的 PSMA -
PSMA + PC3 细胞上 PSMA 呈阳性表达，小动物活体成像结果显示 PSMA + PC3 和 PSMA － PC3 细胞均可有效成瘤，免疫组织化
［3 ］ 种前列腺上皮细胞特异性表达的 2 型跨膜糖蛋白 。 研究表明，PSMA 在 PCa 细胞及 PCa 组织中的表达均 ［1 － 2 ］
Hale Waihona Puke Baidu
难。PSMA 阴性的 PC3 细胞可以在裸鼠体内有效成 瘤，是一种理想的体内研究模型。 为使 PC3 细胞表 达 PSMA，我们利用表达 PSMA 的慢病毒感染 PC3 细 胞，并经 嘌 呤 霉 素 筛 选 获 得 了 稳 定 表 达 PSMA 的 PSMA + PC3 细胞。此外，我们还给 PC3 细胞同时感 染了表达荧光素酶的慢病毒，以便在体内对肿瘤的 定位和生长进行实时的观察。 1 材料和方法 1 ． 1 材料 2、LNCaP、PC3、DU145 细胞为第 人前列腺癌 C4四军医大学免疫学教研室保存； RPMI1640、DMEM / F12 培养液购自 Gibco 公司； 表达 PSMA 的慢病毒和表达 萤光素酶的慢病毒由上海吉凯生物公司包装； 新生 胎 牛 血 清 购 自 中 国 医 学 科 学 院； 藻 红 蛋 白 （ phycoerythrin，PE ） 标 记 的 小 鼠 抗 人 PSMA 抗 体 （ PSMAPE） 购自 Biolegend 公司； 小 鼠 对 照 IgG 购 自 R＆D 公 司； 兔 抗 人 PSMA 抗 体 购 自 Cell Signaling Technology 公司； HRP 标记的羊抗兔 IgG 购自 Abcam 公 司； 细胞培养皿（ 瓶） 为 Thermo Nunc 公司产品； D荧光 素钾盐购自 GoldenBio 公司。体 质 量 为 25 30 g 的 4 6 周龄雄性裸鼠购自第四军医大学动物实验中心。
6
1． 2． 6 的表达
HE 和免疫组织化学染色检测肿瘤中 PSMA 将上述荷瘤裸鼠在接种后第 30 天，麻醉后
+ PC3 和 PSMA － PC3 肿瘤组织， 处死； 分别取 PSMA -
制成石蜡切片。取 2 份切片，一份切片进行脱蜡后， 加入苏木素染色 5 min，流水冲洗，加入盐酸酒精分 化 30 s，之后在自来水中浸泡 15 min，再加入伊红染 色 2 min，常规脱水后封片。另一份切片脱蜡后加入 30 mL / L H2 O2 ，室温放置 10 min，灭活除内源性过氧 化物酶。加入山羊血清室温封闭 30 min，再加入兔 抗人 PSMA 抗体 （ 1 ʒ100 ） ，湿盒内 4ħ 孵育过夜； 次 日，将切片用 PBS 洗涤后，加入 HRP 标记的山羊抗 兔 IgG（ 1ʒ200 ） ，室温孵育 30 min； 洗涤后，DAB 显色 2 3 min，用 苏 木 素 衬 染 后 封 片， 显 微 镜 下 观 察
4期
张玲玲，等． 过表达前列腺特异性膜抗原和荧光素酶的 PC3 稳定细胞系的建立及成瘤性鉴定
515
98% 以上的 细 胞 中 能 够 检 测 到 强 的 荧 光 信 号，而 PSMA － PC3 细胞中检测不到荧光信号，提示成功建
PSMA 的表达情况。 2 2． 1 结果 C42 和 LNCaP 细胞表达 PSMA，而 PC3 和 将 PE 标记的抗 PSMA 的抗体与 4 种前列腺癌细 2 细胞和 胞孵 育 后， 流 式 细 胞 术 检 测 发 现， C4LNCaP 细胞上 PSMA 表达阳性，而 PC3 细胞和 DU145 细胞为 PSMA 阴性细胞（ 图 1 ） 。
+ PC3 肿瘤上 PSMA 的表达为阳性。结论 学染色检测证实 PSMA + PC3 细 成功建立了能稳定表达 PSMA 和荧光素酶的 PSMA -
胞系，并在裸鼠体内证实其可有效成瘤 ，为靶向 PSMA 的研究提供了有用的细胞和动物模型 。 ［ 关键词］ PSMA； 慢病毒； 前列腺癌； 靶向治疗； 动物模型 ［ 中图分类号］ R737． 25 ［ 文献标志码］ A
收稿日期： 2017 － 10 － 14 ； 接受日期： 2017 － 02 － 24
基金项目： 国家重点基础研究发展计划 （ 973 ） （ 2013CB530500 ） ； 国家自然科学基金（ 81372225 ） 作者简介： 张玲玲（ 1984 － ） ，女，陕西西安人，硕士研究生 Tel： 84774531808 ； Email： linglingzhang2020@ 126． com
2． 5 ˑ 107 个 / mL。 取 0． 2 mL 分别接种于每只裸鼠的右 下肢皮下，各接种 5 只； 接种 2 周后，用生物发光成
+ PC3 像法（ bioluminescence imaging，BLI） 检测 PSMA － PC3 细胞的成瘤情况。 细胞和 PSMA -
胞用 含 100 mL / L 胎 牛 血 清 的 RPMI1640 培 养 基， PC3 细胞和 DU145 细胞用含 100 mL / L 胎牛血清的 DMEM 培养基，于 37ħ 、50 mL / L CO2 的孵箱中培 养，定期换液传代。 1． 2． 2 况 流式细胞术检测 PCa 细胞上 PSMA 的表达情 取生长状态良好的上述前列腺癌细胞，将其消
+ PC3 细 胞 和 PSMA － PC3 细 胞。 用 PE 得到 PSMA -
PSMA － PC3 细胞，将它们消化成单细胞悬液，进行细 胞计数后，用无血清培养基重悬细胞，使细胞数为
标记抗人 PSMA 抗体分别与这 2 种细胞孵育后， 用流
+ PC3 细胞中 式细胞术进行检测。 结果显示，PSMA -
化成单细胞悬液； 进行细胞计数后，分至各流式管， 使每管细胞数为 1 ˑ 10 个。 每种细胞均设置空白对 照组、同型对照组和 PSMA 抗体组。 空白组加入流 式细胞术分选液，同型对照组加入人 IgG，PSMA 抗 体组加入 PE 标记的 PSMA 抗体，4ħ 孵育 30 min。 随后，除 PSMA 抗体组外，每管加入 100 μL PE 标记 4ħ 避光孵育 30 min。洗涤后， 的抗人 IgG， 用流式细 胞仪进行检测。 1． 2． 3 PC3 细胞最佳嘌呤霉素筛选剂量的确定 取 生长状态良好的 PC3 细胞，消化成单细胞悬液，均匀 0． 5、 1、 1． 5、 2） μg / mL 嘌 次日， 加入（ 0、 铺至 6 孔板， 48 h 细胞全部死亡的最 呤霉素，每天观察细胞状态， 低剂量即为最佳筛选剂量。 1． 2． 4 的建立 PSMA PC3 和 PSMA PC3 稳定转染细胞系 取生长状态良好的 PC3 细胞，消化成单细
其接种到裸鼠皮下检测其成瘤能力 。方法
包装表达 PSMA 的慢病毒和表达荧光素酶的慢病毒 ，将其感染 PC3 细胞后，用嘌呤
+ PC3 细胞和仅表达荧光素酶的 PSMA － PC3 细胞； 利用流式细胞 建立能够稳定表达 PSMA 和荧光素酶的 PSMA 霉素进行筛选， + PC3 和 PSMA － PC3 细胞接种于裸鼠皮下建立荷瘤模型 ，利用生物发光成像法观察其在 术检测 PSMA 的表达情况。将 PSMA + PC3 和 PSMA － PC3 肿瘤组织中 PSMA 的表达情况。 结果 体内的成瘤情况，利用免疫组织化学染色法检测 PSMA -
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同为第一作者
* 通讯作者，温伟红，E-mail： wenweih@ fmmu． edu． cn； 杨安钢，E-mail： agyang@ fmmu． edu． cn
514 1． 2 1． 2． 1 方法 PCa 细胞系的培养 C42 细胞和 LNCaP 细
33 （ 4 ） 细胞与分子免疫学杂志 （ Chin J Cell Mol Immunol） 2017 ，
远远高于正常前列腺上皮，其表达水平与格里森评 分呈正相关，并且在绝大多数的转移灶都呈阳性表
［4 － 6 ］ 。 这 些 表 达 特 点 使 得 PSMA 被 认 为 是 达 PCa 免疫诊断和免疫治疗的理想靶点［7 － 8］。 多种靶向 PSMA 的研究已经确认了 PSMA 作为
前列腺癌特异性诊断和治疗靶点的有效性，特异性 识别 PSMA 的导向肽、适配子以及针对 PSMA 的抗 体，都 显 示 出 比 较 理 想 的 靶 向 诊 断 和 抗 肿 瘤 活 ［9 － 11 ］ 。特别是近年来基于抗体的肿瘤免疫治疗研 性 究发展迅速，被认为是继手术治疗、化疗及放疗之后 ［12 ］ 的第四大抗肿瘤治疗策略 。 因此，靶向 PSMA 的 抗体用于 PCa 治疗的研究被认为具有良好的应用前 2 细胞和 景。但是，由于 PSMA 阳性的前列腺癌 C4LNCaP 细胞恶性程度较低，不易在裸鼠体内成瘤，这 对以 PSMA 为靶点的靶向治疗研究带来了一定的困
33 （ 4 ） 细胞与分子免疫学杂志 （ Chin J Cell Mol Immunol） 2017 ，
513 文章编号： 1007 － 8738 （ 2017 ） 04 － 0513 － 04
·论著·
过表达前列腺特异性膜抗原和荧光素酶的 PC3 稳定细胞系的建立及成瘤性鉴定
1 1 2 2 2 2 1 1 2 1* 1* 张玲玲 △ ，吴介恒 △ ，韩东晖 ，史圣甲 ，杨发 ，谢品 ，席文锦 ，郭张燕 ，秦卫军 ，杨安钢 ，温伟红
（ 第四军医大学： ［ 摘 要］ 目的
1
2 免疫学教研室， 西京医院泌尿外科，陕西 西安 710032 ）
+ PC3 细胞系，并将 利用慢病毒感染的方法建立能稳定表达前列腺特异性膜抗原 （ PSMA） 和荧光素酶的 PSMA -
+ PC3 细 胞 和 取 生 长 状 态 良 好 的 PSMA － +
图1 情况
流式 细 胞 术 检 测 4 种 前 列 腺 癌 细 胞 上 PSMA 的 表 达
2． 2
PSMA + PC3 和 PSMA － PC3 稳定转染细胞系 用表达 PSMA 的慢病毒和 / 或表达萤光素酶的慢
的建立 病毒感染 PC3 细胞后，用嘌呤霉素筛选并扩大培养，
DU145 细胞不表达 PSMA
胞悬液后，按照 1 ˑ 10 个 / mL 的细胞数铺至 6 孔板 中，培养过夜； 次日， 弃孔中液体， 每孔加入 1 mL 感 染增强液、1 μL 聚凝胺 （ polybrene ） ； 按照感染复数 （ multiplicity of infection， MOI） = 20 的比例，加入 10 μL 包装好的慢病毒 （ PSMA 和 / 或荧光素酶 ） 进行感染， 对照孔加入 10 μL 对照慢病毒，37ħ 、50 mL / L CO2 条件下孵育 12 h； 12 h 后， 向孔中补充 1 mL DMEM / F12 培养液，继续培养 3 d； 加入 2 μg / mL 嘌呤霉素进行 48 h 后，存活的细胞即为稳定转染细胞，将细 筛选， 胞进行扩大培养。 将稳定表达 PSMA 和荧光素酶的 PC3 细胞命名为 PSMA PC3 细胞，将只稳定表达荧 PC3 细胞。 用 光素 酶 的 PC3 细 胞 命 名 为 PSMA PE 标记的抗 PSMA 的抗体，依次与筛选获得的细胞 孵育后，用流式细胞术检测细胞表面 PSMA 的表达 情况，具体方法同前。 1． 2． 5 检测 PSMA + PC3 和 PSMA － PC3 细胞成瘤能力的
DOI:10.13423/j.cnki.cjcmi.008110
前列腺癌（ prostate cancer，PCa） 是严重威胁男性 健康的常见泌尿系肿瘤。在西方国家，PCa 占男性癌 。 在 我 国 随 着 人 口 老 龄 化， 症死 因 的 第 二 位 PCa 的发病率和死亡率也逐年升高。 前列腺特异性膜 抗原（ prostate specific membrane antigen，PSMA ） 是一
成功建立
+ PC3 细 胞 和 仅 表 达 荧 光 素 酶 的 PSMA － PC3 细 胞，流 式 细 胞 术 检 测 证 实 了能够稳定 表 达 PSMA 和 荧 光 素 酶 的 PSMA -
PSMA + PC3 细胞上 PSMA 呈阳性表达，小动物活体成像结果显示 PSMA + PC3 和 PSMA － PC3 细胞均可有效成瘤，免疫组织化
［3 ］ 种前列腺上皮细胞特异性表达的 2 型跨膜糖蛋白 。 研究表明，PSMA 在 PCa 细胞及 PCa 组织中的表达均 ［1 － 2 ］
Hale Waihona Puke Baidu
难。PSMA 阴性的 PC3 细胞可以在裸鼠体内有效成 瘤，是一种理想的体内研究模型。 为使 PC3 细胞表 达 PSMA，我们利用表达 PSMA 的慢病毒感染 PC3 细 胞，并经 嘌 呤 霉 素 筛 选 获 得 了 稳 定 表 达 PSMA 的 PSMA + PC3 细胞。此外，我们还给 PC3 细胞同时感 染了表达荧光素酶的慢病毒，以便在体内对肿瘤的 定位和生长进行实时的观察。 1 材料和方法 1 ． 1 材料 2、LNCaP、PC3、DU145 细胞为第 人前列腺癌 C4四军医大学免疫学教研室保存； RPMI1640、DMEM / F12 培养液购自 Gibco 公司； 表达 PSMA 的慢病毒和表达 萤光素酶的慢病毒由上海吉凯生物公司包装； 新生 胎 牛 血 清 购 自 中 国 医 学 科 学 院； 藻 红 蛋 白 （ phycoerythrin，PE ） 标 记 的 小 鼠 抗 人 PSMA 抗 体 （ PSMAPE） 购自 Biolegend 公司； 小 鼠 对 照 IgG 购 自 R＆D 公 司； 兔 抗 人 PSMA 抗 体 购 自 Cell Signaling Technology 公司； HRP 标记的羊抗兔 IgG 购自 Abcam 公 司； 细胞培养皿（ 瓶） 为 Thermo Nunc 公司产品； D荧光 素钾盐购自 GoldenBio 公司。体 质 量 为 25 30 g 的 4 6 周龄雄性裸鼠购自第四军医大学动物实验中心。
6
1． 2． 6 的表达
HE 和免疫组织化学染色检测肿瘤中 PSMA 将上述荷瘤裸鼠在接种后第 30 天，麻醉后
+ PC3 和 PSMA － PC3 肿瘤组织， 处死； 分别取 PSMA -
制成石蜡切片。取 2 份切片，一份切片进行脱蜡后， 加入苏木素染色 5 min，流水冲洗，加入盐酸酒精分 化 30 s，之后在自来水中浸泡 15 min，再加入伊红染 色 2 min，常规脱水后封片。另一份切片脱蜡后加入 30 mL / L H2 O2 ，室温放置 10 min，灭活除内源性过氧 化物酶。加入山羊血清室温封闭 30 min，再加入兔 抗人 PSMA 抗体 （ 1 ʒ100 ） ，湿盒内 4ħ 孵育过夜； 次 日，将切片用 PBS 洗涤后，加入 HRP 标记的山羊抗 兔 IgG（ 1ʒ200 ） ，室温孵育 30 min； 洗涤后，DAB 显色 2 3 min，用 苏 木 素 衬 染 后 封 片， 显 微 镜 下 观 察
4期
张玲玲，等． 过表达前列腺特异性膜抗原和荧光素酶的 PC3 稳定细胞系的建立及成瘤性鉴定
515
98% 以上的 细 胞 中 能 够 检 测 到 强 的 荧 光 信 号，而 PSMA － PC3 细胞中检测不到荧光信号，提示成功建