秀丽隐杆菌线虫开放实验报告

秀丽隐杆菌线虫开放实验报告
一、实验目的
1.了解线虫这一模式生物的生活史和遗传特性。

2.学习利用线虫研究遗传规律的方法和技巧。

3.确定rol突变的显隐性以及是否伴性；判断A双突变体是否连锁，计算遗传距离。

4.提高统筹计划、独立思考、团队合作等能力。

二、实验原理
秀丽线虫属于线形动物门，线虫纲，小杆线虫目，广杆线虫属，是一种生活在土壤中的线虫。

它具有生活史短、繁殖率高、饲养方便、容易保存、细胞数目少且可在显微镜下追踪每一个细胞的命运等优点，如今已成为遗传学和发育生物学研究的重要模式生物。

1999年，秀丽杆菌的全基因组测序工作已经完成，其基因组由80Mb组成，包含大约13000个基因，线虫的功能基因组研究为人类相关研究提供了重要的线索。

秀丽线虫是雌雄同体的动物，同一个体既产生精子，也产生卵子，由于体内没有自交不相容系统，所以能自体受精，产生子代。

自体受精产生的子代中，只有0.2%是雄性线虫，其余都是雌雄同体的线虫。

一个典型的雌雄同体线虫可产生200~300个精子和大量卵母细胞，自体受精约产生250个子代，若与雄性交配则可产生1000个以上的子代。

雌雄同体的线虫有两条X染色体和5对常染色体。

偶尔由于X染
色体不分离，会产生只有一条X染色体和5对常染色体的雄性线虫。

雄性线虫只产生精子不产生卵子。

当XO型雄性线虫与XX型雌雄同体线虫交配时，产生的子代中，50%是雄体，50%是雌雄同体。

秀丽线虫的模式图及生活史图如下所示：
三、实验材料
秀丽杆菌品系：正常体型线虫（野生型N2）、滚动型线虫（rol突变）、A类短胖鼓泡型线虫（dpy和unc双突变）
四、实验仪器及试剂
1.仪器
体视显微镜，水浴锅，6mm培养皿，铂金丝棒（picker）。

2.试剂
线虫生长培养基，配制方法如下：
称取蛋白胨2.5g，琼脂20g，NaCl 3g，置于洁净2000mL玻璃三角瓶，加入蒸馏水975ml，120℃高压蒸汽灭菌30min，之后置于55℃水浴锅中冷却。

依次加入5mg/ml胆固醇（乙醇溶解，不灭菌）1ml，高压灭菌的1M MgSO4，1M CaCl2，1M KPO4缓冲液（pH6.0）各1ml，摇匀。

1M KPO4缓冲液的配置方法为：称取108.3g KH2PO4 和35.6g K2HPO4，溶于1000mL蒸馏水中，调节pH值到6.0。

五、实验任务
1.观察线虫形态及其生活史。

2.确定rol突变的显隐性，判断是否伴性遗传，并据此验证遗传学分离定律。

3.确定双突变体的两个突变基因是否连锁，若连锁则计算遗传距离。

六、实验方案
1.定期去观察线虫形态以找到各个生长时期线虫的形态特点。

2.取N2雄性与rol突变雌雄同体杂交，比例控制在3:1左右。

观察F1中线虫的性状。

如果后代中绝大多数为雌雄同体，则说明F1多为雌雄同体自交产生的，实验失败。

如果F1中有差不多一半的雄虫，则说明杂交成功，可继续后面的实验。

观察F1形状，将各种情况列表如下：
表1 F1性状分析
由上表可知，仅凭F1，常显和伴显无法区分。

可以取F1中的雄虫与N2雌雄同体交配。

由于rol雄虫的交配能力比较弱，因此可以适当提高雄虫的比例，如5:1。

若后代的雄虫均为野生型，雌雄同体均为rol突变，则rol突变为性染色体显性性状，若后代形状与性别无明显关联，则为常染色体显性性状。

3.取N2雄性与A双突变雌雄同体杂交，由于A生长力较弱，可以适当提高雌雄同体的比例。

F1应均为野生型性状（已知不是伴性遗传）。

去F1中的雌雄同体自交，观察统计后代各个形状的比例，若接近
9:3:3:1，则两个突变基因不连锁，若双突与野生型的比例约为1:3，且仅有少数unc和dmp单突个体，则两个突变基因连锁。

根据后代各个性状的比例可以来计算遗传距离。

七、实验过程
1.前两周练习区分线虫头尾、“雌”雄、形状；熟练挑虫技术；先以挑虫子杂交方法，后来采取chunk的方法制作保种板；观察线虫的生活史。

2.两人分别取12条雄虫与3条雌雄同体杂交，观察F1性状，而后挑取7条rol突变的雌雄同体，放在4个培养基上，令其自交产生F2，观察F2中线虫的性状。

并同时取12条F1中rol突变的雄虫与2条N2雌雄同体交配，观察后代性状。

3.两人分别取10条N2雄虫与5条A双突雌雄同体杂交，观察F1形状。

由于及时去观察，导致“过代”，实验失败。

4.两人分别取10条N2雄虫与5条A双突雌雄同体杂交，观察F1形状。

从两盘中挑出9条雌雄同体，分别放在9个培养皿上，令其自交。

统计F2各个性状数目，计算比例。

同时又取了F1中的12条雄虫，令其与3条N2雌雄同体杂交，观察后代性状，统计数目，计算比例。

5.由于第一次rol的实验结果不太理想，我们又将rol的实验重新做了一遍。

由于这个时候知道了rol不是伴性遗传，不再需要后续的杂交来确定是否伴性，所以我们省去了杂交的步骤，集中精力做了五组F1自交（每组一条虫子）。

八、实验现象观察
1.线虫头尾及性别判断
线虫头部可看到有黑点在移动（线虫在进食）；雄性线虫尾部像是被斜着切了一刀，而雌雄同体则是慢慢收在一起，并且非常细长。

2.各阶段线虫形态观察
卵：在5×10倍镜下观察，呈一个透明的椭圆，非常小，但仔细看还是比较容易辨识的。

各龄幼虫：线虫各个阶段的幼虫在我看来除了长短和粗细之外，整体形态并没有太大差异。

相比于成虫，幼虫普遍比较透明，而且还会在腹部长有白斑。

这个月牙形的白斑也是挑取四龄幼虫做杂交时的一个重要判据（不过据我们观察，更小的线虫也有白斑）。

3.生活史观察
在实际实验的过程中，线虫的生长速度要比我们预期的慢，尤其是A突变。

我觉得这一方面可能是因为培养基面积很大，而虫子数量很少，因此交配进行的较为缓慢，另一方面也可能是A突变本身就会对线虫的生长速度产生一定影响。

我们大致统计了一下，正常线虫的生长速度大概比A突变快1.5倍。

4.形状观察
N2：雌雄同体较雄虫大很多。

线虫行动敏捷，滑行路线为标准的正弦曲线，既可前进也能后退。

rol突变：成熟的雌雄同体比N2要大。

静止时多成C型，滑行时身体翻滚。

但是rol突变的表现型差异还是比较大的。

有的虫子静止时并没有成C型，而且在用picker触碰后也能正常的滑行，只是在滑动了四五圈后会略微的滚动一下，因此常被误认为是N2。

A双突：虫体段胖，行动不利。

经常是不能倒退，或退了一两圈后，身体感觉像是出现一个“结”，无法继续倒退，只能前进（即使用picker 去触碰它的头部）。

unc突变：虫体较N2略短，但明显比A双突要长。

行动不利，倒退不能。

dmp突变：行动正常，但是虫体短胖。

九、原始实验数据
1.rol突变显隐性的判断与遗传分离定律的验证
第一次：
表2 第一次rol实验的统计结果
注：另一盘F1染菌，没有统计。

以上F2为F1自交产生的。

F1中rol突变的雄虫与2条N2雌雄同体交配产生的后代极少，无法计数，后来又长菌，实验失败。

第二次：
表3 第二次rol实验的统计结果
2.判断A双突变体两个突变基因是否连锁，计算遗传距离
第一次：“过代”，实验失败。

第二次：F1均为野生型性状。

F1自交得到的F2性状比例如下：
表4 第二次A实验F2性状分析
注：表中的F2均为F1自交产生的。

F1中的12条雄虫，令其与3条N2雌雄同体杂交，产生的后代中N2 12条，unc 1条，dmp 0条，双突8条。

十、实验数据处理
1.rol突变显隐性的判断与遗传分离定律的验证
第一次：
F1中雄虫37条，雌雄同体51条，雄虫较多，说明F1主要是亲本杂交而非自交产生的。

F1中仅有1条N2，而剩余的87条虫子均表现为rol突变，说明rol为显性突变。

这1条N2很可能是接N2雄虫时不慎带入的小虫子造成的。

F1自交产生的后代F2中第一组rol的比例过高，很可能是所接的F1是亲本自交产生的。

如果是这样的话，F2应均为rol，而实际却数出了6条野生型性状的线虫。

这可以解释为rol是个不容易辨别的性状，可能原本是rol的线虫被误认为成了野生型，这一点会在后面的“分析讨论”中进一步分析。

F2的第2、3、4组数据中，rol：N2没有像第一组那样高得离谱，可以排除F1为亲本自交产生的可能性，但同时rol：N2也远远没有达到3:1的理论值。

假设后代的比例应为3:1，则可计算各组的卡方值，结果如下表：
表5 第一次实验F2的第2、3、4组数据卡方检验
由于只有两个变量，自由度为1，因此没有一组通过卡方检验，说明实验失败。

数据出现如此大偏差的原因会在后面的“分析讨论”中进一步分析。

第二次：
这次较第一次F1数目大大增加了，而我们也考虑到统计F1中的
雄虫与雌雄同体数目没有太大意义，因此为了降低实验的工作量，我们没有一条条去计数，只大概观察了一下，发现盘中有很多的雄虫，可以排除后代多数为亲本自交产生的可能性，便继续后面的实验了。

F1自交产生的后代F2中第3组只有rol突变而没有野生型性状的线虫，可以认为是所接F1由亲本自交产生。

其余四组中rol突变和野生型线虫都占有一定比例，可以排除F1由亲本自交产生的可能性。

假设后代中rol：N2应为3:1，那么对各组数据进行卡方检验，可得下表：
表6 第二次实验F2的第1、2、4、5组数据卡方检验
由于只有两个变量，因此自由度为1，通过查表可知，第2和第5组的数据通过了卡方检验，而第1和第4组的数据没有通过卡方检验。

结果仍不理想，不能有力验证遗传分离定律，其背后的原因会在“分析讨论”中进一步分析。

2.判断A双突变体两个突变基因是否连锁，计算遗传距离
自交：
若两个突变基因连锁，则理论上F1自交产生的F2中N2：双突应为3:1；若两个基因不连锁，则理论上F1自交产生的F2中N2：双突应为9:1。

故可先比较各组F2中N2与双突的数目，计算比例，从而来判断基因连锁与否。

表7 各组F2中N2与双突的数目及其比例
注：红色标示的卡方值超过了可以接受原假设的范围。

可以从上表明显看出，N2：双突应为3:1而不是9:1，两个突变基因连锁。

由于第6、7组数据与3:1的比例偏差较大，说明这几组
实验的数据存在一定问题，因此后面计算遗传距离的时候仅用其余6组数据（第8组虽然也没有通过卡方检验，但相对来说偏差还较小，因此后面的计算也将其考虑在内）。

至于为什么这几组数据误差较大，会在后面的“讨论分析”有所涉及。

用剩余5组数据可以分别算出遗传距离。

下面先推倒计算公式： 假设两个基因A 和B 连锁，重组率为x ，亲本为AB/ab ×AB/ab 。

则产生的配子中AB 和ab 的比例均为()x -12
1，Ab 和aB 的比例均为x 2
1。

产生的后代中各种基因型的比例如下表：
表8 理论上后代各种基因型的比例
所以根据上表可整理出个表型的比例，如下表：
表9 理论上后代各种表现型的比例
所以根据各个表现型的比例可分别算出重组率，进而得到遗传距离。

由各组数据算出的遗传距离如下表所示：
表10 由各组数据计算出的遗传距离
显然，将所有数据加在一起，可以得到更大的统计量，算出的重组率相对偏差也会更小，所以只用上表中的最后一组即“总和”的数据来作为最后的结论。

根据总和算出的重组率分别为0.072、0.074、0.064、0.065，四组数据相差较小，说明实验结果的精确度还是可以令人满意的，求平均可得重组率为0.069，所以遗传距离应为6.9cM。

杂交：
F 1中的12条雄虫，令其与3条N 2雌雄同体杂交，产生的后代中N 2 12条，unc 1条，dmp 0条，双突8条。

故重组率为
048021
1
. ，所
以遗传距离为4.8cM 。

但显然，杂交产生的后代数目较少，因此实验结果并不可靠，还是由自交结果计算出的遗传距离6.9cM 更加可信。

十一、分析讨论 1. 染菌问题
开始时，我们的保种盘是挑虫子杂交做的，经常长菌。

由于是保种盘，所以一旦长菌就不能再使用了，而我们又觉得挑出虫子，让它爬过OP50来“除菌”太麻烦了，因此还曾向其他组的同学结果N 2，感觉非常狼狈。

我觉得，当时频繁长菌的原因主要是挑虫子的操作太不熟练，导致培养基暴露在空气中的时间过长。

当时我们挑10条N 2雄虫大概需要一个半小时，而且还经常戳洞。

由于屡屡失败，我们还经常在操作过程中抱怨几句，这可能也是造成染菌的一个原因。

后来我们的操作熟练的不少，染菌的情况也就不那么多见了。

不过我觉得，彻底的避免染菌还是不太可能的，只要我们能在杂菌旺盛的生长起来之前完成实验就没有问题。

2. 挑选四龄幼虫问题
为了避免雌雄同体在杂交实验之前已经产生了卵，在实验过程中
经常要涉及到挑选四龄幼虫的问题。

虽然四龄幼虫腹部有明显的月牙形白斑，但实验中，四龄幼虫往往比较少，而且还未长到四龄的幼虫腹部也有白斑，因此为了保险起见，我们有时候挑选的幼虫会小一些。

这并不会对实验结果产生影响，但是延长了每次杂交实验的时间。

3.代入卵或幼虫问题
N2，rol或是A的保种盘上往往虫子的密度是比较大的，因此无论是采用粘还是挑的方法，都难免会代入卵或是幼虫，这样就会给后面从F1代里挑虫子来产生F2代造成麻烦。

这也是有时候我们看到了四龄幼虫，但因为其旁边的虫子太多而不得不放弃，选择别的幼虫的原因。

为了减少这个问题对实验的影响，一方面我们在挑虫子的过程中，尽量在培养基的边缘（那里虫子相对稀疏），另一方面，在挑完之后，我们会在下一代长出来之前去看一下杂交盘，如果那里面不慎带进去了卵或是幼虫，那么培养基上就会有相对较大的幼虫，我们会及时将它们挑走。

4.rol突变的判断
像前面所说的那样，rol突变的表现型差异较大，有的“伪装”的非常像N2，我想这也是我们两次rol的实验结果均没有达到理论值3:1的一个主要原因。

当然，后来我们注意到了这一点，在第二次rol 的实验过程中，相比于第一次，更加耐心的去辨别线虫的表现型，数一条杀一条，但结果仍不是十分理想。

5.dmp和unc性状的判断
dmp突变的性状比较明显，很容易判断。

但unc突变不是这样。

理论上，unc应该在后退的时候能看到身体有一个折叠，像个“结”似的，将线虫“卡”住，这种典型的情况我们也看到不少，但实际上更多的unc表现得没有这么明显。

它们虽然摆动起来感觉和N2有所区别，不太协调，但能够倒退3~4圈，而且身体也没有明显被“卡”住的现象。

另外，即便是N2，倒退也没有前进灵活。

在不断地用picker 触碰N2头部时，它们往往也只后退几圈，便向前行进。

因此，unc的判据并不是十分清晰，有一些处在“中间地带”的虫子，往往要看观察同学的主观判断。

而unc或是双突本来就不是多数，所以这种判断上的主观成分对实验结果的影响还是比较大的。

6.过代问题
我们在整个实验过程中出现过一次“过代”的问题，辛辛苦苦做的杂交盘变得毫无用处，感觉很心痛。

当时我们之前看的时候觉得F1太少，马上除亲本可能会使后代的数目太少，因此又等了等，结果一下子F1长成了成虫，无法与亲本区分。

后来我们想了想，A杂交的后代F1本来就不需要计数，没必要量很大，于是第二次实验就很早的将亲本去除，免去了“过代”的风险。

7.计数过程中的不准确
除了上述的一些性状判断不清外，还有一些其他因素会对计数的准确性产生影响。

比如，有的线虫会钻到培养基的下面。

有一个阶段实验室的培养基比较糟糕，非常软而且表面不平滑，即使我们很小心没有戳破培养基，还是会有不少虫子能够钻到培养基的下面。

而一旦有虫子钻了进去，就会在培养基里面到处爬行，钻出更多的洞。

所以那一个时间段我们的杂交盘基本都无法计数，只能舍弃不用。

后来培养基的质地好了，但我们还是偶尔会不小心在培养基上戳洞。

不过我发现，如果洞很小的话，可以用picker将旁边的菌液填到洞里，只要不是等太长时间，线虫一般还不会钻进去。

8.对实验结果的评价
rol突变：实验结果能够很好地说明rol为显性突变，但是F2代的数据却与遗传分离定律有较大出入。

所有的F2，除了由rol自交产生的第一次实验的第一组外，其余均是rol的比例偏低，我觉得这主要是由许多rol被错误的认作N2造成的。

A突变：实验结果能够很好地说明A的两个突变基因连锁，且遗传距离在6.9cM附近。

不过各组根据不同性状比例算出的重组率差异比较大，说明实验的精确度不是很高。

十二、实验结论
1. rol突变为显性突变，实验结果并不能很好验证遗传分离定律。

2. A线虫的两个突变基因连锁，遗传距离在6.9cM左右。

十三、参考文献
[1] 《线虫开放实验指导》word文档赵培
[2] 《线虫开放实验的补充说明》word文档赵培
[3] 《秀丽线虫的遗传分析》 word文档赵培
十四、实验感想及致谢
这是我至今为止做过的第一个完全由自己做主的实验。

虽然看上去，一共就几个任务，感觉会比较轻松，但实际操作起来，难度远比我想象的大，出现的问题也远比我想象的多。

我在这个实验上投入了大量的时间和精力，有时候甚至要在实验室待到晚上一两点（感谢看门儿大爷对我们的耐心和理解）。

但是，我并不觉得这是在浪费时间，因为我们在不断地遇到困难，解决困难的过程中，也取得了很大的进步。

开始时，我连线虫的头尾和“雌雄”都分不清，更不要说在不戳洞的情况下挑一盘虫子了。

那时候，由于操作不熟练，极其简单的事情都要耗费很长时间，感觉非常烦躁。

现在回想起来，那个时候自己的耐心也得到了一定的锻炼。

慢慢地，那些原本很难顺利完成的操作，在我们一遍遍的重复下，终于变得简单了。

但随后新的问题又会接踵而至，于是我们又要去想办法解决。

这就是线虫实验的魅力所在。

我们永远不要去奢望解决了这个问题之后，实验就会一切顺利了，因为一个问题解决了，新的bug一定会涌现出来。

在这个纠结的过程中，
我们的统筹能力，独立思考能力以及动手操作能力都得到了一定的锻炼。

因此，我认为这是一个痛并快乐的过程。

最后，我要感谢助教的耐心指导，在我们摔断了无数根picker 后又非常nice地帮我们补了4根（我也不小心摔断了一根，非常抱歉）。

还要感谢其他组的同学，在我们遇到困难的时候给予了我们很多的帮助。

最后，要感谢我的同组同学李伟锋。

我们是室友，因此几乎每次都是一起去实验室做实验的（所以哪些数据是谁做的也分不太清了）。

他很有耐心，也常常能提出一些富有建设性的意见，让我们的实验顺利进行。

更重要的是，和他在一起做实验非常愉快，我们从来不会因为分工的事情而起争执，这点我觉得非常幸运。