组培常见问题
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●原因：
◆种类和品种间的差异 ◆激素种类和浓度
◆环境条件
◆繁殖苗基质受损
6.不生根或生根率低
●预防：
◆对难生根品种，从激素种类和水平、环境条件综合调控 ◆掌握种类操作要领和质量要求 ◆切割苗基部时，刀要快，用力均匀，平整无损伤 ◆生根苗基部尽是不带愈伤组织 常用的策略：a、降低培养基盐浓度； b、适当增大IAA用量，不用或少用CYT； c、减少糖供应、增加光照以增强植株的自养 能力； d、对难生根材料采取微体嫁接、化学刺激等 方法处理；
●原因：激素浓度和选用的种类不当； 环境恶化和不适。
●预防：降低CTK浓度，调整生长素与 CTK的比例；改善环境条件。
ห้องสมุดไป่ตู้ 4.增殖率低下或过盛
●原因：与品种特性有关； 与激素浓度和配比有关。 ●预防：确定一定范围的激素比试验， 根据长势确定配方，并及时调整； 交替使用两种培养基； 考虑品种的田间表现和特性， 优化培养环境。
第四章 组培常见问题及对策
一、污染的原因及预防
二、褐变的原因及预防
★
★ ★
三、玻璃化的原因及预防
四、其它(自学)
★
一、污染
1.污染概念：在组培过程中培养基 和培养材料滋生杂菌，导致培养失 败的现象。
2.污染原因：细菌、真菌为病源菌； 污染途径有外植体带菌，培养基及 器皿灭菌不彻底，操作人员未遵守 操作规程，环境不清洁。
（3）多种药液交替浸泡法
对容易污染而难灭菌的材料： 首先取茎尖、芽或器官外植体，用自来水及肥皂充分洗净， 表面不可附着污垢、灰尘，用剪刀修剪掉外植体上无用的 部分，剥去芽上鳞片； 第2将材料放入70%—75%医用洒精中灭菌数秒钟； 第3在1：500Roccal B（一种商品灭菌剂名）稀释液中浸 5min 第4放入5%—10%次氯酸钠溶液中并滴入“吐温80”数滴，灭 菌15—30min，或浸入0.1%—0.2%升汞溶液中并加入“吐温 80”数滴，灭菌5—10min； 第5，用无菌水冲洗5次。也可以在从次氯酸钠溶液中取出 后，再放入无菌的0.1mol盐酸（HCl）中浸片刻，再用无菌 水冲洗数次。
3.污染特点
（1）真菌污染的特点：污染部分长有不同颜色的霉菌，在 接种后3～10天才能发现。 原因：周围环境不清洁 超净工作台的过滤装置失效 培养用器皿的口径过大等 为了减少损失，提高工作效率，必须在每个操作环节 注意防止污染的发生。 （2）细菌污染的特点：菌斑呈粘液状物，而且在接种后1～ 2天即可发现。 原因：材料带菌 培养基灭菌不彻底 操作人员未遵守操作规程 因此接种人员的手应经常用70%洒精擦净，镊子和接种 针在使用前必须在火焰上烧红。
复习思考：
组培苗污染、褐变、玻璃化产生的 原因有哪些？怎样预防？
四、组培其它常见问题
1.材料死亡
3.变异和畸形 4.增殖率低下或过盛 5.组培苗瘦弱或徒长 6.不生根或生根率低 7.过渡苗死亡率高
2.黄
化
1.材料死亡
1.材料死亡原因与预防
外植体灭菌过度 污 染 灭菌浓度和时间适宜
注意环境和个人卫生， 严格操作 选用合适培养基
5.组培苗瘦弱或徒长
●原因
◆［CTK］过高，过多不定芽未及时 转移和分切 ◆通气不良 ◆温度过高
◆光照不足 ◆培养基水分过多
5.组培苗瘦弱或徒长
●预防措施
◆适当增加培养 基硬度 ◆加速转瓶，降 低接种量 ◆减少CTK用量 ◆用透气膜做封口
◆提高光强，延长 ◆降低环境温度 光照时间
6.不生根或生根率低
（2）多次灭菌法：
如咖啡成熟叶片的灭菌即用这种方法。首先除去主 脉（因主脉与支脉交界处常有真菌休眠孢子存在） ，同时去掉叶的顶端、基部和边缘部分，这样可大 大减少污染；其次，将切好的外植体放入1.3%的次 氯酸盐溶液中（商品漂白粉25%的溶液），灭菌 30min；第3，在无菌蒸馏水中冲洗3次；第4，将材 料封闭在无菌的培养皿中过夜，保持一定温度；第 5，次日将叶片用2.6%次氯酸钠灭菌30min，然后， 用蒸馏水洗3次。对层积过的种子也可用多次灭菌 法，在种子吸胀前后都要灭菌，在层积贮藏的第一 周还应增加1次灭菌处理。
2.褐变原因 多酚氧化酶 木质素 醌
[O]
积累造成毒害。
3.影响褐变的因素
（1）植物品种（基因型）木>草
（2）生理状态
（3）培养基成分
（4）培养条件 （5）材料转移时间 长>短
生理状态
材料年龄：幼龄期＜成年型 材料大小：小材料 ＜大材料 组织：细嫩组织＜老熟组织
注意：在枝条取芽时期、部位及切口！
4.预防措施
（1）防止材料带菌：避免阴雨天在室外 采集外植体；春秋组培；材料预培养。 （2）严格外植体灭菌 （3）接种用具灭菌彻底 （4）严守无菌操作规程 （5）保持培养室清洁
（6）做好超净工作台检修、养护
（7）其它方面
★
防止材料带菌的措施
（1）用茎尖作外植体时，可在室内或无菌条件下对枝条先 进行预培养。 •枝条 水洗净 插入无糖的营养液或自来水抽枝 以这种新抽的嫩枝条作为外植体接种。这样便可大大减少材 料的污染。 •或在无菌条件下对采自田间的枝条进行暗培养，待抽出徒 长的黄化枝条时采枝，经灭菌后接种也可明显减少污染。
夏季＜冬春季 分生部位＜分化部位 小＜大
★
培养基成分
★无机盐浓度过高、CTK水平过高
★外植体在最适宜的脱分化条件下，
细胞大量增殖，抑制褐变。
★液体培养不容易褐变。
★ PH高容易褐变。
★
培养条件
光照过强， 温度过高， 培养时间过 长，加速褐 变。
★
4.褐变的防止措施
（1）选择适宜的外植体 （2）选择合适的培养条件 （3）外植体预处理（还原剂浸泡） （4）加快继代转接的速度 （5）加抗氧化剂（VC、PVP、牛血清、 牛蛋白） （6）加0.1－0.5%活性炭
7.过渡苗死亡率高
●原因：
◆组培苗质量差 ◆环境条件不适
◆管理不精细
7.过渡苗死亡率高
●预防：
◆培育高质量组培苗
◆及时出瓶，尽快移栽
◆改善环境条件 ◆采取配套的管理措施，加强过渡苗 的肥水管理和病虫害防治
复习思考题：
组培常见问题有哪些产生的 原因有哪些？怎样预防？
5.组培苗污染后的处理
发现污染的材料应及时处理，否则将导致培养室 环境污染。
对一些特别宝贵的材料，可以取出再次进行更为
严格的灭菌，然后接入新鲜的培养基中重新培养。 要处理的污染培养瓶最好在打开瓶盖前，先集中 进行高压灭菌，再清除污染物，然后洗净备用。
二、褐变
1.褐变的概念
褐变——是指外植体在培养过程，自身组织从表 面向培养基释放出褐色物质，以致培养基逐渐变 成褐色，外植体也随之进一步变褐而死亡的现象。
3.预防措施：
（1）适当控制培养基中无机盐成分，适当提高蔗糖 和琼脂浓度，减少含氮化合物的用量，降低培养基 的水势。 （2）适当降低CTK和GA的浓度。考虑加入适当的脱 落酸。 （3）增加自然光照，控制光照时间；增加容器通气， 控制温度。
（4）加入其他物质（如活性炭、多效唑、间苯三本 分、根皮苷、CCC）。
改善培养环境，及 时转移和分瓶 加强组培苗的过渡 管理
培养基不适宜或配 制有问题 培养环境恶化
2.黄 化
2.黄 化
●原因： 培养基中Fe含量不足 矿物营养不均衡 激素配比不当 培养环境通气不良， 瓶内乙烯量高 光照不足 培养温度不适
糖用量不足， 长期不转移
●预防：针对黄化原因对症下药
3.变异和畸形
三、玻璃化 1.概念
是试管苗的一种生理失 调症，在植物材料进行离 体培养时，有些培养物的 嫩茎或叶片呈现半透明或
水渍状的现象。
形态：植株矮小，节间 短，叶水渍状、半透明、 脆易碎。
2.原因：细胞过程中的环境变化引起。 导致玻璃化的因素有以下几方面： （1）激素浓度（尤其CTK）增加或 CTK╱IAA高 （2）琼脂浓度低 （3）光照时间大于15h （4）温度低，湿度大 （5）通风条件不好 （6）培养基离子种类及比例不适宜
◆种类和品种间的差异 ◆激素种类和浓度
◆环境条件
◆繁殖苗基质受损
6.不生根或生根率低
●预防：
◆对难生根品种，从激素种类和水平、环境条件综合调控 ◆掌握种类操作要领和质量要求 ◆切割苗基部时，刀要快，用力均匀，平整无损伤 ◆生根苗基部尽是不带愈伤组织 常用的策略：a、降低培养基盐浓度； b、适当增大IAA用量，不用或少用CYT； c、减少糖供应、增加光照以增强植株的自养 能力； d、对难生根材料采取微体嫁接、化学刺激等 方法处理；
●原因：激素浓度和选用的种类不当； 环境恶化和不适。
●预防：降低CTK浓度，调整生长素与 CTK的比例；改善环境条件。
ห้องสมุดไป่ตู้ 4.增殖率低下或过盛
●原因：与品种特性有关； 与激素浓度和配比有关。 ●预防：确定一定范围的激素比试验， 根据长势确定配方，并及时调整； 交替使用两种培养基； 考虑品种的田间表现和特性， 优化培养环境。
第四章 组培常见问题及对策
一、污染的原因及预防
二、褐变的原因及预防
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三、玻璃化的原因及预防
四、其它(自学)
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一、污染
1.污染概念：在组培过程中培养基 和培养材料滋生杂菌，导致培养失 败的现象。
2.污染原因：细菌、真菌为病源菌； 污染途径有外植体带菌，培养基及 器皿灭菌不彻底，操作人员未遵守 操作规程，环境不清洁。
（3）多种药液交替浸泡法
对容易污染而难灭菌的材料： 首先取茎尖、芽或器官外植体，用自来水及肥皂充分洗净， 表面不可附着污垢、灰尘，用剪刀修剪掉外植体上无用的 部分，剥去芽上鳞片； 第2将材料放入70%—75%医用洒精中灭菌数秒钟； 第3在1：500Roccal B（一种商品灭菌剂名）稀释液中浸 5min 第4放入5%—10%次氯酸钠溶液中并滴入“吐温80”数滴，灭 菌15—30min，或浸入0.1%—0.2%升汞溶液中并加入“吐温 80”数滴，灭菌5—10min； 第5，用无菌水冲洗5次。也可以在从次氯酸钠溶液中取出 后，再放入无菌的0.1mol盐酸（HCl）中浸片刻，再用无菌 水冲洗数次。
3.污染特点
（1）真菌污染的特点：污染部分长有不同颜色的霉菌，在 接种后3～10天才能发现。 原因：周围环境不清洁 超净工作台的过滤装置失效 培养用器皿的口径过大等 为了减少损失，提高工作效率，必须在每个操作环节 注意防止污染的发生。 （2）细菌污染的特点：菌斑呈粘液状物，而且在接种后1～ 2天即可发现。 原因：材料带菌 培养基灭菌不彻底 操作人员未遵守操作规程 因此接种人员的手应经常用70%洒精擦净，镊子和接种 针在使用前必须在火焰上烧红。
复习思考：
组培苗污染、褐变、玻璃化产生的 原因有哪些？怎样预防？
四、组培其它常见问题
1.材料死亡
3.变异和畸形 4.增殖率低下或过盛 5.组培苗瘦弱或徒长 6.不生根或生根率低 7.过渡苗死亡率高
2.黄
化
1.材料死亡
1.材料死亡原因与预防
外植体灭菌过度 污 染 灭菌浓度和时间适宜
注意环境和个人卫生， 严格操作 选用合适培养基
5.组培苗瘦弱或徒长
●原因
◆［CTK］过高，过多不定芽未及时 转移和分切 ◆通气不良 ◆温度过高
◆光照不足 ◆培养基水分过多
5.组培苗瘦弱或徒长
●预防措施
◆适当增加培养 基硬度 ◆加速转瓶，降 低接种量 ◆减少CTK用量 ◆用透气膜做封口
◆提高光强，延长 ◆降低环境温度 光照时间
6.不生根或生根率低
（2）多次灭菌法：
如咖啡成熟叶片的灭菌即用这种方法。首先除去主 脉（因主脉与支脉交界处常有真菌休眠孢子存在） ，同时去掉叶的顶端、基部和边缘部分，这样可大 大减少污染；其次，将切好的外植体放入1.3%的次 氯酸盐溶液中（商品漂白粉25%的溶液），灭菌 30min；第3，在无菌蒸馏水中冲洗3次；第4，将材 料封闭在无菌的培养皿中过夜，保持一定温度；第 5，次日将叶片用2.6%次氯酸钠灭菌30min，然后， 用蒸馏水洗3次。对层积过的种子也可用多次灭菌 法，在种子吸胀前后都要灭菌，在层积贮藏的第一 周还应增加1次灭菌处理。
2.褐变原因 多酚氧化酶 木质素 醌
[O]
积累造成毒害。
3.影响褐变的因素
（1）植物品种（基因型）木>草
（2）生理状态
（3）培养基成分
（4）培养条件 （5）材料转移时间 长>短
生理状态
材料年龄：幼龄期＜成年型 材料大小：小材料 ＜大材料 组织：细嫩组织＜老熟组织
注意：在枝条取芽时期、部位及切口！
4.预防措施
（1）防止材料带菌：避免阴雨天在室外 采集外植体；春秋组培；材料预培养。 （2）严格外植体灭菌 （3）接种用具灭菌彻底 （4）严守无菌操作规程 （5）保持培养室清洁
（6）做好超净工作台检修、养护
（7）其它方面
★
防止材料带菌的措施
（1）用茎尖作外植体时，可在室内或无菌条件下对枝条先 进行预培养。 •枝条 水洗净 插入无糖的营养液或自来水抽枝 以这种新抽的嫩枝条作为外植体接种。这样便可大大减少材 料的污染。 •或在无菌条件下对采自田间的枝条进行暗培养，待抽出徒 长的黄化枝条时采枝，经灭菌后接种也可明显减少污染。
夏季＜冬春季 分生部位＜分化部位 小＜大
★
培养基成分
★无机盐浓度过高、CTK水平过高
★外植体在最适宜的脱分化条件下，
细胞大量增殖，抑制褐变。
★液体培养不容易褐变。
★ PH高容易褐变。
★
培养条件
光照过强， 温度过高， 培养时间过 长，加速褐 变。
★
4.褐变的防止措施
（1）选择适宜的外植体 （2）选择合适的培养条件 （3）外植体预处理（还原剂浸泡） （4）加快继代转接的速度 （5）加抗氧化剂（VC、PVP、牛血清、 牛蛋白） （6）加0.1－0.5%活性炭
7.过渡苗死亡率高
●原因：
◆组培苗质量差 ◆环境条件不适
◆管理不精细
7.过渡苗死亡率高
●预防：
◆培育高质量组培苗
◆及时出瓶，尽快移栽
◆改善环境条件 ◆采取配套的管理措施，加强过渡苗 的肥水管理和病虫害防治
复习思考题：
组培常见问题有哪些产生的 原因有哪些？怎样预防？
5.组培苗污染后的处理
发现污染的材料应及时处理，否则将导致培养室 环境污染。
对一些特别宝贵的材料，可以取出再次进行更为
严格的灭菌，然后接入新鲜的培养基中重新培养。 要处理的污染培养瓶最好在打开瓶盖前，先集中 进行高压灭菌，再清除污染物，然后洗净备用。
二、褐变
1.褐变的概念
褐变——是指外植体在培养过程，自身组织从表 面向培养基释放出褐色物质，以致培养基逐渐变 成褐色，外植体也随之进一步变褐而死亡的现象。
3.预防措施：
（1）适当控制培养基中无机盐成分，适当提高蔗糖 和琼脂浓度，减少含氮化合物的用量，降低培养基 的水势。 （2）适当降低CTK和GA的浓度。考虑加入适当的脱 落酸。 （3）增加自然光照，控制光照时间；增加容器通气， 控制温度。
（4）加入其他物质（如活性炭、多效唑、间苯三本 分、根皮苷、CCC）。
改善培养环境，及 时转移和分瓶 加强组培苗的过渡 管理
培养基不适宜或配 制有问题 培养环境恶化
2.黄 化
2.黄 化
●原因： 培养基中Fe含量不足 矿物营养不均衡 激素配比不当 培养环境通气不良， 瓶内乙烯量高 光照不足 培养温度不适
糖用量不足， 长期不转移
●预防：针对黄化原因对症下药
3.变异和畸形
三、玻璃化 1.概念
是试管苗的一种生理失 调症，在植物材料进行离 体培养时，有些培养物的 嫩茎或叶片呈现半透明或
水渍状的现象。
形态：植株矮小，节间 短，叶水渍状、半透明、 脆易碎。
2.原因：细胞过程中的环境变化引起。 导致玻璃化的因素有以下几方面： （1）激素浓度（尤其CTK）增加或 CTK╱IAA高 （2）琼脂浓度低 （3）光照时间大于15h （4）温度低，湿度大 （5）通风条件不好 （6）培养基离子种类及比例不适宜