基因的克隆与表达-2005范例

一、质粒（plasmid)
（一） 一般特性
Plasmid：染色体外能够进行自主复制的遗传单位。
包括真核生物的细胞器和细菌细胞中染色体以外的 脱氧核糖核酸(DNA)分子。现在习惯上用来专指细 菌、酵母菌和放线菌等生物中染色体以外的DNA分 子。在基因工程中质粒常被用做基因的载体 多为环状双链DNA 可自我独立复制 天然存在：F质粒、R质粒等
第一节 概述
一、概念 克隆载体（cloning vector)：用于携 带目的基因（外源基因）进入受体 细胞进行复制、扩增的工具。
二、特点
1、能独立复制，具有复制子（replican)
＊replican：基因组中能独立复制的最小单 位，含复制起始点（ ori)和复制终点。 ＊ DNA的复制由ori控制
5、具有筛选标记
6、分子量合适（3-10kb)
7、高拷贝数 拷贝数（copy):一个细胞内存在的 分子数 8、生物安全性好
三、常用克隆载体种类
质粒（plasmid) 噬菌体（bacteriophage ) 粘粒（cosmid） M13噬菌体（bateriophage M13） 人工染色体
第二节 常用克隆载体介绍
-原核基因表达 -真核基因表达
第五章 基因工程的克隆载体
Genetic Cloning Vector
基因工程的目的
基因克隆-----获得目的基因 基因表达-----使受体的新性状表现，获 得大量目的蛋白 In vivo expression In vitro expression
。载体---基因工程中的重要工具
该类载体经改造后的长度约为40kb，在非必需 区域内含有两个相同的酶切口，两者间的距离为14kb 长，使用时用酶切开，分离去除这个14kb长的DNA片 段，然后用外源DNA片段取代之。 特点：容量大，且有一个下限：40-14kb=26kb包装下限 为36.4kb，因此其载装下限为10.4而上限为25.5kb。 不再需要标记基因，因为空载的载体DNA只有 26kb，不可能被包装，因而无法进入受体细胞中去。
＊原核细胞的染色体和质粒有固定的ori
＊真核细胞的染色体有多个ori
2、属于松弛型复制子 3、具有复制非必需区 4、有一个或多个单一酶切位点，即多克隆位点
多克隆位点（Multiple cloning site,MCS）： 一段人工合成的DNA序列，其上含有密集排列 的多种单一限制性内切酶位点，以利于不同来 源的外源DNA插入载体。
载体DNA两条链的5’端有 一个游离的T：PCR产物 的直接克隆 SP6、T7启动子：体外转 录、为克隆产物的测序 提供特异性引物 插入位点两侧的酶切位 点：为回收克隆片段进 行亚克隆提供便利的酶 切位点
5、pCDNA3----穿梭载体
穿梭载体（shuttle vector) 即可以携带外源基因在原核细 胞中复制，又可以使其在真核细胞 中表达的载体。
（三） λ噬菌体载体
1、基本组成元件
• Cos位点 • 左臂（头尾基因） • 右臂（裂解基因） • 酶切位点
噬菌体载体
Biblioteka Baidu2、类型：
插入型载体：含有单个或多个单一酶切 位点供外源基因插
替换型载体：含有一对或多对酶切位点 便于外源基因替换
插入型载体(insertion vector)
该类载体经改造后的长度为37kb，为包装 的下限，它本身也能被包装，其允许的插入片段 最大为13.9kb（54.9-37kb）。 由于该类载体重组与否均可包装，因而为 区分重组子与非重组子必须携带标记基因。（013.9kb）
（五）常用质粒介绍
1、 pBR322—77年Boliver构建
•质粒命名原则 •4.36kb
•双标记
•分散的多个单一酶切位点 •插入灭活 •双抗菌素对照实验
插入失活、双抗菌素对照实验
pBR322衍生质粒
2、 pUC18/19—pBR322的重要衍生质粒
1983年构建：pBR322+M13
基因的克隆与表达
山东大学医学院免疫学研究所 马春红
基因工程（Genetic engineering,Ge):通 过体外重组技术,人为操作基因、改造基 因，改变生物遗传性状的过程。 • 基本手段：分子生物学技术 （体外重组、杂交、电泳等） • 目的：基因克隆 基因表达
主要内容
基因工程的克隆载体(genetic cloning vector) 基因克隆(gene clonging) 基因表达(gene expression)
复制仅需DNA聚合酶I，不 需蛋白质合成 宿主细胞蛋白质合成及染色 体复制停止时，可大量扩增至上千份 （氯霉素）
构型：
超螺旋型（supercoiled circle,SC) or 共价闭环双股DNA( covalently closed circle,CCC) 开环型（opened circle,OC） 线形（linear circle,LC)
载体(vector)：携带外源DNA进入宿主细胞的 工具 载体的功能 1.运送外源基因高效转入受体细胞 2.为外源基因提供复制能力或整合能力 3.为外源基因的扩增或表达提供条件
载体的两种扩增方式---自主复制型载 体和附加载体
克隆载体（cloning vector)
• 定义 • 特点 • 常用载体介绍
pGEM-3/4Z----MCS位于lacZ’基因内部
•插入失活—蓝白斑筛选
•具有SP6、T7启动子
pGEM-3Zf(+)/(-)----引入丝状噬菌体f1(+)/(-) 复制起始点
• 可以产生单链DNA，并 分泌至上清中，便于对 插入片段进行测序 • F1的方向(+/-)决定复制 哪一条链
4、 T-vector—用于PCR产物的直接克隆
（减小分子量、引入MCS及辅助序列）
单标记、复制效 率低
双标记，50%以上 的复制非必需区
物理图谱（physical map): 在DNA分子上标 明限制性内切酶位点、 数目、排列顺序及特 征性功能标记的图形。 又称为限制图谱 （restriction map) 载体物理图谱识图要求 1、载体大小 2、载体类型
诱导物(IPTG)
lacZ’表达 -半乳糖苷酶N 端片段（-肽） 宿主细胞lacZM15 缺陷型-半乳糖苷酶
-半乳糖苷酶
X-gal变兰色
pUC载体蓝白斑筛选的原理----插入失活2
pUC载体(含lacZ’、lacI基因）
外源基因插入 lacZ’失活 不产生-半乳糖苷酶N端 片段（-肽）
两种解决方案：
1）缩短长度：λ－DNA上约有40-50%的DNA片段是 复制，裂解所不必需的，将之切除便可提高载量。 2）修饰酶切识别位点：利用自然选择法获得限制 性位点缺失的λ品系。 天然的λ-DNA上有多个酶切位点，如：EcoRI 5个， HindIII 7个，这些多余的酶切位点必须被修饰。
自然选择法：利用一 个产生EcoRI的大肠杆菌， 大部分侵入细胞的λ DNA分子会被限制性酶破 坏，少部分能够成活， 这些就是突变型的噬菌 体，其EcoRI位点缺失了。
X-gal不变色，呈白色
3、 pGEM系列
pGEM-1—MCS两侧有SP6、T7RNA聚合酶 启动子
pGEM-1—MCS两侧有SP6、T7RNA 聚合酶启动子
1、可进行体外转录 转录具有特异性 可分别转录插入片段的两条链 转录产物可制备体外翻译的模板、 探针及反义RNA 2、为插入片段的测序提供特异引物位 点
Λgt10：可以携带8kb的DNA分子，插入位于cI基 因内的单一的酶切位点EcoRI。插入失活导致 裂解循环，从而很容易识别重组子。
λZAPII：含有多聚接头，可以使用六种不同的 限制性内切酶插入约10kb的新的DNA分子，通 过lacZ’基因的插入失活鉴定重组子，不能形 成蓝色的噬菌斑。
替换型载体(replacement vector)
小
结
质粒的发展趋势： 调整质粒结构、提高载体效率：减小分子 量、引入MCS 引入多种用途的辅助序列: lacZ’、lacI基因：蓝白斑筛选 SP6、T7RNA聚合酶启动子：体外转录 F1复制起始点：产生单链DNA 真核启动子：穿梭载体
二、
噬菌体载体
（一）λ噬菌体的分子生物学
1、λ噬菌体是大肠杆菌的噬菌体，它由外壳蛋 白和λ-DNA组成 2、λ-DNA： 线状双链DNA分子，全长48.5kb 两端各有一个12核苷酸的互补单链（粘性末 端，GGGCGGCGACCT, CCCGCCGCTGGA，称为 Cos位点（cohesive end）或cos区。 功能相近的基因在基因组中聚集在一起。
3、载体组成
物理图谱（phisical map)
4、载体主要元件（特点） 及其应用
（四）常见人工构建质粒的分类:
人工构建的质粒根据其功能及用途分为: 1.多拷贝质粒 复制子经过人工突变，除去控制拷贝数 负调节基因，使质粒拷贝数达到每个细胞数千，用于 扩增外源基因。 2.测序质粒 3.整合质粒 装有整合促进基因及整合特异序列，便于 外源基因准确重组整合入受体细胞的染色体上 4.穿梭质粒 含有两个不同的复制子，能在两种不同的 受体细胞中复制 5.表达质粒 装有强的启动基因，合适的顺序以及有效 的终止子，以便任何外源基因在受体细胞内的高效表 达
噬菌体生物学性状介绍
3、基因组成：
Cos位点（cohesive end)： λ DNA分子两端各有一个 12碱基长的互补单链顺序，是天然的粘性末端，称 cos 位点 左臂（编码外壳蛋白）：头部基因（7个）、尾部基因 （11个） 右臂（负责裂解宿主细胞、DNA自主复制以及调控)：裂 解基因（2个） 中间段(控制基因组整合到寄主基因的基因)：DNA复制 及溶菌生长非必需区（重组基因、正调控基因、负调控 基因）、DNA合成基因
（二）分类
大小：小型质粒(15kb )
大型质粒(60kb)
功能：F质粒、R质粒
宿主：窄宿主范围质粒：ori特异，仅能 在一种宿主中复制 宽宿主范围质粒：ori不特异，可 在多种宿主中复制
复制类型：
严紧型质粒：复制受宿主细胞的严格控制
低拷贝数（1-2copies/cell)
松弛型质粒：拷贝数高(10-200 copies/cell)
λWES. λB’：两个 EcoRI位点跨越替换区 域，根据分子大小筛选重组子。
λEMBL4：可以插入20kb的DNA分子，可利用 EcoRI、BamHI、SalI替换填充片段，因此 可以插入不同粘端的DNA片断。
EMBL3
噬菌体载体
3、体外包装
将重组的噬菌体DNA分子与噬菌体头、 尾部蛋白混合，通过自动包装，体 外组成完整的具有极强感染性噬菌 体颗粒的过程。
（三）克隆质粒的构建
1、构建质粒的目的 调整质粒结构、提高转化率 2、常用手段： 减小分子量 引入MCS 引入具有多种用途的辅助序列
3、克隆质粒的发展趋势
向天然质粒中引入选择标记, pSC101
多个质粒重组，增强选择标记，过大，pBR31 减小复制非必需区，缩小分子量，pBR322
调整质粒结构，提高载体序列
噬菌体载体
外源基因
替换/插入
重组噬菌体DNA
噬菌体头、尾蛋白
体外包装
感染力较低 感染力极强
子代病毒颗粒
转染
宿主 大量扩增目的DNA
噬菌体载体
4、用途：
构建文库，容量大
5.λ-DNA作为载体的优点
1) λ-DNA可在体外包装成噬菌体颗粒， 能高效感染大肠杆菌 2) λ-DNA作为载体，其装载外源DNA的 能力为25kb，远远大于质粒的装载量 3) 重组λ-DNA的筛选较为方便 4) 重组λ-DNA分子的提取比质粒容易
基本元件：ori
Ampr
MCS
辅助序列：lacZ’基因 lacI基因
乳糖操纵子
•lacZ基因编码-半乳糖苷酶
•lacI基因编码阻遏蛋白,使lacZ不能表达
• 诱导物与阻遏蛋白结合,lacZ表达
乳糖操纵子的表达调控
pUC载体蓝白斑筛选的原理----插入失活1
pUC载体(含lacZ’、lacI基因）
cos位点的作用
4、生活周期—温和性噬菌体
（二）λ－DNA载体的构建
建立λ克隆载体前需要解决2个问题：
1）包装容量有限：λDNA分子只能增加 5%的大小，意味着只能插入3kb的DNA分子。 2）酶切位点复杂： λ基因组非常大， 对于每一种酶来讲都含有超过1个的识别序 列，酶切后产生多个片段，连接不能形成λ 基因组。