基因表达分析技术
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2015/11/8 19
2015/11/8
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2015/11/8
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三、注意事项
2015/11/8
22
谢谢!
请老师和各位 同学指正
2015/11/8 24
2015/11/8
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相对定量分析方法1
2 -ΔΔCt
前提:目标序列和内参序列的扩增效率接近100 %且偏差在5%以内。
靶基因A 对照组 实验组 GAPDH ΔCt
1.计算ΔCt:ΔCt=Ct
靶基因-Ct GAPDH,分别计算实验组
和对照组的ΔCt。 2.计算ΔΔCt:ΔΔwk.baidu.comt=ΔCt实验组-ΔCt对照组。
3.计算相对表达量的差值。2
-ΔΔCt
相对定量分析方法2:双标准曲线法
前提:目标基因与内参基因扩增效率不同
待测样品目的基因浓度
待测样品内参基因浓度
F=
对照样品目的基因浓度
对照样品内参基因浓度
二、基因表达分析的具体步骤
1、提取RNA,并鉴定所提RNA的完整性(0.8%的琼脂糖凝胶 电泳)和纯度(紫外分光光度计(2.0-2.2))。
2015/11/8
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2、反转录
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14
3、设计引物
(1)、NCBI 官网 gene bank 查找xx基因cDNA序列,根据 cDNA序列设计RT-qPCR引物,产物长度80-150bp最佳。引物 由primer 5软件设计,正反引物的Tm 值相差小于2,GC%比小 于3。 (2)、设计好的引物再通过NCBI blast 引物比对官网进行初步 筛选,并将设计好的引物交由相关基因公司(如华大基因)合 成。 (3)、新合成的引物以cDNA 为模板,添加gene star PCR mix 进行预实验,设计多个实验重复,ABI梯度PCR仪上进行梯 度PCR扩增,产物进行琼脂糖凝胶电泳,marker 比对结果判定 产物大小及引物退火温度的最佳条件。 (4)、将ABI 梯度PCR 仪在最佳退火条件下扩增的PCR产物 交由相关基因公司(如华大基因)进行普通测序,用于判断测 序结果与目标片段是否吻合,引物位置与初始引物设计位置是 否相同。
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4、内参筛选
根据实验样品类型及条件,选取相关基因(如 GAPDH 、ᵦ-actin等)为备选内参基因, geNorm 软件分析备选内参在实验样本中的稳 定性,以M<1.5为最佳内参。
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5、确定目的基因和内参基因的扩增效率 及定量PCR数据处理方法
根据绝对定量PCR 原理,对cDNA进 行5个数量级的10 倍梯度稀释,利用 各个浓度的cDNA 进行绝对定量以获 得相关基因的扩增 效率。
医学分子遗传学 第四章分子遗传技术方法
METHODS FOR ANALYZING GENE EXPRESSION
基因表达分析技术
Speaker:
2015/11/8 1
gene
mRNA
Protein polypeptide chain Gene Expression
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一、实时荧光定量PCR (real time quantitative PCR,RT-qPCR)
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6、实时荧光定量PCR (real time quantitative PCR, RT-qPCR)反应体系
反应体系 SYBR Green I Master Mix Forward Primer(10umol/L) Reverse Primer(10umol/L) cDNA 模板 Rnase ddH2O 总体积 体积 10ul 1ul 1ul 1ul 7ul 20ul
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Ct( threshold value )值是指荧光信号达到 设定阈值时所经历的循环数,此时荧光信号明 显高于背景荧光信号。
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Ct值与模板起始浓度的关系
• 模板起始浓度越高,Ct值越小 • Ct值与模板起始拷贝数的对数存在线性关系
• 如果模板浓度增加1倍,Ct值就提前1个循 环到达 • 如果模板浓度减少1倍,Ct值就滞后1个循 环到达 2015/11/8
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非特异性荧光染料标记: 特异性荧光标记: SYBR Green I TaqMan
荧光信号强 与特异性的荧光探针相比价格便 与其它探针相比设计简单 宜 可用于多通道检测 可用于SNP的检测 只需要设计PCR引物
优点
缺点
由于它和模板的结合是非特异性 的,它可以和所有的双链DNA包 比DNA结合染料价格高 括引物和非特异性扩增产物结合, 不能真实反映目 的基因的扩增 情况
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实时荧光定量PCR (real time quantitative PCR,RT-qPCR)是荧光化学物质与PCR产物相 结合,在PCR反应体系中加入荧光基 团,利用荧光信号累积实现了实时监测 整个PCR进程,对起始模板进行定量 分析的方法。
荧光定量实时PCR与普通PCR的比较
在线实时监控 对样品扩增的整个过程进行实时监控,能够实时地观察到产 物的增加,直观地看到反应的对数期 降低反应的非特异性 使用引物和荧光探针同时与模板特异性结合,提高了PCR反 应的特异性 增加定量的精确性
全程监控,精确定量
结果分析更快捷方便,无需电泳
荧光染料 SYBR Green I 是一种结合于双链 DNA(double-strand,dsDNA) 小沟中的荧 光染料,游离的荧光染料不发出信号,所以 开始时检测不到荧光信号,随着扩增的进行, 染料不断地与dsDNA结合而发出荧光,被荧 光探测系统检测到。
每个样本基因的PCR反应设置3个平行重复以保证 实验结果的准确性,数据处理采用均值计算。
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反应条件
温度和时间 基因 循环
预变性
变性
退火
40
PCR均采用10 min预变性,彻底打开聚合酶活性。为了 提高PCR扩增效率,采用变性及退火进行扩增40个循环。 扩增结束后在相应的温度和时间中进行变性和退火后开 始“溶解曲线程序”。通过溶解曲线判断产物的单一性 及引物特性。
9
相对定量(Relative quantification)是计算要处理样本相 对于正常(内参基因)样本的基因表达量变化,属于 倍数关系式,扩增效率达到100%时用2 -∆∆CT 法来分析 处理实验数据。实验过程中还要引入一个或多个内参 基因进行校正和标准化。 内参基因(Reference gene)是指在不同类型细胞、不同实验 处理条件下恒定表达的一类管家基因,常用的内参基因 有b-actin、GAPDH、18sRNA、efla等。
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三、注意事项
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谢谢!
请老师和各位 同学指正
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相对定量分析方法1
2 -ΔΔCt
前提:目标序列和内参序列的扩增效率接近100 %且偏差在5%以内。
靶基因A 对照组 实验组 GAPDH ΔCt
1.计算ΔCt:ΔCt=Ct
靶基因-Ct GAPDH,分别计算实验组
和对照组的ΔCt。 2.计算ΔΔCt:ΔΔwk.baidu.comt=ΔCt实验组-ΔCt对照组。
3.计算相对表达量的差值。2
-ΔΔCt
相对定量分析方法2:双标准曲线法
前提:目标基因与内参基因扩增效率不同
待测样品目的基因浓度
待测样品内参基因浓度
F=
对照样品目的基因浓度
对照样品内参基因浓度
二、基因表达分析的具体步骤
1、提取RNA,并鉴定所提RNA的完整性(0.8%的琼脂糖凝胶 电泳)和纯度(紫外分光光度计(2.0-2.2))。
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2、反转录
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3、设计引物
(1)、NCBI 官网 gene bank 查找xx基因cDNA序列,根据 cDNA序列设计RT-qPCR引物,产物长度80-150bp最佳。引物 由primer 5软件设计,正反引物的Tm 值相差小于2,GC%比小 于3。 (2)、设计好的引物再通过NCBI blast 引物比对官网进行初步 筛选,并将设计好的引物交由相关基因公司(如华大基因)合 成。 (3)、新合成的引物以cDNA 为模板,添加gene star PCR mix 进行预实验,设计多个实验重复,ABI梯度PCR仪上进行梯 度PCR扩增,产物进行琼脂糖凝胶电泳,marker 比对结果判定 产物大小及引物退火温度的最佳条件。 (4)、将ABI 梯度PCR 仪在最佳退火条件下扩增的PCR产物 交由相关基因公司(如华大基因)进行普通测序,用于判断测 序结果与目标片段是否吻合,引物位置与初始引物设计位置是 否相同。
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4、内参筛选
根据实验样品类型及条件,选取相关基因(如 GAPDH 、ᵦ-actin等)为备选内参基因, geNorm 软件分析备选内参在实验样本中的稳 定性,以M<1.5为最佳内参。
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5、确定目的基因和内参基因的扩增效率 及定量PCR数据处理方法
根据绝对定量PCR 原理,对cDNA进 行5个数量级的10 倍梯度稀释,利用 各个浓度的cDNA 进行绝对定量以获 得相关基因的扩增 效率。
医学分子遗传学 第四章分子遗传技术方法
METHODS FOR ANALYZING GENE EXPRESSION
基因表达分析技术
Speaker:
2015/11/8 1
gene
mRNA
Protein polypeptide chain Gene Expression
2015/11/8 2
一、实时荧光定量PCR (real time quantitative PCR,RT-qPCR)
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6、实时荧光定量PCR (real time quantitative PCR, RT-qPCR)反应体系
反应体系 SYBR Green I Master Mix Forward Primer(10umol/L) Reverse Primer(10umol/L) cDNA 模板 Rnase ddH2O 总体积 体积 10ul 1ul 1ul 1ul 7ul 20ul
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2015/11/8
Ct( threshold value )值是指荧光信号达到 设定阈值时所经历的循环数,此时荧光信号明 显高于背景荧光信号。
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Ct值与模板起始浓度的关系
• 模板起始浓度越高,Ct值越小 • Ct值与模板起始拷贝数的对数存在线性关系
• 如果模板浓度增加1倍,Ct值就提前1个循 环到达 • 如果模板浓度减少1倍,Ct值就滞后1个循 环到达 2015/11/8
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非特异性荧光染料标记: 特异性荧光标记: SYBR Green I TaqMan
荧光信号强 与特异性的荧光探针相比价格便 与其它探针相比设计简单 宜 可用于多通道检测 可用于SNP的检测 只需要设计PCR引物
优点
缺点
由于它和模板的结合是非特异性 的,它可以和所有的双链DNA包 比DNA结合染料价格高 括引物和非特异性扩增产物结合, 不能真实反映目 的基因的扩增 情况
2015/11/8
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实时荧光定量PCR (real time quantitative PCR,RT-qPCR)是荧光化学物质与PCR产物相 结合,在PCR反应体系中加入荧光基 团,利用荧光信号累积实现了实时监测 整个PCR进程,对起始模板进行定量 分析的方法。
荧光定量实时PCR与普通PCR的比较
在线实时监控 对样品扩增的整个过程进行实时监控,能够实时地观察到产 物的增加,直观地看到反应的对数期 降低反应的非特异性 使用引物和荧光探针同时与模板特异性结合,提高了PCR反 应的特异性 增加定量的精确性
全程监控,精确定量
结果分析更快捷方便,无需电泳
荧光染料 SYBR Green I 是一种结合于双链 DNA(double-strand,dsDNA) 小沟中的荧 光染料,游离的荧光染料不发出信号,所以 开始时检测不到荧光信号,随着扩增的进行, 染料不断地与dsDNA结合而发出荧光,被荧 光探测系统检测到。
每个样本基因的PCR反应设置3个平行重复以保证 实验结果的准确性,数据处理采用均值计算。
2015/11/8 18
反应条件
温度和时间 基因 循环
预变性
变性
退火
40
PCR均采用10 min预变性,彻底打开聚合酶活性。为了 提高PCR扩增效率,采用变性及退火进行扩增40个循环。 扩增结束后在相应的温度和时间中进行变性和退火后开 始“溶解曲线程序”。通过溶解曲线判断产物的单一性 及引物特性。
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相对定量(Relative quantification)是计算要处理样本相 对于正常(内参基因)样本的基因表达量变化,属于 倍数关系式,扩增效率达到100%时用2 -∆∆CT 法来分析 处理实验数据。实验过程中还要引入一个或多个内参 基因进行校正和标准化。 内参基因(Reference gene)是指在不同类型细胞、不同实验 处理条件下恒定表达的一类管家基因,常用的内参基因 有b-actin、GAPDH、18sRNA、efla等。