免疫学检验-免疫组织化学技术PPT教学课件
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免疫组化PPT课件
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未封闭内源性过氧化物酶
29
30
胃固有膜腺体
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3．假阴性反应：
⑴ 组织固定不当或固定时间过长； ⑵ 抗体效价过低或久置失效； ⑶ 组织中抗原被粘稠基质或分泌物阻隔； ⑷ DAB或H2O2的浓度不当。
32
五、免疫组织化学在肿瘤诊断和鉴别诊断 中的应用
（一）在肿瘤诊断中应用免疫组织化学染色的原因： １在常规病理活检中,通常有５～１０％的疑难病例不能明确诊断。 ２形态结构相似的肿瘤可为不同的组织来源（如未分化癌和恶性
在病理学外检工作中可用于对不同来源，HE难以诊断的的肿瘤进行确诊 和鉴别诊断。
其基本原理是应用抗原与抗体接触后可形成“抗原－抗体复合物”的化学 反应，以检测组织或细胞内抗原（或抗体）的技术。
2
Immunohistochemistry
Esophageal carcinoma
E-cad + in membrane Wu Ming-Yao et al.
图8
图9
图10 免疫组化结果： 肿瘤细胞Vimentin（+）
图11免疫组化结果：
肿瘤细胞（CD117+）
58
59
60
61
62
63
64
抗原修复
从应用病理技术观点来看，福尔马林组织标本固定 术就像一把双刃剑：
福尔马林（10%甲醛溶液）是一经典的常规病理 诊断用组织样本固定剂，然而缺点是其对免疫组 织化学及原位杂交信号检测是有损害作用。
⑵ 背景染色低（相对）； ⑶ 双PAP敏感性更高，但背景相对较重。
12
（四）ABC法： 1981年美籍华人许世明发明了ABC法
Vector
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未封闭内源性过氧化物酶
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胃固有膜腺体
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3．假阴性反应：
⑴ 组织固定不当或固定时间过长； ⑵ 抗体效价过低或久置失效； ⑶ 组织中抗原被粘稠基质或分泌物阻隔； ⑷ DAB或H2O2的浓度不当。
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五、免疫组织化学在肿瘤诊断和鉴别诊断 中的应用
（一）在肿瘤诊断中应用免疫组织化学染色的原因： １在常规病理活检中,通常有５～１０％的疑难病例不能明确诊断。 ２形态结构相似的肿瘤可为不同的组织来源（如未分化癌和恶性
在病理学外检工作中可用于对不同来源，HE难以诊断的的肿瘤进行确诊 和鉴别诊断。
其基本原理是应用抗原与抗体接触后可形成“抗原－抗体复合物”的化学 反应，以检测组织或细胞内抗原（或抗体）的技术。
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Immunohistochemistry
Esophageal carcinoma
E-cad + in membrane Wu Ming-Yao et al.
图8
图9
图10 免疫组化结果： 肿瘤细胞Vimentin（+）
图11免疫组化结果：
肿瘤细胞（CD117+）
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抗原修复
从应用病理技术观点来看，福尔马林组织标本固定 术就像一把双刃剑：
福尔马林（10%甲醛溶液）是一经典的常规病理 诊断用组织样本固定剂，然而缺点是其对免疫组 织化学及原位杂交信号检测是有损害作用。
⑵ 背景染色低（相对）； ⑶ 双PAP敏感性更高，但背景相对较重。
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（四）ABC法： 1981年美籍华人许世明发明了ABC法
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免疫组织化学技术ppt课件
谢 请多
谢！ 指教！
异性差，特别在应用多克隆抗血清时更易出现； （2）所用抗体浓度过高或染色过程中切片干燥导致
抗体与组织产生非特异性结合； （3）组织或细胞中有内源性过氧化物酶、碱性磷酸
酶及生物素等产生非特异性显色；
免疫组化操作经验和体会
• 操作中应注意以下问题：
1.石蜡切片和冰冻切片均可，但要注意防止脱片。 2.消除内源性过氧化酶和非特意性背景染色要充分。 3.PBS洗涤要充分。 4.要设阴性和阳性对照。 5.显色注意底物要适量、时间要严格控制。
• 5.复合型 在常规免疫组化标记中，同一
种抗原可以同时表达于胞膜和胞浆、胞 核和胞浆、微绒毛和胞浆，但很少发现 胞膜和胞核同时表达。值得注意的是组 织标本固定不及时造成抗原移位或乳腺 ER和PR修复不充分也可以发生胞核和胞 浆同时阳性。
三、阳性标记组织学特征
• 根据免疫组化阳性细胞的组织学特点，
五、非特异着色特征
• 以下情况可干扰免疫组化标记结果的观察和判断：
（1）抗体交叉反应： 是由于该抗原决定簇同时 存在于多种组织细胞，如GFAP可同时存在于星 形胶质细胞和唾液腺肌上皮。S-100蛋白则更为严 重，可表达于多种组织细胞。因此，应全面了解 和认识该抗体的功能和标记范围。故抗体交叉反 应只要应用得当仍有助于诊断。
• 近十年来，免疫组化技术发展很快，在现代医学
的基础和临床研究中发挥着重要的作用，对疾病， 尤其是对肿瘤的诊断、鉴别诊断及发病机理的研 究提供了强有力的手段，但随着免疫组化标记物 的增多和利用，原为特异的标记物并非绝对特异， 而且出现交叉反应和异常表达的情况日益增多。 故对免疫组化标记结果的意义不能绝对化，应在 光镜观察组织形态的基础上，合理使用免疫组化 技术，审慎判断其标记的意义。
2-1 免疫组织化学技术PPT课件
能与对应抗体结合出现抗原-抗体反应、又不能单独激发人或动物体产生抗体的抗 原。它只有反应原性，不具免疫原性，又称不完全抗原。大多数多糖和所有的类 脂都属于半抗原。
免疫酶组织化学 免疫荧光组织化学 免疫胶体金组织化学 亲和免疫组织化学 （抗原信号放大系统） 优点：特异性强，敏感度高，应用广泛。
第一节 免疫组织化学基本原理
AP磷酸酯水解酶， 溴氯羟吲哚磷酸盐(底物）/硝基蓝四唑 (BCIP/NBT) 溴氯羟吲哚磷酸盐(底物）/硝基四紫唑 (BCIP/INT)
AP
NBT/BCIP
蓝紫色
INT/BCIP AP 棕红色或橘黄色
ABC法的优点：敏感性更高 ABC法的缺点： ①亲和素(鸡蛋白)中含有10%糖类，导致背景着色 ②亲和素的等电点约10左右，带较多的负电荷，导致纤维
1.原理:
生物素 (biotin)为含硫的杂环单羧酸，生物素分子量为 244.31，pI为3.5，咪唑酮环（又称Ureido环）(I环)是与亲合 素结合的主要部位；Ⅱ环为噻吩环有一个戊酸侧链，末端羧 基是标记抗体和酶的唯一结构。
I II
亲和素 (avidin)又称抗生物素蛋白，是一种糖蛋白。天然 (卵白)亲合素为碱性蛋白，分子量为6.8KD，pI 10～10.5； 在pH9～13缓冲液中性质均稳定。由4个相同的亚单位构成 4聚体；每个亲合素亚单位通过其结构中的色氨酸残基与 生物素中的Ureido环（I环）结合。因此，1个亲合素分子 存在4个与生物素分子结合位点
若DAB显色进行以下操作： 11.苏木精复染（10秒钟），自来水冲洗返蓝，脱水透明，
用中性树胶封片。镜下检查结果 若AEC或NBT/BCIP
12.AEC和NBT/BCIP显色可进行甲基绿或核真红复染细胞核， 水溶性封片剂封片。
免疫酶组织化学 免疫荧光组织化学 免疫胶体金组织化学 亲和免疫组织化学 （抗原信号放大系统） 优点：特异性强，敏感度高，应用广泛。
第一节 免疫组织化学基本原理
AP磷酸酯水解酶， 溴氯羟吲哚磷酸盐(底物）/硝基蓝四唑 (BCIP/NBT) 溴氯羟吲哚磷酸盐(底物）/硝基四紫唑 (BCIP/INT)
AP
NBT/BCIP
蓝紫色
INT/BCIP AP 棕红色或橘黄色
ABC法的优点：敏感性更高 ABC法的缺点： ①亲和素(鸡蛋白)中含有10%糖类，导致背景着色 ②亲和素的等电点约10左右，带较多的负电荷，导致纤维
1.原理:
生物素 (biotin)为含硫的杂环单羧酸，生物素分子量为 244.31，pI为3.5，咪唑酮环（又称Ureido环）(I环)是与亲合 素结合的主要部位；Ⅱ环为噻吩环有一个戊酸侧链，末端羧 基是标记抗体和酶的唯一结构。
I II
亲和素 (avidin)又称抗生物素蛋白，是一种糖蛋白。天然 (卵白)亲合素为碱性蛋白，分子量为6.8KD，pI 10～10.5； 在pH9～13缓冲液中性质均稳定。由4个相同的亚单位构成 4聚体；每个亲合素亚单位通过其结构中的色氨酸残基与 生物素中的Ureido环（I环）结合。因此，1个亲合素分子 存在4个与生物素分子结合位点
若DAB显色进行以下操作： 11.苏木精复染（10秒钟），自来水冲洗返蓝，脱水透明，
用中性树胶封片。镜下检查结果 若AEC或NBT/BCIP
12.AEC和NBT/BCIP显色可进行甲基绿或核真红复染细胞核， 水溶性封片剂封片。
《免疫组织化学技术》PPT课件
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双桥PAP法原理
• 该法是PAP法的改良法，通过两次连接桥 抗体和PAP，在抗原抗体复合物上结合比 PAP法更多的酶分子，形成Ag-Ab1-Ab2PAP-Ab2-PAP复合物，最后通过PAP复合 物中的HRP催化底物显色。
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25
双桥PAP法技术要点
• （1）、（2）、（3）、（4）和（5）同 PAP法。
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21
PAP法的原理
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PAP法技术要点
• （1）、（2）、（3）和（4）同间接法。 • （5）加PAP复合物，温育，使形成Ag-
Ab1-Ab2-PAP复合物，洗涤. • （6）加底物，光镜下观察显色结果。
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PAP法的方法评价
• PAP法未经化学交联，故避免了抗体和酶活性 的降低，并省去酶标记抗体需纯化的繁琐过程。 PAP是由2个抗酶抗体和3个过氧化物酶分子组 成的复合物，稳定性好，酶分子不易在染色冲 洗过程中脱落。PAP中不存在游离的免疫球蛋 白，不易产生非特异性染色，因而特异性、敏 感性和重复性良好，比直接染色法、间接染色 法和酶桥法更敏感。缺点是PAP复合物制备过 程较复杂。
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3
免疫组化技术要点
• 标本的制作 • 抗体的选择 • 温育 • 改善标本的透过性 • 设立对照试验 • 免疫组化的结果判断
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4
标本的制作
• 标本的类型
1.组织切片：①冷冻切片；②石蜡切片 2.印片 3.涂片
• 标本的固定 • 标本的保存 • 酶消化处理
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5
设立对照试验
• （6）加Ab2，温育，形成Ag-Ab1-Ab2PAP-Ab2复合物，洗涤。
临床免疫学检验-课件-第12章 免疫组织化学技术
提高病理诊断准确性； 癌基因蛋白的临床应用； 对肿瘤细胞增生程度的评价，如Ki67为增
殖细胞核抗原；
肿瘤转移和肿瘤分期 ； 指导肿瘤靶向治疗。
第二节 荧光免疫组化技术
定义:采用荧光素标记的已知抗体（或抗原）作为
间接法 两步法
HRP标记在第二抗体即抗抗体， 抗原-特异性 抗体-第二抗体● HRP复合物
特点：敏感性较直接法高， 一种标记抗体能用于相应动 物制备的多种特异性抗体， 检测多种抗原。但较直接法 费时，非特异染色稍重。
（二）非标记抗体酶免疫组化染色
特点:
用酶免疫动物，制备效价高、特异性强的抗酶抗体 酶通过免疫学反应与抗酶抗体及组织抗原上的第一抗体
① 将免疫反应的特异性、组织化学的可见性、 分子生物学技术的敏感性结合。
② 借助显微镜（电子或荧光）、在细胞或亚细 胞结构、检测各种抗原（蛋白、多肽、酶、 激素、病原体等）。
③ 结构、功能与代谢的动态观察，为疾病诊断、 机制研究提供有力手段。
分类：
酶免疫组织化学技术 荧光免疫组织化学技术 免疫金（银）组织化学技术 亲和组织化学技术 免疫标记电镜组织化学技术
优点：
敏感性较酶标法有所提高
缺点：
操作分四步，较复杂 如果抗酶抗体与酶结合弱，在操作中酶常被冲洗掉 如果抗酶抗体的非特异性成分与桥联抗体结合，结果
就与抗酶抗体竞争桥抗的结合位点，也会影响方法的
敏感性。
技术类型
2. PAP法：1970年发现，是酶桥法的改良法。PAP法将酶 桥法的第三抗体（抗酶抗体）与酶形成一种稳定可溶性 (PAP复合物) ：2个抗酶抗体+3个HRP(五角形结构）
直接法
HRP标记在特异性抗体（第一抗体）上，抗原- 抗体● HRP 复合物，加入底物显色。有色物质沉积在抗原抗体反应部位， 从而可对组织或细胞抗原进行定位，定性，定量分析。
殖细胞核抗原；
肿瘤转移和肿瘤分期 ； 指导肿瘤靶向治疗。
第二节 荧光免疫组化技术
定义:采用荧光素标记的已知抗体（或抗原）作为
间接法 两步法
HRP标记在第二抗体即抗抗体， 抗原-特异性 抗体-第二抗体● HRP复合物
特点：敏感性较直接法高， 一种标记抗体能用于相应动 物制备的多种特异性抗体， 检测多种抗原。但较直接法 费时，非特异染色稍重。
（二）非标记抗体酶免疫组化染色
特点:
用酶免疫动物，制备效价高、特异性强的抗酶抗体 酶通过免疫学反应与抗酶抗体及组织抗原上的第一抗体
① 将免疫反应的特异性、组织化学的可见性、 分子生物学技术的敏感性结合。
② 借助显微镜（电子或荧光）、在细胞或亚细 胞结构、检测各种抗原（蛋白、多肽、酶、 激素、病原体等）。
③ 结构、功能与代谢的动态观察，为疾病诊断、 机制研究提供有力手段。
分类：
酶免疫组织化学技术 荧光免疫组织化学技术 免疫金（银）组织化学技术 亲和组织化学技术 免疫标记电镜组织化学技术
优点：
敏感性较酶标法有所提高
缺点：
操作分四步，较复杂 如果抗酶抗体与酶结合弱，在操作中酶常被冲洗掉 如果抗酶抗体的非特异性成分与桥联抗体结合，结果
就与抗酶抗体竞争桥抗的结合位点，也会影响方法的
敏感性。
技术类型
2. PAP法：1970年发现，是酶桥法的改良法。PAP法将酶 桥法的第三抗体（抗酶抗体）与酶形成一种稳定可溶性 (PAP复合物) ：2个抗酶抗体+3个HRP(五角形结构）
直接法
HRP标记在特异性抗体（第一抗体）上，抗原- 抗体● HRP 复合物，加入底物显色。有色物质沉积在抗原抗体反应部位， 从而可对组织或细胞抗原进行定位，定性，定量分析。
免疫组织化学技术PPT演示课件
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实验设备
恒温冰冻切片机、脱水机、石蜡包 埋机、切片机、摊片机、烤片机、 冰箱、电磁炉、高压锅、染色架以 及离心机和免疫组化试剂等
7
8
9
脱水机、石蜡包埋机
10
免疫组化技术分类
1、免疫荧光方法 2、免疫酶标方法 3、免疫胶体金技术 4、免疫铁蛋白法 5、放射免疫自显影法
11
酶联免疫组织化学
7、烤片：68℃恒温箱内烤片2h
15
二.SP（链霉菌抗生物素蛋白-过氧 化物酶连结）三步法染色步骤
1、脱蜡、水化
• 60℃×20分钟→二甲苯2 × 10分钟 • 100%的绝对乙醇:2×5分钟; • 95% ethanol 2 minutes；95%的乙醇2分钟 • 80% ethanol 2 minutes； • 70% ethanol 2 minutes； • distilled water:5 min；蒸馏水:5分钟 • PBS洗3次×3 min。
• （A：DAB B：H2O2 C：磷酸缓冲液）
18
14、自来水冲洗10分钟终止反应 15、复染：苏木精复染2min，盐酸酒精分化 16、自来水冲洗10-15min 17、常规脱水
50% ethanol 1-2 min， 70% ethanol 1-2 min 95% ethanol 1-2 min； 95% ethanol 1-2 min； 100% absolute ethanol: (1-2) min。 透明：Xylene 1×(1-2) min→Xylene 2×(1-2) min 封片（用中性树胶滴在组织旁边，再用盖玻片 盖上）、镜检
11、滴加SP（链霉亲和素-过氧化物酶），室 温或37℃孵育30min-1h
12、PBS冲洗2-3次，每次5min
实验设备
恒温冰冻切片机、脱水机、石蜡包 埋机、切片机、摊片机、烤片机、 冰箱、电磁炉、高压锅、染色架以 及离心机和免疫组化试剂等
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脱水机、石蜡包埋机
10
免疫组化技术分类
1、免疫荧光方法 2、免疫酶标方法 3、免疫胶体金技术 4、免疫铁蛋白法 5、放射免疫自显影法
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酶联免疫组织化学
7、烤片：68℃恒温箱内烤片2h
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二.SP（链霉菌抗生物素蛋白-过氧 化物酶连结）三步法染色步骤
1、脱蜡、水化
• 60℃×20分钟→二甲苯2 × 10分钟 • 100%的绝对乙醇:2×5分钟; • 95% ethanol 2 minutes；95%的乙醇2分钟 • 80% ethanol 2 minutes； • 70% ethanol 2 minutes； • distilled water:5 min；蒸馏水:5分钟 • PBS洗3次×3 min。
• （A：DAB B：H2O2 C：磷酸缓冲液）
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14、自来水冲洗10分钟终止反应 15、复染：苏木精复染2min，盐酸酒精分化 16、自来水冲洗10-15min 17、常规脱水
50% ethanol 1-2 min， 70% ethanol 1-2 min 95% ethanol 1-2 min； 95% ethanol 1-2 min； 100% absolute ethanol: (1-2) min。 透明：Xylene 1×(1-2) min→Xylene 2×(1-2) min 封片（用中性树胶滴在组织旁边，再用盖玻片 盖上）、镜检
11、滴加SP（链霉亲和素-过氧化物酶），室 温或37℃孵育30min-1h
12、PBS冲洗2-3次，每次5min
免疫组织化学检验技术.ppt
第一节 免疫组化检验技术基本知识
免疫组化全过程
一、标本制作
• 标本制作是获得良好的免疫细胞组织化学分析的保障，良好的细胞 和组织学结构将有助于抗原的准确显示和定位。
（一）标本的主要来源 主要有： ①活体组织 ②各种体液及穿刺液 ③培养细胞等
（二）标本的固定与保存
1．组织材料的固定目的
①防止组织细胞的死后变化，以保持其固有形态 ②使细胞内的蛋白质等各种抗原成份转变成不溶性 物质，以保持它原有的结构 ③使组织中的各种物质沉淀和凝固起来而产生不同 的折射率，以便染色后易于鉴别和观察 ④固定剂兼有硬化作用，使组织硬化，便于制片 ⑤防止细胞过度收缩或膨胀而失去其原有形态结构 ⑥经过固定的组织能对染料产生不同的亲和力而着 色清晰，便于辨认。
（四）切片方法的选择
二、抗原处理
（一）进行抗原的暴露和修复的原因
1.固定液的影响 2.抗体制备的影响
（二）抗原的暴露
主要采用酶消化的方法 在选择酶消化时，应针对要显示的不同的抗原成分而选用不同的 酶 在日常工作中用胰蛋白酶消化即可
（三）热诱导的抗原修复
抗原修复是以高温、高压对常规固定石蜡切片进行抗原修复以提 高抗原抗体的阳性检出率 • 微波处理法 • 水浴锅法 • 压力锅法
酶标记抗体免疫组织化学染色法 非标记抗体酶免疫组织化学染色法
二、酶标记抗体的免疫组化染色法
（一）原理 酶标记抗体的免疫组织化学染色法是借助交联剂的共价键作用
将酶直接连接在抗体（或抗抗体）上，酶标抗体（或抗抗体）与 组织内特异抗原或抗原抗体复合物反应后，通过酶对底物的催化 作用，生成不溶性有色产物并沉淀在特定位置，达到对抗原定性、 定位、定量检测的目的。
（三）阴性结果
阴性结果不能简单视为抗原不表达，由于染色方法灵敏度有高低之 分，有时可因灵敏度不够，而导致阴性反应。
《免疫学》免疫组织化学的应用ppt课件
05
免疫组织化学的优缺点与展望
优点
高特异性
免疫组织化学技术能够针对特 定的抗原进行高特异性识别，
减少非特异性染色。
高灵敏度
通过使用酶或其他标记物，可 以检测到极低浓度的抗原，提 高检测灵敏度。
定位准确
通过标记特定抗体，可以精确 定位抗原在组织中的位置，有 助于疾病的诊断和病理研究。
多参数同时检测
《免疫学》免疫组织 化学的应用ppt课件
contents
目录
• 免疫组织化学概述 • 免疫组织化学的基本原理 • 免疫组织化学在病理诊断中的应用 • 免疫组织化学在研究中的应用 • 免疫组织化学的优缺点与展望
01
免疫组织化学概述
定义与特点
定义
免疫组织化学是一种利用抗原-抗体 反应原理，通过标记抗体来检测和定 位组织或细胞内特定抗原物质的技术 。
成本较高
需要针对不同的抗原制备特定的抗体 ，因此成本较高。
展望与未来发展方向
优化技术流程
多技术联合应用
通过改进实验流程和缩短实验时间，提高 实验效率和准确性。
将免疫组织化学与其他技术如基因测序、 蛋白质组学等相结合，以更全面地了解组 织样本中的分子表达情况。
自动化与标准化
临床应用拓展
开发自动化免疫组织化学分析系统，实现 标准化操作，减少人为误差。
20世纪80年代
建立了免疫酶标技术，提高了检测的灵敏度 和特异性。
20世纪70年代
建立了免疫荧光技术，成为最早的免疫组织 化学技术。
20世纪90年代至今
免疫组织化学技术不断改进和完善，应用范 围不断扩大。
02
免疫组织化学的基本原理
抗原-抗体反应
抗原和抗体结合的特异性
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第一课件网网站
2021/01/21
1
在固相膜免疫测定中，有穿流形式的，称为免 疫渗滤试验（immunofiltration assay，IFA）；横流 （lateral flow）形式的，称为免疫层析试验 （immunochromatographic assay，ICA）。
2021/01/21
2
斑点酶免疫吸附试验
3、方法评价
2021/01/21
10
（二）间接染色法（二步法） 1、原理
该法是在直接法的基础上，为了增加敏感性和 实用性而在酶标抗体与组织内抗原之间增加抗体反 应层次。即先用未标记的已知抗体与标本中相应抗 原反应，再用酶标抗抗体与之反应，形成抗原．抗 体．酶标抗抗体复合物，加底物显色。根据底物显 色反应对抗原定位、定性和定量。
斑点-ELISA（dot- ELISA）实验原理与常规ELISA 相同，不同之处在于斑点一ELISA所用固相载体为对蛋 白质具极强吸附力（近100％）的硝酸纤维素（NC）膜， 此外酶作用底物后形成有色的沉淀物，使NC染色。
2021/01/21
3
免疫渗滤试验
免疫渗滤试验（IFA）的基本原理是：以硝酸纤 维素（NC）膜为载体，利用微孔滤膜的可滤过性， 使抗原抗体反应和洗涤在一特殊的渗滤装置上以液 体渗滤过膜的方式迅速完成。渗滤装置是IFA中的主 要试剂成分之一，由塑料小盒、吸水垫料和点加了 抗原或抗体的硝酸纤维素膜片三部分组成。
2021/01/21
12
第三节 荧光免疫组织化学技术
一、直接法 二、间接法 三、双标记荧光免疫法
许多细胞表面常有多种抗原存在，在同一细胞 组织标本上需要同时检测两种抗原时，采用双标记 荧光染色法．通常采用的是双标记直接染色法。
第一课件网网站
2021/01/21
13
THANKS FOR WATCHING
2021/01/21
4
免疫层析试验
免疫层析试验（ICA）是继IFCA中滴加在膜一端的样品溶液受膜的毛 细管作用向另一端移动，犹如层析一般。
2021/01/21
5
第五节 酶免疫测定的应用
2021/01/21
6
第十二章 免疫组织化学技术
2021/01/21
9
2、操作步骤 （1）标本处理；充分水洗后于室温用0.3％H2O2和80％甲醇 处理20－30min，以去除内源性过氧化物酶的干扰。石蜡切 片要求消除内源酶和用胰蛋白酶或胃蛋白酶消化处理，然后 用PBS洗涤。 （2）用正常血清或牛血清白蛋白（bovine serum albumin， BSA）溶液处理，以封闭非特异性结合点，阻断组织细胞与 抗体的非特异性结合，减少背景着色。 （3）加酶标抗体，孵育使之形成抗原－酶标抗体复合物， 洗去未结合物。 （4）加入底物，普通光学显微镜下观察显色结果。
谢谢大家观看
为了方便教学与学习使用，本文档内容可以在下载后随意修改，调整。欢迎下载！
汇报人：XXX
时间：20XX.XX.XX
2021/01/21
14
第四节 膜载体的酶免疫测定
固相膜免疫测定（solid phase rnembrane－based immunoassny）与固相酶免疫测定（ELISA）相类似， 其特点是以微孔膜作为固相。标记物可用酶和各种有 色微粒子，如彩色胶乳、胶体金、胶体硒等，以红色 的胶体金最为常用。固相膜的特点在于其多孔性，像 滤纸一样。固相膜可被液体穿过流出，液体也可以通 过毛细管作用在膜上向前移行。利用这种性能建立了 两种不同类型的快速检验方法。常用的固相膜为硝酸 纤维素（nitrocellulose，NC）膜。
最常用的酶有辣根过氧化物酶（HRP）、碱性磷酸酶 （ALP）及葡萄糖氧化酶（GOD）等。
2021/01/21
8
酶标记抗体免疫组化染色法
（一）直接染色法（一步法） 1 原理 用酶标抗体直接与处理过的组织标本中相应抗原反 应，继用底物二氨基联苯胺（diahanobenzidine， DAB）和 H2O2进行显色，产生的有色物质沉积在抗 原抗体反应部位，从而对组织或细胞抗原定位、定 性和定量。
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2、操作步骤 （1）用正常血清或BSA溶液处理标本，封闭。 （2）加适当稀释的已知抗体，孵育，使之形成固相 抗原抗体复合物，洗去未结合的已知抗体。 （3）加酶标抗抗体，孵育，形成固相抗原－抗体－ 酶标抗抗体复合物，洗涤。 （4）加底物，普通光学显微镜下观察显色反应。 3、方法评价
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第二节 酶免疫组织化学技术
酶免疫组织化学技术（enzyme immunohistochemistry technique，EIHCT）是利用酶标记已知抗体（或抗原），然 后与组织标本中相应抗原（或抗体）在一定条件下相互结合 形成带酶分子的复合物，酶遇到底物时；能催化底物水解， 或氧化或还原，产生有色的不溶性产物，出现显色反应，在 显微镜下进行细胞与组织表面或内部某种抗原成分的定位观 察分析。
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在固相膜免疫测定中，有穿流形式的，称为免 疫渗滤试验（immunofiltration assay，IFA）；横流 （lateral flow）形式的，称为免疫层析试验 （immunochromatographic assay，ICA）。
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斑点酶免疫吸附试验
3、方法评价
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（二）间接染色法（二步法） 1、原理
该法是在直接法的基础上，为了增加敏感性和 实用性而在酶标抗体与组织内抗原之间增加抗体反 应层次。即先用未标记的已知抗体与标本中相应抗 原反应，再用酶标抗抗体与之反应，形成抗原．抗 体．酶标抗抗体复合物，加底物显色。根据底物显 色反应对抗原定位、定性和定量。
斑点-ELISA（dot- ELISA）实验原理与常规ELISA 相同，不同之处在于斑点一ELISA所用固相载体为对蛋 白质具极强吸附力（近100％）的硝酸纤维素（NC）膜， 此外酶作用底物后形成有色的沉淀物，使NC染色。
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免疫渗滤试验
免疫渗滤试验（IFA）的基本原理是：以硝酸纤 维素（NC）膜为载体，利用微孔滤膜的可滤过性， 使抗原抗体反应和洗涤在一特殊的渗滤装置上以液 体渗滤过膜的方式迅速完成。渗滤装置是IFA中的主 要试剂成分之一，由塑料小盒、吸水垫料和点加了 抗原或抗体的硝酸纤维素膜片三部分组成。
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第三节 荧光免疫组织化学技术
一、直接法 二、间接法 三、双标记荧光免疫法
许多细胞表面常有多种抗原存在，在同一细胞 组织标本上需要同时检测两种抗原时，采用双标记 荧光染色法．通常采用的是双标记直接染色法。
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免疫层析试验
免疫层析试验（ICA）是继IFCA中滴加在膜一端的样品溶液受膜的毛 细管作用向另一端移动，犹如层析一般。
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第五节 酶免疫测定的应用
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第十二章 免疫组织化学技术
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2、操作步骤 （1）标本处理；充分水洗后于室温用0.3％H2O2和80％甲醇 处理20－30min，以去除内源性过氧化物酶的干扰。石蜡切 片要求消除内源酶和用胰蛋白酶或胃蛋白酶消化处理，然后 用PBS洗涤。 （2）用正常血清或牛血清白蛋白（bovine serum albumin， BSA）溶液处理，以封闭非特异性结合点，阻断组织细胞与 抗体的非特异性结合，减少背景着色。 （3）加酶标抗体，孵育使之形成抗原－酶标抗体复合物， 洗去未结合物。 （4）加入底物，普通光学显微镜下观察显色结果。
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第四节 膜载体的酶免疫测定
固相膜免疫测定（solid phase rnembrane－based immunoassny）与固相酶免疫测定（ELISA）相类似， 其特点是以微孔膜作为固相。标记物可用酶和各种有 色微粒子，如彩色胶乳、胶体金、胶体硒等，以红色 的胶体金最为常用。固相膜的特点在于其多孔性，像 滤纸一样。固相膜可被液体穿过流出，液体也可以通 过毛细管作用在膜上向前移行。利用这种性能建立了 两种不同类型的快速检验方法。常用的固相膜为硝酸 纤维素（nitrocellulose，NC）膜。
最常用的酶有辣根过氧化物酶（HRP）、碱性磷酸酶 （ALP）及葡萄糖氧化酶（GOD）等。
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酶标记抗体免疫组化染色法
（一）直接染色法（一步法） 1 原理 用酶标抗体直接与处理过的组织标本中相应抗原反 应，继用底物二氨基联苯胺（diahanobenzidine， DAB）和 H2O2进行显色，产生的有色物质沉积在抗 原抗体反应部位，从而对组织或细胞抗原定位、定 性和定量。
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2、操作步骤 （1）用正常血清或BSA溶液处理标本，封闭。 （2）加适当稀释的已知抗体，孵育，使之形成固相 抗原抗体复合物，洗去未结合的已知抗体。 （3）加酶标抗抗体，孵育，形成固相抗原－抗体－ 酶标抗抗体复合物，洗涤。 （4）加底物，普通光学显微镜下观察显色反应。 3、方法评价
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第二节 酶免疫组织化学技术
酶免疫组织化学技术（enzyme immunohistochemistry technique，EIHCT）是利用酶标记已知抗体（或抗原），然 后与组织标本中相应抗原（或抗体）在一定条件下相互结合 形成带酶分子的复合物，酶遇到底物时；能催化底物水解， 或氧化或还原，产生有色的不溶性产物，出现显色反应，在 显微镜下进行细胞与组织表面或内部某种抗原成分的定位观 察分析。