免疫学检验-免疫组织化学技术PPT教学课件
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2021/01/21
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第二节 酶免疫组织化学技术
酶免疫组织化学技术（enzyme immunohistochemistry technique，EIHCT）是利用酶标记已知抗体（或抗原），然 后与组织标本中相应抗原（或抗体）在一定条件下相互结合 形成带酶分子的复合物，酶遇到底物时；能催化底物水解， 或氧化或还原，产生有色的不溶性产物，出现显色反应，在 显微镜下进行细胞与组织表面或内部某种抗原成分的定位观 察分析。
斑点-ELISA（dot- ELISA）实验原理与常规ELISA 相同，不同之处在于斑点一ELISA所用固相载体为对蛋 白质具极强吸附力（近100％）的硝酸纤维素（NC）膜， 此外酶作用底物后形成有色的沉淀物，使NC染色。
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免疫渗滤试验
免疫渗滤试验（IFA）的基本原理是：以硝酸纤 维素（NC）膜为载体，利用微孔滤膜的可滤过性， 使抗原抗体反应和洗涤在一特殊的渗滤装置上以液 体渗滤过膜的方式迅速完成。渗滤装置是IFA中的主 要试剂成分之一，由塑料小盒、吸水垫料和点加了 抗原或抗体的硝酸纤维素膜片三部分组成。
第四节 膜载体的酶免疫测定
固相膜免疫测定（solid phase rnembrane－based immunoassny）与固相酶免疫测定（ELISA）相类似， 其特点是以微孔膜作为固相。标记物可用酶和各种有 色微粒子，如彩色胶乳、胶体金、胶体硒等，以红色 的胶体金最为常用。固相膜的特点在于其多孔性，像 滤纸一样。固相膜可被液体穿过流出，液体也可以通 过毛细管作用在膜上向前移行。利用这种性能建立了 两种不同类型的快速检验方法。常用的固相膜为硝酸 纤维素（nitrocellulose，NC）膜。
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免疫层析试验
免疫层析试验（ICA）是继IFA之后发展起来的 另一种膜固相免疫测定。与IFA利用微孔膜的过滤性 能不同，ICA中滴加在膜一端的样品溶液受膜的毛 细管作用向另一端移动，犹如层析一般。
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第五节 酶免疫测定的应用
2021/01/21
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第十二章 免疫组织化学技术
3、方法评价
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（二）间接染色法（二步法） 1、原理
该法是在直接法的基础上，为了增加敏感性和 实用性而在酶标抗体与组织内抗原之间增加抗体反 应层次。即先用未标记的已知抗体与标本中相应抗 原反应，再用酶标抗抗体与之反应，形成抗原．抗 体．酶标抗抗体复合物，加底物显色。根据底物显 色反应对抗原定位、定性和定量。
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第三节 荧光免疫组织化学技术
一、直接法 二、间接法 三、双标记荧光免疫法
许多细胞表面常有多种抗原存在，在同一细胞 组织标本上需要同时检测两种抗原时，采用双标记 荧光染色法．通常采用的是双标记直接染色法。
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13
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ຫໍສະໝຸດ Baidu
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2、操作步骤 （1）标本处理；充分水洗后于室温用0.3％H2O2和80％甲醇 处理20－30min，以去除内源性过氧化物酶的干扰。石蜡切 片要求消除内源酶和用胰蛋白酶或胃蛋白酶消化处理，然后 用PBS洗涤。 （2）用正常血清或牛血清白蛋白（bovine serum albumin， BSA）溶液处理，以封闭非特异性结合点，阻断组织细胞与 抗体的非特异性结合，减少背景着色。 （3）加酶标抗体，孵育使之形成抗原－酶标抗体复合物， 洗去未结合物。 （4）加入底物，普通光学显微镜下观察显色结果。
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2、操作步骤 （1）用正常血清或BSA溶液处理标本，封闭。 （2）加适当稀释的已知抗体，孵育，使之形成固相 抗原抗体复合物，洗去未结合的已知抗体。 （3）加酶标抗抗体，孵育，形成固相抗原－抗体－ 酶标抗抗体复合物，洗涤。 （4）加底物，普通光学显微镜下观察显色反应。 3、方法评价
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在固相膜免疫测定中，有穿流形式的，称为免 疫渗滤试验（immunofiltration assay，IFA）；横流 （lateral flow）形式的，称为免疫层析试验 （immunochromatographic assay，ICA）。
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斑点酶免疫吸附试验
最常用的酶有辣根过氧化物酶（HRP）、碱性磷酸酶 （ALP）及葡萄糖氧化酶（GOD）等。
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酶标记抗体免疫组化染色法
（一）直接染色法（一步法） 1 原理 用酶标抗体直接与处理过的组织标本中相应抗原反 应，继用底物二氨基联苯胺（diahanobenzidine， DAB）和 H2O2进行显色，产生的有色物质沉积在抗 原抗体反应部位，从而对组织或细胞抗原定位、定 性和定量。
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第二节 酶免疫组织化学技术
酶免疫组织化学技术（enzyme immunohistochemistry technique，EIHCT）是利用酶标记已知抗体（或抗原），然 后与组织标本中相应抗原（或抗体）在一定条件下相互结合 形成带酶分子的复合物，酶遇到底物时；能催化底物水解， 或氧化或还原，产生有色的不溶性产物，出现显色反应，在 显微镜下进行细胞与组织表面或内部某种抗原成分的定位观 察分析。
斑点-ELISA（dot- ELISA）实验原理与常规ELISA 相同，不同之处在于斑点一ELISA所用固相载体为对蛋 白质具极强吸附力（近100％）的硝酸纤维素（NC）膜， 此外酶作用底物后形成有色的沉淀物，使NC染色。
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免疫渗滤试验
免疫渗滤试验（IFA）的基本原理是：以硝酸纤 维素（NC）膜为载体，利用微孔滤膜的可滤过性， 使抗原抗体反应和洗涤在一特殊的渗滤装置上以液 体渗滤过膜的方式迅速完成。渗滤装置是IFA中的主 要试剂成分之一，由塑料小盒、吸水垫料和点加了 抗原或抗体的硝酸纤维素膜片三部分组成。
第四节 膜载体的酶免疫测定
固相膜免疫测定（solid phase rnembrane－based immunoassny）与固相酶免疫测定（ELISA）相类似， 其特点是以微孔膜作为固相。标记物可用酶和各种有 色微粒子，如彩色胶乳、胶体金、胶体硒等，以红色 的胶体金最为常用。固相膜的特点在于其多孔性，像 滤纸一样。固相膜可被液体穿过流出，液体也可以通 过毛细管作用在膜上向前移行。利用这种性能建立了 两种不同类型的快速检验方法。常用的固相膜为硝酸 纤维素（nitrocellulose，NC）膜。
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免疫层析试验
免疫层析试验（ICA）是继IFA之后发展起来的 另一种膜固相免疫测定。与IFA利用微孔膜的过滤性 能不同，ICA中滴加在膜一端的样品溶液受膜的毛 细管作用向另一端移动，犹如层析一般。
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第五节 酶免疫测定的应用
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第十二章 免疫组织化学技术
3、方法评价
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（二）间接染色法（二步法） 1、原理
该法是在直接法的基础上，为了增加敏感性和 实用性而在酶标抗体与组织内抗原之间增加抗体反 应层次。即先用未标记的已知抗体与标本中相应抗 原反应，再用酶标抗抗体与之反应，形成抗原．抗 体．酶标抗抗体复合物，加底物显色。根据底物显 色反应对抗原定位、定性和定量。
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第三节 荧光免疫组织化学技术
一、直接法 二、间接法 三、双标记荧光免疫法
许多细胞表面常有多种抗原存在，在同一细胞 组织标本上需要同时检测两种抗原时，采用双标记 荧光染色法．通常采用的是双标记直接染色法。
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2、操作步骤 （1）标本处理；充分水洗后于室温用0.3％H2O2和80％甲醇 处理20－30min，以去除内源性过氧化物酶的干扰。石蜡切 片要求消除内源酶和用胰蛋白酶或胃蛋白酶消化处理，然后 用PBS洗涤。 （2）用正常血清或牛血清白蛋白（bovine serum albumin， BSA）溶液处理，以封闭非特异性结合点，阻断组织细胞与 抗体的非特异性结合，减少背景着色。 （3）加酶标抗体，孵育使之形成抗原－酶标抗体复合物， 洗去未结合物。 （4）加入底物，普通光学显微镜下观察显色结果。
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2、操作步骤 （1）用正常血清或BSA溶液处理标本，封闭。 （2）加适当稀释的已知抗体，孵育，使之形成固相 抗原抗体复合物，洗去未结合的已知抗体。 （3）加酶标抗抗体，孵育，形成固相抗原－抗体－ 酶标抗抗体复合物，洗涤。 （4）加底物，普通光学显微镜下观察显色反应。 3、方法评价
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在固相膜免疫测定中，有穿流形式的，称为免 疫渗滤试验（immunofiltration assay，IFA）；横流 （lateral flow）形式的，称为免疫层析试验 （immunochromatographic assay，ICA）。
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斑点酶免疫吸附试验
最常用的酶有辣根过氧化物酶（HRP）、碱性磷酸酶 （ALP）及葡萄糖氧化酶（GOD）等。
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酶标记抗体免疫组化染色法
（一）直接染色法（一步法） 1 原理 用酶标抗体直接与处理过的组织标本中相应抗原反 应，继用底物二氨基联苯胺（diahanobenzidine， DAB）和 H2O2进行显色，产生的有色物质沉积在抗 原抗体反应部位，从而对组织或细胞抗原定位、定 性和定量。