第6章 蛋白质的分离、纯化和表征
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蛋白质的分离纯化和表征
2.盐溶和盐析
蛋白质的分离纯化和表征
第21页
2. 盐析 在蛋白质水溶液中，加入大量高浓度强
电解质盐如硫酸铵、氯化钠、硫酸钠等， 可破坏蛋质分子表面水化层，中和它们电 荷，因而使蛋白质沉淀析出，这种现象称 为盐析。
而低浓度盐溶液加入蛋白质溶液中，会 造成蛋白质溶解度增加，该现象称为盐溶。
盐析机理：破坏蛋白质水化膜，中和表面 净电荷。
灵敏度高，能检测1微克蛋白，重复性好。
蛋白质的分离纯化和表征
第48页
蛋白质纯度判定
各种层析单峰，电泳单带，双向电泳单点， 末端氨基酸测定一个，溶解度曲线单转折。
蛋白质的分离纯化和表征
第49页
盐溶盐溶—盐析
• 等电点沉淀蛋白质溶液中加入NaCl后沉淀 溶解—盐溶
• 原因？
分子在等电点时，相互吸引，聚合沉淀，加入少
许盐离子后破坏了这种吸引力，使分子分散，溶
于水中 蛋白质的分离纯化和表征
第9页
盐析 盐析（（NH4）2SO4）
• 向蛋白质溶液中加入大量硫酸铵后蛋白质 会沉淀析出
• 原因？
蛋白质脱去水化层而聚集沉淀
蛋白质的分离纯化和表征
第46页
蛋白质含量测定Ⅱ
3．Folin-酚法（Lowry法） 蛋白质中酪氨酸或半胱氨酸，能与Folin-酚试
剂起氧化还原反应，生成蓝色化合物，500nm比 色测定。
Folin-酚试剂配制比较复杂。 4．BCA法
蛋白质还原Cu2 +成Cu+，与4,4’-二羧基-2,2’-二 喹啉（BCA）形成配合物，显紫色，比色测定。
到达最高值。
蛋白质的分离纯化和表征
第13页
三、蛋白质分离纯化普通标准
总目标：增加制品纯度或比活 1.前处理：因动/植物/细菌而异 2.粗分级分离：采取盐析/等电点沉淀/有 机溶剂分级分离等方法 3.细分级分离：采取凝胶过滤、离子交换 层析、吸附层析以及亲和层析等 4.结晶
蛋白质的分离纯化和表征
第21页
2. 盐析 在蛋白质水溶液中，加入大量高浓度强
电解质盐如硫酸铵、氯化钠、硫酸钠等， 可破坏蛋质分子表面水化层，中和它们电 荷，因而使蛋白质沉淀析出，这种现象称 为盐析。
而低浓度盐溶液加入蛋白质溶液中，会 造成蛋白质溶解度增加，该现象称为盐溶。
盐析机理：破坏蛋白质水化膜，中和表面 净电荷。
灵敏度高，能检测1微克蛋白，重复性好。
蛋白质的分离纯化和表征
第48页
蛋白质纯度判定
各种层析单峰，电泳单带，双向电泳单点， 末端氨基酸测定一个，溶解度曲线单转折。
蛋白质的分离纯化和表征
第49页
盐溶盐溶—盐析
• 等电点沉淀蛋白质溶液中加入NaCl后沉淀 溶解—盐溶
• 原因？
分子在等电点时，相互吸引，聚合沉淀，加入少
许盐离子后破坏了这种吸引力，使分子分散，溶
于水中 蛋白质的分离纯化和表征
第9页
盐析 盐析（（NH4）2SO4）
• 向蛋白质溶液中加入大量硫酸铵后蛋白质 会沉淀析出
• 原因？
蛋白质脱去水化层而聚集沉淀
蛋白质的分离纯化和表征
第46页
蛋白质含量测定Ⅱ
3．Folin-酚法（Lowry法） 蛋白质中酪氨酸或半胱氨酸，能与Folin-酚试
剂起氧化还原反应，生成蓝色化合物，500nm比 色测定。
Folin-酚试剂配制比较复杂。 4．BCA法
蛋白质还原Cu2 +成Cu+，与4,4’-二羧基-2,2’-二 喹啉（BCA）形成配合物，显紫色，比色测定。
到达最高值。
蛋白质的分离纯化和表征
第13页
三、蛋白质分离纯化普通标准
总目标：增加制品纯度或比活 1.前处理：因动/植物/细菌而异 2.粗分级分离：采取盐析/等电点沉淀/有 机溶剂分级分离等方法 3.细分级分离：采取凝胶过滤、离子交换 层析、吸附层析以及亲和层析等 4.结晶
06第6章蛋白质的分离纯化
通过细胞本身的酶系或外加酶制剂的催 化作用，使细胞外层结构受到破坏，而 达到破碎细胞目的的方法
溶菌酶lysozyme、葡聚糖酶glucanase、 纤维素酶cellulase
抽提(Extraction)：是指在一定的条件下，用适当的溶剂
（solvent）（溶液）处理原料，使欲分离物质充分
溶解到溶剂中的过程。 溶液应具备的条件是：对有效成分溶解度大、破坏性小，
化学法chemical method
通过各种化学试剂对细胞膜的作用，而使细 胞破碎的主法
所用化学试剂(chemical agents )：甲苯 (methylbenzene)、 丙酮 acetone、 丁醇 (butanol)、氯仿(chloroform)、吐温(Twain)
酶促破碎法Enzymic method
把蛋白质与杂蛋白、核酸、多糖分开 方法：盐析、等电点、有机溶剂 体积大的样品采用：超滤、凝胶过滤、冻真空干燥、
聚乙二醇
细分级分离(fine fractionation)
凝胶过滤、离子交换、吸附层析、亲和 层析
区带电泳、等电聚焦 结晶
依分离现象或仪器设备分类
沉淀分离技术precipitation separation
前处理(pre-processing) ：有些样品需冰冻(frozen)保 存 ; 有 些 样 品 需 去 掉 (abscise) 结 缔 组 织 (connective tissue);有些样品需去掉脂肪组织(fatty tissue)。 根据不同组织选择适当方法将组织或细胞破碎。
粗分级分离(Rough fractionation)
生化分离技术separation technique 生化检测技术detection technique
溶菌酶lysozyme、葡聚糖酶glucanase、 纤维素酶cellulase
抽提(Extraction)：是指在一定的条件下，用适当的溶剂
（solvent）（溶液）处理原料，使欲分离物质充分
溶解到溶剂中的过程。 溶液应具备的条件是：对有效成分溶解度大、破坏性小，
化学法chemical method
通过各种化学试剂对细胞膜的作用，而使细 胞破碎的主法
所用化学试剂(chemical agents )：甲苯 (methylbenzene)、 丙酮 acetone、 丁醇 (butanol)、氯仿(chloroform)、吐温(Twain)
酶促破碎法Enzymic method
把蛋白质与杂蛋白、核酸、多糖分开 方法：盐析、等电点、有机溶剂 体积大的样品采用：超滤、凝胶过滤、冻真空干燥、
聚乙二醇
细分级分离(fine fractionation)
凝胶过滤、离子交换、吸附层析、亲和 层析
区带电泳、等电聚焦 结晶
依分离现象或仪器设备分类
沉淀分离技术precipitation separation
前处理(pre-processing) ：有些样品需冰冻(frozen)保 存 ; 有 些 样 品 需 去 掉 (abscise) 结 缔 组 织 (connective tissue);有些样品需去掉脂肪组织(fatty tissue)。 根据不同组织选择适当方法将组织或细胞破碎。
粗分级分离(Rough fractionation)
生化分离技术separation technique 生化检测技术detection technique
6章蛋白质的分离纯化和表征-教学用
等电聚焦 (IEF)
A stable pH gradient is Protein solution is added established in the gel after and electric field is application of an electric field. reapplied.
教学内容
一、蛋白质的酸碱性质 二、蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀 三、蛋白质分离纯化的一般原则 四、蛋白质的分离纯化方法 五、蛋白质相对分子质量的测定 六、蛋白质的含量测定与纯度鉴定
二、蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀
(一) 蛋白质胶体性质 (二) 蛋白质沉淀
(一)蛋白质胶体性质
分散相质点在胶体系统中保持稳定的3个条件:
几个要说明的问题
Vt: 柱床总体积，常称柱床体积； V0 ：为孔隙体积或外水体积，测出不 被凝胶滞留的蓝色葡聚糖-2000的洗脱 体积即为V0; Vi ：内水体积，凝胶珠内部的水相体积； Vm ：为凝胶基质体积； Vt=V0+Vi+Vm Ve某一待分离物质组分的洗脱体积,自 加样品开始到该组分的洗脱峰(峰顶)出 现时所流出的体积；
(七)亲和层析(affinity chromatography)
① 利用蛋白质分子对其配体(或称 为配基)分子特有的识别能力建 立起来的纯化方法. ② 将特异配体共价地连接到像琼脂 糖凝胶这类载体表面的官能团 (如-OH)上，配体和多糖载体之 间插人一段长度适当的连接臂 (如ε-氨基己酸)，使配体与凝胶 之间保持足够的距离，不致因载 体表面的位阻妨碍待分离的分子 与配体结合. ③ 这类载体在其他性能方面允许蛋 白质能自由通过.
分散相质点在1～l00 nm范围内, 在动力学上是稳定的, 介质分 子对这种质点碰撞的合力不等于零, 使它能在介质中作不断的 布朗运动; 分散相质点带有同种符号的净电荷,互相排斥,不易聚集成大颗 粒而沉淀; 分散相质点能与溶剂形成溶剂化层,例如与水形成水化层,质点 有了水化层,相互间不易靠拢而聚集.
蛋白质分离纯化和表征优秀课件
2)也与蛋白质分子形状、溶液的密度 和粘度有关。
超速离心法的二个用途 1、测定蛋白质的分子量； 2、分离纯化蛋白质。
超速离心基本原理
1、离心力(Fc)
离心作用是根据在一定角度速度下作 圆周运动的任何物体都受到一个向外的离 心力进行的。离心力的大小等于离心加速 度ω2X与颗粒质量m的乘积，即：
FC＝mω2X 其中ω是旋转角速度，以弧度／秒为 单位；X是颗粒离开旋转中心的距离，以 cm为单位：m是质量，以克为单位。
1、什么叫扩散？
如小心地把纯水放在蛋白质溶液的上面， 则蛋白质分子将从下面的高浓度区向上面的 低浓度区迁移，直至达到平衡为止。由于浓 度差引起的这种溶质分子的迁移称为扩散。 扩散是高浓度向低浓度方向进行的。
2、扩散系数
它在数值上等于当浓度为一个单位时，在 一秒钟内通过1厘米2面积而扩散的溶质量
3、影响扩散系数的因素
Sephadex
G-25
G-75
G-100
1000-5000
3000—80000 4000—150000
2、聚丙烯酰胺凝胶: (Bio-gel) Bio-Rad公司(美国)
Bio-gel
P-4
P-10
P-100-150000
3、琼脂糖凝胶：(Sepharose) pharmacia公司(瑞典)
利用渗透压的测定来计算蛋白质分子量时，是通过测 定几个不同浓度的渗透压，用范霍夫公式(略)求出蛋白质分 子量。
渗透压法测定蛋白质分子量的优缺点
优点： 所用的实验装置简单。
缺点： 要求被测蛋白质纯度要高，如果蛋白质样品中含有其他
杂质蛋白，那么由渗透压测得的结果实际上代表几种蛋白质 的平均分子量。
(三)蛋白质的扩散和扩散系数
超速离心法的二个用途 1、测定蛋白质的分子量； 2、分离纯化蛋白质。
超速离心基本原理
1、离心力(Fc)
离心作用是根据在一定角度速度下作 圆周运动的任何物体都受到一个向外的离 心力进行的。离心力的大小等于离心加速 度ω2X与颗粒质量m的乘积，即：
FC＝mω2X 其中ω是旋转角速度，以弧度／秒为 单位；X是颗粒离开旋转中心的距离，以 cm为单位：m是质量，以克为单位。
1、什么叫扩散？
如小心地把纯水放在蛋白质溶液的上面， 则蛋白质分子将从下面的高浓度区向上面的 低浓度区迁移，直至达到平衡为止。由于浓 度差引起的这种溶质分子的迁移称为扩散。 扩散是高浓度向低浓度方向进行的。
2、扩散系数
它在数值上等于当浓度为一个单位时，在 一秒钟内通过1厘米2面积而扩散的溶质量
3、影响扩散系数的因素
Sephadex
G-25
G-75
G-100
1000-5000
3000—80000 4000—150000
2、聚丙烯酰胺凝胶: (Bio-gel) Bio-Rad公司(美国)
Bio-gel
P-4
P-10
P-100-150000
3、琼脂糖凝胶：(Sepharose) pharmacia公司(瑞典)
利用渗透压的测定来计算蛋白质分子量时，是通过测 定几个不同浓度的渗透压，用范霍夫公式(略)求出蛋白质分 子量。
渗透压法测定蛋白质分子量的优缺点
优点： 所用的实验装置简单。
缺点： 要求被测蛋白质纯度要高，如果蛋白质样品中含有其他
杂质蛋白，那么由渗透压测得的结果实际上代表几种蛋白质 的平均分子量。
(三)蛋白质的扩散和扩散系数
蛋白质的分离纯化.ppt
logMr
三、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 法测定相对分子质量
聚丙烯酰胺凝胶电泳，（简称PAGE），也称 圆盘电泳，它以聚丙烯酰胺凝胶（单体丙烯 酰胺Arc和交联剂甲叉双丙烯酰胺Bis共聚而 成）为支持物 。
蛋白质颗粒在各种介质中电泳时，它的迁移率
决定于它所带的电荷以及分子大小和形状(电 荷效应、分子筛效应)。
v =沉降速度（dx/dt）
s
=
—ω—v2x——
ω=离心机转子角速度（弧度/s） x =蛋白质界面中点与转子中心的
距离（cm）
沉降系数的单位常用S，1S=1×10-13（s）
蛋白质分子量（M）与沉降系数（s）的关系
M = —D—（—1R－—TsV—ρ）—
R—气体常数（8.314×107ergs·mol -1 ·度-1） T—绝对温度 D—扩散常数（蛋白质分子量很大，离心机 转速很快，则忽略不计） V—蛋白质的微分比容（m3·g-1） ρ—溶剂密度（20℃，g·ml-1） s—沉降系数
二、凝胶过滤法测定相对分子质量
凝胶过滤原理
分子筛色谱 （凝胶过滤）
利用Andrews的实验经验式：
logMr = a/b—Ve/bVo
Ve（elution volume）为某一溶质组分的洗脱 体积。它是自加样品开始到该组分的洗脱峰 （峰顶）出现时所流出的体积。
V0 (outer volume)为外水体积，即存在于柱床 中凝胶珠外孔隙的水相体积。测定出不能被 凝胶滞留的大分子溶质如蓝色葡聚糖—2000 的洗脱体积可以决定V0。
在强烈沉淀条件下，不仅破坏了蛋白质 胶体溶液的稳定性，而且也破坏了蛋白 质的结构和性质，产生的蛋白质沉淀不 可能再重新溶解于水。
由于沉淀过程发生了蛋白质的结构和性 质的变化，所以又称为变性沉淀。
蛋白质化学蛋白质的分离纯化和表征标准版PPT
蛋白质的纯化是基于其结构和功能的研究需求，旨在获得高度纯化且具有生物活性的蛋白质。纯化过程中需考虑蛋白质的酸碱性质，特别是等电点，此时蛋白质溶解度最低，有利于沉淀分离。根据蛋白质的分子大小和形状，可采用渗透压法、沉降分析法、凝胶过滤法及SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法等方法测定其分子量，进而指导纯化策略。蛋白质的胶体性质使其在溶液中稳定分散，而通过破坏这一稳定性，如盐析法、有机溶剂沉淀法、重金Байду номын сангаас沉淀法等，可实现蛋白质的沉淀分离。纯化时还应结合结晶分析、溶解度分析和光吸收等手段，综合评估纯化效果。最终，通过一系列分离纯化步骤，获得满足研究需求的纯蛋白质。
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蛋白质溶液由于具有水化层与双电层两 方面的稳定因素，所以作为胶体系统是相 对稳定的。
蛋白质胶体性质的Βιβλιοθήκη 用由于胶体溶液中的蛋白质不能通过半透膜，因 此可以应用透析法将非蛋白的小分子杂质除去。 透析法：以半透膜提纯蛋白质的方法叫透析法 半透膜：只允许溶剂小分子通过，而溶质大分 子不能通过，如羊皮纸、火棉胶、玻璃纸等
第6章 蛋白质的分离纯化和表征
一、蛋白质的两性电离及等电点
蛋白质含有酸/碱AA残基具有两性 碱/酸越大——pI 越大
• pI通常在 6.0 左右
蛋白质的等电点：当溶液在某一定pH值时，使 某特定蛋白质分子上所带正负电荷相等，成为 两性离子，在电场中即不向阳极移动也不向阴 极移动，此时溶液的pH值即为该蛋白质的等电 点（pI）。在等电点时，蛋白质的溶解度最小， 在电场中不移动。
蛋白质混合样
凝凝胶法只适于球状蛋白分子测量
凝胶过滤.swf
三、蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀
（一）胶体性质（colloidal system）
由于蛋白质分子量很大，在水溶液中形成直 径1-100nm之间的颗粒，已达到胶体颗粒范围 的大小，因而具有胶体溶液的通性。
蛋白质的水溶液能形成稳定的亲水胶体的原因：
透析.swf
二.蛋白质的沉淀
蛋白质在溶液中的稳定性是有条件的、 相对的。如果加入适当的试剂使蛋白质分子 处于等电点状态或失去水化层（消除相同电 荷，除去水膜），蛋白质胶体溶液就不再稳 定并将产生沉淀。
• 蛋白质沉淀定义：
蛋白质在溶液中靠水膜和电荷保持其 稳定性，水膜和电荷一旦除去，蛋白 质溶液的稳定性就被破坏，蛋白质就 会从溶液中沉淀下来，此现象即为蛋 白质的沉淀作用。
（二）SDS－PAGE测定相对分子质量
蛋白质颗粒电泳时迁移率取决于： 所带电荷 分子量 分子形状
十二烷基磺酸钠
磺酸基 极性亲水 烷基 亲油（蛋白质疏水区）
？
原态蛋白质 巯基乙醇破坏二硫键
变性
迁移率与电荷和形状无关，仅取决于相对分子质量
Sds-page.swf
（三）凝胶过滤法测定相对分子质量
4.重金属盐沉淀(条件：pH 稍大于pI为宜)
当pH 稍大于pI时，蛋白质颗粒带负电荷这样就 容易与重金属离子结合成不溶性盐而沉淀。 重金属沉淀法的机理： 重金属盐加入之后，与带负电的羧基结合。 误服重金属盐的病人可口服大量牛乳或豆浆等蛋 白质进行解救。
5.生物碱试剂沉淀法（条件：pH稍小于pI）
在蛋白质的水溶液中，加入大量高浓度的强电解 质盐如硫酸铵、氯化钠、硫酸钠等，可破坏蛋质分 子表面的水化层，中和它们的电荷，因而使蛋白质 沉淀析出，这种现象称为盐析。
而低浓度的盐溶液加入蛋白质溶液中，会导致蛋 白质的溶解度增加，该现象称为盐溶。
盐析的机理： 同蛋破各白坏种质蛋蛋所白白需质质中的的性亲水盐水化浓性膜度及，也荷中有电和不性表同均面，有的只差净要别电调，荷节因。中此性不 盐 盐浓析度法，是就最可常使用混的合蛋蛋白白质质沉溶淀液方中法的，几该种方蛋法白不质会分使 蛋 散沉白淀质析产出生，变这性种。方法称为分段盐析。
2.弱酸或弱碱沉淀法(等电点沉淀）
用弱酸或弱碱调节蛋白质溶液的pH处于等电 点处，使蛋白质沉淀。
弱酸或弱碱沉淀法机理： 破坏蛋白质表面净电荷。
酸
碱
碱
酸
碱
酸
溶液中蛋白质的聚沉
3. 有机溶剂沉淀法：
在蛋白质溶液中，加入能与水互溶的有机溶 剂如乙醇、丙酮等，蛋白质产生沉淀。 有机溶剂沉淀法的机理：
破坏蛋白质的水化膜。 注意：有机溶液沉淀蛋白质通常在低温条件下 进行，否则有机溶剂与水互溶产生的溶解热会 使蛋白质产生变性。
（一）可逆沉淀
定义：在温和条件下，通过改变溶液的pH或电 荷状况，使蛋白质从胶体溶液中沉淀分离。
在沉淀过程中，结构和性质都没有发生变化， 在适当的条件下，可以重新溶解形成溶液，所 以这种沉淀又称为非变性沉淀。
可逆沉淀是分离和纯化蛋白质的基本方法， 如等电点沉淀法、盐析法和有机溶剂沉淀法等。
1. 盐析
１、蛋白质多肽链上含有许多极性基团。
如：－NH3＋、－COO－ 、－OH、-SH、CONH-等，它们都具有高度的亲水性，当与水 接确时，极易吸附水分子，使蛋白质颗粒外围形 成一层水化膜，将颗粒彼此隔开，不致因互相碰 撞凝聚而沉淀。
2、蛋白质是两性电解质，在非等电状态时， 相同蛋白质颗粒带有同性电荷，与周围的 反离子构成稳定的双电层。使蛋白质颗粒 之间相互排斥，保持一定距离，不致互相 凝聚而沉淀。
根据蛋白质净电荷的差异来分离蛋白质的一 种方法是电泳法。
电泳
二、蛋白质分子的大小
蛋白质的分子量
一般在一万至一百万道尔顿之间 1道尔顿＝1×C12绝对质量/12
≈1.66×10-27千克
（一）根据化学组成测定最小分子量
1、测定蛋白质中某一微量元素的含量 2、假设蛋白质中仅含一个铁原子
最低相对分子质量= 100* 55.8/铁的百分含量
生物碱是植物组织中具有显著生理作用的一类 含氮的碱性物质。（小檗碱、麻黄碱 、吗啡）
能够沉淀生物碱的试剂称为生物碱试剂。生物碱 试剂一般为弱酸性物质，如单宁酸、苦味酸、三氯 乙酸等。
生物碱试剂沉淀蛋白质的机理： 在酸性条件下，蛋白质带正电，可以与生物碱试 剂的酸根离子结合而产生沉淀。 例如：“柿石症”
（二）不可逆沉淀
定义：在强烈沉淀条件下，不仅破坏了蛋白质胶 体溶液的稳定性，而且也破坏了蛋白质的结构和 性质，产生的蛋白质沉淀不可能再重新溶解于水。
由于沉淀过程发生了蛋白质的结构和性质的变 化，所以又称为变性沉淀。
如加热沉淀（次级键）、强酸碱沉淀（影响电 荷）、重金属盐沉淀（Hg2+、 Pb2+ 、Cu2+、 Ag2+）和生物碱试剂或某些酸类沉淀等都属于不 可逆沉淀。
蛋白质电泳： 在外液pH低于等电点的溶液中，蛋白质粒子
带 正电荷，在电场中向负极移动；在外液pH高
于 等电点的溶液中，蛋白质粒子带负电荷，在电 场中向正极移动。这种现象称为蛋白质电泳— 带电粒子在电场中移动的现象。
蛋白质在等电点pH条件下，不发生电泳现 象
利用蛋白质的电泳现象，可以将不同带电性 质和不同大小、形状的蛋白质分子进行分离 纯化。
蛋白质胶体性质的Βιβλιοθήκη 用由于胶体溶液中的蛋白质不能通过半透膜，因 此可以应用透析法将非蛋白的小分子杂质除去。 透析法：以半透膜提纯蛋白质的方法叫透析法 半透膜：只允许溶剂小分子通过，而溶质大分 子不能通过，如羊皮纸、火棉胶、玻璃纸等
第6章 蛋白质的分离纯化和表征
一、蛋白质的两性电离及等电点
蛋白质含有酸/碱AA残基具有两性 碱/酸越大——pI 越大
• pI通常在 6.0 左右
蛋白质的等电点：当溶液在某一定pH值时，使 某特定蛋白质分子上所带正负电荷相等，成为 两性离子，在电场中即不向阳极移动也不向阴 极移动，此时溶液的pH值即为该蛋白质的等电 点（pI）。在等电点时，蛋白质的溶解度最小， 在电场中不移动。
蛋白质混合样
凝凝胶法只适于球状蛋白分子测量
凝胶过滤.swf
三、蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀
（一）胶体性质（colloidal system）
由于蛋白质分子量很大，在水溶液中形成直 径1-100nm之间的颗粒，已达到胶体颗粒范围 的大小，因而具有胶体溶液的通性。
蛋白质的水溶液能形成稳定的亲水胶体的原因：
透析.swf
二.蛋白质的沉淀
蛋白质在溶液中的稳定性是有条件的、 相对的。如果加入适当的试剂使蛋白质分子 处于等电点状态或失去水化层（消除相同电 荷，除去水膜），蛋白质胶体溶液就不再稳 定并将产生沉淀。
• 蛋白质沉淀定义：
蛋白质在溶液中靠水膜和电荷保持其 稳定性，水膜和电荷一旦除去，蛋白 质溶液的稳定性就被破坏，蛋白质就 会从溶液中沉淀下来，此现象即为蛋 白质的沉淀作用。
（二）SDS－PAGE测定相对分子质量
蛋白质颗粒电泳时迁移率取决于： 所带电荷 分子量 分子形状
十二烷基磺酸钠
磺酸基 极性亲水 烷基 亲油（蛋白质疏水区）
？
原态蛋白质 巯基乙醇破坏二硫键
变性
迁移率与电荷和形状无关，仅取决于相对分子质量
Sds-page.swf
（三）凝胶过滤法测定相对分子质量
4.重金属盐沉淀(条件：pH 稍大于pI为宜)
当pH 稍大于pI时，蛋白质颗粒带负电荷这样就 容易与重金属离子结合成不溶性盐而沉淀。 重金属沉淀法的机理： 重金属盐加入之后，与带负电的羧基结合。 误服重金属盐的病人可口服大量牛乳或豆浆等蛋 白质进行解救。
5.生物碱试剂沉淀法（条件：pH稍小于pI）
在蛋白质的水溶液中，加入大量高浓度的强电解 质盐如硫酸铵、氯化钠、硫酸钠等，可破坏蛋质分 子表面的水化层，中和它们的电荷，因而使蛋白质 沉淀析出，这种现象称为盐析。
而低浓度的盐溶液加入蛋白质溶液中，会导致蛋 白质的溶解度增加，该现象称为盐溶。
盐析的机理： 同蛋破各白坏种质蛋蛋所白白需质质中的的性亲水盐水化浓性膜度及，也荷中有电和不性表同均面，有的只差净要别电调，荷节因。中此性不 盐 盐浓析度法，是就最可常使用混的合蛋蛋白白质质沉溶淀液方中法的，几该种方蛋法白不质会分使 蛋 散沉白淀质析产出生，变这性种。方法称为分段盐析。
2.弱酸或弱碱沉淀法(等电点沉淀）
用弱酸或弱碱调节蛋白质溶液的pH处于等电 点处，使蛋白质沉淀。
弱酸或弱碱沉淀法机理： 破坏蛋白质表面净电荷。
酸
碱
碱
酸
碱
酸
溶液中蛋白质的聚沉
3. 有机溶剂沉淀法：
在蛋白质溶液中，加入能与水互溶的有机溶 剂如乙醇、丙酮等，蛋白质产生沉淀。 有机溶剂沉淀法的机理：
破坏蛋白质的水化膜。 注意：有机溶液沉淀蛋白质通常在低温条件下 进行，否则有机溶剂与水互溶产生的溶解热会 使蛋白质产生变性。
（一）可逆沉淀
定义：在温和条件下，通过改变溶液的pH或电 荷状况，使蛋白质从胶体溶液中沉淀分离。
在沉淀过程中，结构和性质都没有发生变化， 在适当的条件下，可以重新溶解形成溶液，所 以这种沉淀又称为非变性沉淀。
可逆沉淀是分离和纯化蛋白质的基本方法， 如等电点沉淀法、盐析法和有机溶剂沉淀法等。
1. 盐析
１、蛋白质多肽链上含有许多极性基团。
如：－NH3＋、－COO－ 、－OH、-SH、CONH-等，它们都具有高度的亲水性，当与水 接确时，极易吸附水分子，使蛋白质颗粒外围形 成一层水化膜，将颗粒彼此隔开，不致因互相碰 撞凝聚而沉淀。
2、蛋白质是两性电解质，在非等电状态时， 相同蛋白质颗粒带有同性电荷，与周围的 反离子构成稳定的双电层。使蛋白质颗粒 之间相互排斥，保持一定距离，不致互相 凝聚而沉淀。
根据蛋白质净电荷的差异来分离蛋白质的一 种方法是电泳法。
电泳
二、蛋白质分子的大小
蛋白质的分子量
一般在一万至一百万道尔顿之间 1道尔顿＝1×C12绝对质量/12
≈1.66×10-27千克
（一）根据化学组成测定最小分子量
1、测定蛋白质中某一微量元素的含量 2、假设蛋白质中仅含一个铁原子
最低相对分子质量= 100* 55.8/铁的百分含量
生物碱是植物组织中具有显著生理作用的一类 含氮的碱性物质。（小檗碱、麻黄碱 、吗啡）
能够沉淀生物碱的试剂称为生物碱试剂。生物碱 试剂一般为弱酸性物质，如单宁酸、苦味酸、三氯 乙酸等。
生物碱试剂沉淀蛋白质的机理： 在酸性条件下，蛋白质带正电，可以与生物碱试 剂的酸根离子结合而产生沉淀。 例如：“柿石症”
（二）不可逆沉淀
定义：在强烈沉淀条件下，不仅破坏了蛋白质胶 体溶液的稳定性，而且也破坏了蛋白质的结构和 性质，产生的蛋白质沉淀不可能再重新溶解于水。
由于沉淀过程发生了蛋白质的结构和性质的变 化，所以又称为变性沉淀。
如加热沉淀（次级键）、强酸碱沉淀（影响电 荷）、重金属盐沉淀（Hg2+、 Pb2+ 、Cu2+、 Ag2+）和生物碱试剂或某些酸类沉淀等都属于不 可逆沉淀。
蛋白质电泳： 在外液pH低于等电点的溶液中，蛋白质粒子
带 正电荷，在电场中向负极移动；在外液pH高
于 等电点的溶液中，蛋白质粒子带负电荷，在电 场中向正极移动。这种现象称为蛋白质电泳— 带电粒子在电场中移动的现象。
蛋白质在等电点pH条件下，不发生电泳现 象
利用蛋白质的电泳现象，可以将不同带电性 质和不同大小、形状的蛋白质分子进行分离 纯化。