第6章 蛋白质的分离、纯化和表征
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蛋白质溶液由于具有水化层与双电层两 方面的稳定因素，所以作为胶体系统是相 对稳定的。
蛋白质胶体性质的Βιβλιοθήκη 用由于胶体溶液中的蛋白质不能通过半透膜，因 此可以应用透析法将非蛋白的小分子杂质除去。 透析法：以半透膜提纯蛋白质的方法叫透析法 半透膜：只允许溶剂小分子通过，而溶质大分 子不能通过，如羊皮纸、火棉胶、玻璃纸等
第6章 蛋白质的分离纯化和表征
一、蛋白质的两性电离及等电点
蛋白质含有酸/碱AA残基具有两性 碱/酸越大——pI 越大
• pI通常在 6.0 左右
蛋白质的等电点：当溶液在某一定pH值时，使 某特定蛋白质分子上所带正负电荷相等，成为 两性离子，在电场中即不向阳极移动也不向阴 极移动，此时溶液的pH值即为该蛋白质的等电 点（pI）。在等电点时，蛋白质的溶解度最小， 在电场中不移动。
蛋白质混合样
凝凝胶法只适于球状蛋白分子测量
凝胶过滤.swf
三、蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀
（一）胶体性质（colloidal system）
由于蛋白质分子量很大，在水溶液中形成直 径1-100nm之间的颗粒，已达到胶体颗粒范围 的大小，因而具有胶体溶液的通性。
蛋白质的水溶液能形成稳定的亲水胶体的原因：
透析.swf
二.蛋白质的沉淀
蛋白质在溶液中的稳定性是有条件的、 相对的。如果加入适当的试剂使蛋白质分子 处于等电点状态或失去水化层（消除相同电 荷，除去水膜），蛋白质胶体溶液就不再稳 定并将产生沉淀。
• 蛋白质沉淀定义：
蛋白质在溶液中靠水膜和电荷保持其 稳定性，水膜和电荷一旦除去，蛋白 质溶液的稳定性就被破坏，蛋白质就 会从溶液中沉淀下来，此现象即为蛋 白质的沉淀作用。
（二）SDS－PAGE测定相对分子质量
蛋白质颗粒电泳时迁移率取决于： 所带电荷 分子量 分子形状
十二烷基磺酸钠
磺酸基 极性亲水 烷基 亲油（蛋白质疏水区）
？
原态蛋白质 巯基乙醇破坏二硫键
变性
迁移率与电荷和形状无关，仅取决于相对分子质量
Sds-page.swf
（三）凝胶过滤法测定相对分子质量
4.重金属盐沉淀(条件：pH 稍大于pI为宜)
当pH 稍大于pI时，蛋白质颗粒带负电荷这样就 容易与重金属离子结合成不溶性盐而沉淀。 重金属沉淀法的机理： 重金属盐加入之后，与带负电的羧基结合。 误服重金属盐的病人可口服大量牛乳或豆浆等蛋 白质进行解救。
5.生物碱试剂沉淀法（条件：pH稍小于pI）
在蛋白质的水溶液中，加入大量高浓度的强电解 质盐如硫酸铵、氯化钠、硫酸钠等，可破坏蛋质分 子表面的水化层，中和它们的电荷，因而使蛋白质 沉淀析出，这种现象称为盐析。
而低浓度的盐溶液加入蛋白质溶液中，会导致蛋 白质的溶解度增加，该现象称为盐溶。
盐析的机理： 同蛋破各白坏种质蛋蛋所白白需质质中的的性亲水盐水化浓性膜度及，也荷中有电和不性表同均面，有的只差净要别电调，荷节因。中此性不 盐 盐浓析度法，是就最可常使用混的合蛋蛋白白质质沉溶淀液方中法的，几该种方蛋法白不质会分使 蛋 散沉白淀质析产出生，变这性种。方法称为分段盐析。
2.弱酸或弱碱沉淀法(等电点沉淀）
用弱酸或弱碱调节蛋白质溶液的pH处于等电 点处，使蛋白质沉淀。
弱酸或弱碱沉淀法机理： 破坏蛋白质表面净电荷。
酸
碱
碱
酸
碱
酸
溶液中蛋白质的聚沉
3. 有机溶剂沉淀法：
在蛋白质溶液中，加入能与水互溶的有机溶 剂如乙醇、丙酮等，蛋白质产生沉淀。 有机溶剂沉淀法的机理：
破坏蛋白质的水化膜。 注意：有机溶液沉淀蛋白质通常在低温条件下 进行，否则有机溶剂与水互溶产生的溶解热会 使蛋白质产生变性。
（一）可逆沉淀
定义：在温和条件下，通过改变溶液的pH或电 荷状况，使蛋白质从胶体溶液中沉淀分离。
在沉淀过程中，结构和性质都没有发生变化， 在适当的条件下，可以重新溶解形成溶液，所 以这种沉淀又称为非变性沉淀。
可逆沉淀是分离和纯化蛋白质的基本方法， 如等电点沉淀法、盐析法和有机溶剂沉淀法等。
1. 盐析
１、蛋白质多肽链上含有许多极性基团。
如：－NH3＋、－COO－ 、－OH、-SH、CONH-等，它们都具有高度的亲水性，当与水 接确时，极易吸附水分子，使蛋白质颗粒外围形 成一层水化膜，将颗粒彼此隔开，不致因互相碰 撞凝聚而沉淀。
2、蛋白质是两性电解质，在非等电状态时， 相同蛋白质颗粒带有同性电荷，与周围的 反离子构成稳定的双电层。使蛋白质颗粒 之间相互排斥，保持一定距离，不致互相 凝聚而沉淀。
根据蛋白质净电荷的差异来分离蛋白质的一 种方法是电泳法。
电泳
二、蛋白质分子的大小
蛋白质的分子量
一般在一万至一百万道尔顿之间 1道尔顿＝1×C12绝对质量/12
≈1.66×10-27千克
（一）根据化学组成测定最小分子量
1、测定蛋白质中某一微量元素的含量 2、假设蛋白质中仅含一个铁原子
最低相对分子质量= 100* 55.8/铁的百分含量
生物碱是植物组织中具有显著生理作用的一类 含氮的碱性物质。（小檗碱、麻黄碱 、吗啡）
能够沉淀生物碱的试剂称为生物碱试剂。生物碱 试剂一般为弱酸性物质，如单宁酸、苦味酸、三氯 乙酸等。
生物碱试剂沉淀蛋白质的机理： 在酸性条件下，蛋白质带正电，可以与生物碱试 剂的酸根离子结合而产生沉淀。 例如：“柿石症”
（二）不可逆沉淀
定义：在强烈沉淀条件下，不仅破坏了蛋白质胶 体溶液的稳定性，而且也破坏了蛋白质的结构和 性质，产生的蛋白质沉淀不可能再重新溶解于水。
由于沉淀过程发生了蛋白质的结构和性质的变 化，所以又称为变性沉淀。
如加热沉淀（次级键）、强酸碱沉淀（影响电 荷）、重金属盐沉淀（Hg2+、 Pb2+ 、Cu2+、 Ag2+）和生物碱试剂或某些酸类沉淀等都属于不 可逆沉淀。
蛋白质电泳： 在外液pH低于等电点的溶液中，蛋白质粒子
带 正电荷，在电场中向负极移动；在外液pH高
于 等电点的溶液中，蛋白质粒子带负电荷，在电 场中向正极移动。这种现象称为蛋白质电泳— 带电粒子在电场中移动的现象。
蛋白质在等电点pH条件下，不发生电泳现 象
利用蛋白质的电泳现象，可以将不同带电性 质和不同大小、形状的蛋白质分子进行分离 纯化。
蛋白质胶体性质的Βιβλιοθήκη 用由于胶体溶液中的蛋白质不能通过半透膜，因 此可以应用透析法将非蛋白的小分子杂质除去。 透析法：以半透膜提纯蛋白质的方法叫透析法 半透膜：只允许溶剂小分子通过，而溶质大分 子不能通过，如羊皮纸、火棉胶、玻璃纸等
第6章 蛋白质的分离纯化和表征
一、蛋白质的两性电离及等电点
蛋白质含有酸/碱AA残基具有两性 碱/酸越大——pI 越大
• pI通常在 6.0 左右
蛋白质的等电点：当溶液在某一定pH值时，使 某特定蛋白质分子上所带正负电荷相等，成为 两性离子，在电场中即不向阳极移动也不向阴 极移动，此时溶液的pH值即为该蛋白质的等电 点（pI）。在等电点时，蛋白质的溶解度最小， 在电场中不移动。
蛋白质混合样
凝凝胶法只适于球状蛋白分子测量
凝胶过滤.swf
三、蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀
（一）胶体性质（colloidal system）
由于蛋白质分子量很大，在水溶液中形成直 径1-100nm之间的颗粒，已达到胶体颗粒范围 的大小，因而具有胶体溶液的通性。
蛋白质的水溶液能形成稳定的亲水胶体的原因：
透析.swf
二.蛋白质的沉淀
蛋白质在溶液中的稳定性是有条件的、 相对的。如果加入适当的试剂使蛋白质分子 处于等电点状态或失去水化层（消除相同电 荷，除去水膜），蛋白质胶体溶液就不再稳 定并将产生沉淀。
• 蛋白质沉淀定义：
蛋白质在溶液中靠水膜和电荷保持其 稳定性，水膜和电荷一旦除去，蛋白 质溶液的稳定性就被破坏，蛋白质就 会从溶液中沉淀下来，此现象即为蛋 白质的沉淀作用。
（二）SDS－PAGE测定相对分子质量
蛋白质颗粒电泳时迁移率取决于： 所带电荷 分子量 分子形状
十二烷基磺酸钠
磺酸基 极性亲水 烷基 亲油（蛋白质疏水区）
？
原态蛋白质 巯基乙醇破坏二硫键
变性
迁移率与电荷和形状无关，仅取决于相对分子质量
Sds-page.swf
（三）凝胶过滤法测定相对分子质量
4.重金属盐沉淀(条件：pH 稍大于pI为宜)
当pH 稍大于pI时，蛋白质颗粒带负电荷这样就 容易与重金属离子结合成不溶性盐而沉淀。 重金属沉淀法的机理： 重金属盐加入之后，与带负电的羧基结合。 误服重金属盐的病人可口服大量牛乳或豆浆等蛋 白质进行解救。
5.生物碱试剂沉淀法（条件：pH稍小于pI）
在蛋白质的水溶液中，加入大量高浓度的强电解 质盐如硫酸铵、氯化钠、硫酸钠等，可破坏蛋质分 子表面的水化层，中和它们的电荷，因而使蛋白质 沉淀析出，这种现象称为盐析。
而低浓度的盐溶液加入蛋白质溶液中，会导致蛋 白质的溶解度增加，该现象称为盐溶。
盐析的机理： 同蛋破各白坏种质蛋蛋所白白需质质中的的性亲水盐水化浓性膜度及，也荷中有电和不性表同均面，有的只差净要别电调，荷节因。中此性不 盐 盐浓析度法，是就最可常使用混的合蛋蛋白白质质沉溶淀液方中法的，几该种方蛋法白不质会分使 蛋 散沉白淀质析产出生，变这性种。方法称为分段盐析。
2.弱酸或弱碱沉淀法(等电点沉淀）
用弱酸或弱碱调节蛋白质溶液的pH处于等电 点处，使蛋白质沉淀。
弱酸或弱碱沉淀法机理： 破坏蛋白质表面净电荷。
酸
碱
碱
酸
碱
酸
溶液中蛋白质的聚沉
3. 有机溶剂沉淀法：
在蛋白质溶液中，加入能与水互溶的有机溶 剂如乙醇、丙酮等，蛋白质产生沉淀。 有机溶剂沉淀法的机理：
破坏蛋白质的水化膜。 注意：有机溶液沉淀蛋白质通常在低温条件下 进行，否则有机溶剂与水互溶产生的溶解热会 使蛋白质产生变性。
（一）可逆沉淀
定义：在温和条件下，通过改变溶液的pH或电 荷状况，使蛋白质从胶体溶液中沉淀分离。
在沉淀过程中，结构和性质都没有发生变化， 在适当的条件下，可以重新溶解形成溶液，所 以这种沉淀又称为非变性沉淀。
可逆沉淀是分离和纯化蛋白质的基本方法， 如等电点沉淀法、盐析法和有机溶剂沉淀法等。
1. 盐析
１、蛋白质多肽链上含有许多极性基团。
如：－NH3＋、－COO－ 、－OH、-SH、CONH-等，它们都具有高度的亲水性，当与水 接确时，极易吸附水分子，使蛋白质颗粒外围形 成一层水化膜，将颗粒彼此隔开，不致因互相碰 撞凝聚而沉淀。
2、蛋白质是两性电解质，在非等电状态时， 相同蛋白质颗粒带有同性电荷，与周围的 反离子构成稳定的双电层。使蛋白质颗粒 之间相互排斥，保持一定距离，不致互相 凝聚而沉淀。
根据蛋白质净电荷的差异来分离蛋白质的一 种方法是电泳法。
电泳
二、蛋白质分子的大小
蛋白质的分子量
一般在一万至一百万道尔顿之间 1道尔顿＝1×C12绝对质量/12
≈1.66×10-27千克
（一）根据化学组成测定最小分子量
1、测定蛋白质中某一微量元素的含量 2、假设蛋白质中仅含一个铁原子
最低相对分子质量= 100* 55.8/铁的百分含量
生物碱是植物组织中具有显著生理作用的一类 含氮的碱性物质。（小檗碱、麻黄碱 、吗啡）
能够沉淀生物碱的试剂称为生物碱试剂。生物碱 试剂一般为弱酸性物质，如单宁酸、苦味酸、三氯 乙酸等。
生物碱试剂沉淀蛋白质的机理： 在酸性条件下，蛋白质带正电，可以与生物碱试 剂的酸根离子结合而产生沉淀。 例如：“柿石症”
（二）不可逆沉淀
定义：在强烈沉淀条件下，不仅破坏了蛋白质胶 体溶液的稳定性，而且也破坏了蛋白质的结构和 性质，产生的蛋白质沉淀不可能再重新溶解于水。
由于沉淀过程发生了蛋白质的结构和性质的变 化，所以又称为变性沉淀。
如加热沉淀（次级键）、强酸碱沉淀（影响电 荷）、重金属盐沉淀（Hg2+、 Pb2+ 、Cu2+、 Ag2+）和生物碱试剂或某些酸类沉淀等都属于不 可逆沉淀。
蛋白质电泳： 在外液pH低于等电点的溶液中，蛋白质粒子
带 正电荷，在电场中向负极移动；在外液pH高
于 等电点的溶液中，蛋白质粒子带负电荷，在电 场中向正极移动。这种现象称为蛋白质电泳— 带电粒子在电场中移动的现象。
蛋白质在等电点pH条件下，不发生电泳现 象
利用蛋白质的电泳现象，可以将不同带电性 质和不同大小、形状的蛋白质分子进行分离 纯化。